琥珀酸木糖发酵的研究范文

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《生物技术杂志》2014年第二期

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验材料野生型大肠杆菌(E.coli)MG1655、K－12、W3110、C－1、2507、5365、W1485由作者实验室保存;大肠杆菌MLB(MG1655△ldhA、△pflB)与CLB(C－1△ldhA、△pflB)由本研究构建。质粒pKD4、pKD46、pCP20为作者实验室保存。

1.1.2试剂胶回收试剂盒、DN段纯化试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒、Taq酶由上海生工生物工程技术服务有限公司提供;DNAmarker、dNTP、λ－EcoT14Marker、DL2000DNAMark-er、PCRbuffer、DpNⅠ由Takara公司提供。NH4Cl(Ammoniumchloride)、KH2PO4(Potassiumdihydro-genphosphate)、CaCl2(Calciumchlorideanhydrous)、NaOH、H2SO4、Tris－HCl、NaCl(Sodiumchloride)，分析纯AR，上海凌峰化学试剂有限公司;MgSO4•H2O(Magnesiumsulfate)，分析纯AR，上海美兴化工有限公司;琼脂粉(Agar－agarpower)，生化试剂BR，国药集团化学试剂有限公司;Tryptone、YeastEx-tract，OxoidLTD;氨苄青霉素(AmpicilinSodiumSalt)、卡那霉素(KanamycinSulfate)，分析纯AR，Genebase。

1.1.3仪器设备分析天平，上海奥豪斯公司;不锈钢手提式灭菌锅DSX－280B，上海申安医疗器械厂;DHG－9140A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司;恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂;Eppendorf高速冷冻离心机，德国艾本德股份公司;精密数显酸度计，上海天达仪器有限公司;SW－CJ－1FD单人单面洁净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司;BIOERPCR仪，杭州博日科技有限公司;DY－A电泳仪，上海西巴斯生物技术开发有限公司;琼脂糖水平电泳槽YR－158，上海伊瑞生物科技仪器有限公司;高速离心机，ThermoSCIENTIFIC;高压蒸汽灭菌器，TOMYSX－700;恒温摇床，江苏太仓市实验设备厂;酸度计，上海天达仪器有限公司;ZC－10智能型恒温水槽，宁波天恒仪器厂;液相色谱仪，日本岛津公司。1.1.4培养基①LB培养基(/L):胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。②固体LB培养基:LB培养基中加入15g/L琼脂粉。③种子培养基(/L):木糖5g，Na2HPO4•12H2O15.12g，KH2PO43g，NaCl0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，CaCl20.011g，氯化铵1g，1%维生素B10.2mL以及微量元素(TE)混合液0.2mL。④摇瓶发酵培养基(/L):木糖15g，NaHCO315g，Na2HPO4•12H2O15.12g，KH2PO43g，NaCl0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，CaCl20.011g，1%维生素B10.2mL以及微量元素(TE)混合液0.2mL。⑤抗生素母液的配制:用分析天平分别称取0.5000g卡那霉素、0.5000g氨苄青霉素，分别溶于10ml超纯水，洁净工作台下用微孔过滤膜(0.22μm)过滤除菌，－20℃冰箱保存备用。使用时，培养基中氨苄青霉素的终浓度为100μg/ml，卡那霉素的终浓度为50μg/ml。

1.2方法

1.2.1野生型大肠杆菌摇瓶发酵①摇瓶发酵:采用两阶段法发酵，即先好养阶段培养，主要用于收集菌体，然后转入厌氧，开始发酵生产产物。实验方法:将1mL冷冻甘油管保存的菌液接入到已灭菌的装有30mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃、220r/min培养9h;取LB中活化的种子培养液2mL转接于装有100mL二级种子培养基中的500mL摇瓶中，于37℃、220r/min培养约10h，此时好养阶段结束;然后8000r/min、4℃离心5min，收集菌体并重悬于100ml发酵培养基中，培养基分装在两个50ml蓝口瓶中，装液量为40ml，蓝口瓶上方用CO2气袋通过灭菌的空气过滤器通气约30s，180r/min、37℃下厌氧发酵10h。②发酵产物的检测:取1ml发酵液，离心后，过滤上清液用于HPLC测定。进样量60μl，色谱柱Bio－RadAminexHPX－87H，柱温为65℃，流动相为5mmol/L的稀硫酸，流速设定为0.6ml/min。

1.2.2利用Red重组法构建大肠杆菌MLB与CLB实验步骤:引物设计→PCR、电泳、回收→酶切→电泳、再回收→制备感受态转入质粒pKD46→回收片段与感受态混合电转→涂卡那霉素平板→挑取菌落鉴定→pKD46质粒丢失→制备感受态转入质粒pCP20→抗性片段的消除、鉴定。实验中所有引物由软件PrimerPremier5设计，由上海生工有限公司合成。基因敲除所用的引物见表1，5’端50bp碱基序列为靶基因两侧的同源臂，表中斜体部分，电击时，PCR扩增出的线性片段与靶基因的同源区域能够发生同源重组置换，达到敲除目的，用鉴定引物进行PCR验证，并进一步测序确认。然后导入质粒pcP20消除抗生素片段的抗性，从而敲除ldhA基因，构建菌株ML。以ML为出发菌株，重复上述方法敲除pflB，从而构建MLB。CLB菌株的构建方法类似。

