低温氨氮降解菌的筛选范文

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《生物技术杂志》2014年第二期

1方法

1.1菌株富集培养取100mL松花江水放入无菌的500mL三角瓶中，8℃、160r/min震荡培养3～5d直至培养液浑浊，4℃保存备用。

1.2氨氮降解菌筛选取1mL富集培养液加入含100mL异氧硝化细菌培养基的三角瓶中，8℃、160r/min震荡培养2d，倍比稀释后，取103稀释液100mL涂布在异氧硝化细菌固体平板上，8℃低温培养2～4d，挑取单菌落划线纯化。采用纳氏试剂平板法初筛脱氨氮菌株，取纯化后的菌株点接在异氧硝化细菌固体平板上，8℃低温培养2d，去掉菌落，加入5mL纳氏试剂，测量菌落周围的透明圈直径。

1.3菌株鉴定形态鉴定:将培养24h的菌液，革兰氏染色后显微镜下观察形状大小。生理生化特性鉴定:按照参考文献方法进行接触酶、氧化酶、精氨酸双水解酶、V.P试验、M.R试验、葡萄糖利用、明胶液化试验。16SrDNA序列分析:用LB培养基培养菌株，离心收集菌体，用北京康为世纪细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，用细菌通用引物Primer1:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和Primer2:TACGGYTACCTTGT-TACGACTT进行PCR扩增，将PCR产物测序，在NCBI的BLAST数据库中进行DNA序列分析，用MEGAversion4.1软件构建系统进化树。BIOFOSUN微生物鉴定分析系统鉴定:按照BIOFOSUN微生物鉴定分析系统说明进行操作。

1.4菌株低温氨氮降解能力测定用500mL基本培养液培养氨氮降解菌，离心收集菌体，用无菌水洗涤2次，悬浮于5mL无菌水中，作为种子液。取1mL种子液接种到50mL新的异氧硝化细菌培养液中，3个平行样，培养液初始氨氮浓度为5mg/L，碳氮比分别为10:1，pH7.0。将培养液在8℃、160r/min震荡培养2d，每隔4h取样测定菌浊度OD600值、氨氮、硝态氮和亚硝态氮浓度，计算氨氮降解率。

1.5菌株的反硝化能力取1mL种子液接种到50mL新的反硝化细菌培养液中，3个平行样，培养液初始氨氮浓度为5mg/L，碳氮比分别为10:1，pH7.0。将培养液在8℃、160r/min震荡培养1d，每个4h取样测定菌浊度OD600值、硝态氮和亚硝态氮浓度，计算硝态氮降解率。

1.6分析方法采用纳氏试剂光度法测定氨氮浓度，酚二磺酸光度法测定硝酸亚浓度，N－奈基－乙二胺光度法测定亚硝态氮浓度。取菌液样品5mL，6000r/min离心5min，取1mL上清液测定，按公式氮降解率=C0－C1/C0×100%计算氮降解率，C0为初始氮浓度，C1为残留氮浓度。

2结果与分析

2.1氨氮降解菌筛选与鉴定松花江水经富集和分离，采用纳氏试剂平板法筛选，获得8株氨氮降解菌(图1)，菌株WSW－1001半透明圈直径最大为15mm。该菌株菌落白色、圆形、光滑，边缘整齐，菌体短杆状，大小0.2～0.4μm×1.0～1.3μm。革兰氏阴性，好氧，氧化酶阳性，接触酶阳性，精氨酸双水解酶阳性，利用葡萄糖和蔗糖，V.P阴性，M.R阴性，液化明胶。PCR扩增产物大小1400bp，与NCBI数据库中的Pseudomonas.fluorescensp1－1同源性为99%(图3)。BIOFOSUN微生物鉴定分析系统分析结果表明该菌株与荧光假单胞杆菌聚为1组(图2)。结合菌株WSW－1001的形态学和生理生化特性，