1.2.3两阶段摇瓶发酵实验方法同1.2.1发酵产物的检测:检测方法见1.2.1。

2结果与分析

2.1野生菌摇瓶发酵本研究首先对不同野生型大肠杆菌的木糖利用和产酸情况进行了比较，结果见表2。在以木糖为碳源两阶段摇瓶发酵中，不同的菌株表现出了显著的差异，这几组数据统计学结果显示其p值为0.0045＜0.01，表明其统计学上差异极其明显。从表2中可以看出在这些野生型菌株中，琥珀酸产量和得率最高的是大肠杆菌B系的5365菌株，其产量为6.41g/L，得率为0.53g/g，其次是C－1菌株，产量为5.58g/L，得率为0.47g/g，而产量最低的是W3110，其产量只有4.23g/L，而得率仅有0.34g/g。同时，可以看出野生菌株的副产物占了较大比例，其中乳酸的积累是最多的。乳酸的形成对琥珀酸影响最大，一方面是碳源的分流，更重要的是乳酸途径会竞争NADH，而降低琥珀酸的产量。乙酸的积累虽然较乳酸相对少些，但仍然对碳源分流造成了较大影响。

2.2副产物途径敲除根据野生菌株的实验结果，选择W1485、MG1655、C－1三株菌进行副产物途径敲除的探索，其琥珀酸的产量高低顺序都为C－1﹥MG1655﹥W1485，C－1菌株的副产物相对较少，琥珀酸得率较W1485高出了17.5%。副产物途径敲出的构建，主要是进行乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)的敲除。其中NZN111是W1485的双缺失菌株，而MLB和CLB分别在本研究中由MG1655和C－1构建的双缺失菌株。图1和2是双缺失菌株构建完成后，进行PCR证的结果。鉴定引物分别以阳性克隆、野生型为模板，阳性克隆中ldhA基因已被卡那霉素片段替换，ldhA基因大小为990bp，pflB基因大小为2183bp，卡那霉素片段大小为1438bp，从图1可以看出对照组扩增出片段大小与ldhA大小接近，阳性克隆大小与卡那霉素片段接近，从图2可以看出对照组扩增出片段大小与pflB大小接近，阳性克隆大小与卡那霉素片段接近，初步鉴定基因敲除成功，进一步测序结果显示，基因敲除成功。

2.3NZN111、MLB、CLB的摇瓶发酵大肠杆菌双基因缺失菌株NZN111、MLB、CLB菌株的摇瓶发酵木糖结果如表3。从表3可以看出，菌株的ldhA和pflB双缺失后，对于提高菌株的产酸得率非常有效，MLB与NZN111基于木糖产琥珀酸的得率基本一致，分别为0.89g/g与0.90g/g，而CLB略高为0.92g/g，三个菌株的产物和副产物的产量比较接近。与野生型菌株比较，木糖的消耗没有减少，统计学结果显示这三组数据p值为0.145＞0.05，表明这三株双缺失菌株产琥珀酸显著性差异不明显，与野生型菌株相比，双缺失后菌株之间的产琥珀酸能力的差异缩小。但与野生型菌株相比琥珀酸的产量和得率都有显著提高，将表3中MLB、CLB菌株与表2中MG1655、C－1菌株琥珀酸产量进行统计学分析可得其p值分别为0.00069＜0.001、0.00044＜0.001，这表明双缺失菌株与其对应的野生菌产琥珀酸的量在统计学上的差异极其显著。MG1655菌株琥珀酸对木糖得率为0.40±0.01g/g，敲除基因ldhA与pflB后，得率提高到0.89±0.02g/g;而C－1菌株琥珀酸对木糖得率为0.47±0.01g/g，敲除基因ldhA与pflB后，得率提高到0.90±0.02g/g。CLB菌株的乙酸生成变化不大，而MLB和NZN111的乙酸生成明显减少，而乳酸基本检测不到，因此乳酸脱氢酶的敲除对副产物乳酸的合成能够有效的控制，并且考虑到乳酸合成途径中NADH的需求，该途径的活性确实造成了琥珀酸NADH途径流量的竞争。丙酮酸甲酸裂解酶能够催化丙酮酸裂解为甲酸，甲酸在甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase)催化下进一步生成H2和CO2，该支路也为琥珀酸合成的竞争途径，pflB基因的缺失可以减少副产物的比例，提高目的产物的产量和得率。特别是乳酸途径、乙醇途径和琥珀酸途径竞争NADH，因此pflB与ldhA的敲除能显著减少木糖代谢途径中的副产物的产量，有利于琥珀酸的高产。

3讨论

本研究通过比较野生型大肠杆菌利用木糖两阶段发酵生产琥珀酸，发现产琥珀酸得率最高的是大肠杆菌B系的5365菌株，其产量为6.41g/L，得率为0.53g/g，其次是C－1菌株，产量为5.58g/L，得率为0.47g/g，而产量最低的是W3110，其产量只有4.23g/L，得率仅有0.34g/g，为选取优良野生菌发酵木糖产琥珀酸提供了一定的依据。并利用Red重组法敲除野生菌的ldhA与pflB，构建了两株双基因缺失型菌株，发酵结果表明琥珀酸对木糖的得率显著提高，达到0.90g/g，与王健等人研究结论相比，得率提高了50%。目前，以木糖为碳源发酵产琥珀酸的研究不多，特别是厌氧发酵的研究较少，当前热点主要集中在利用葡萄糖发酵产琥珀酸。然而，木糖是木质纤维素水解液的重要组分，是除葡萄糖以外第二丰富的单糖，利用木糖产琥珀酸同样具有广阔的前景。本研究结果表明利用木糖为碳源发酵产琥珀酸虽然得率较高(达到0.92g/g)，然而产量仍然较低，如何在发酵罐中通过发酵优化来提高琥珀酸的产量也是下一步研究中亟待解决的问题。

作者：唐绪位李运杰李志敏叶勤单位：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室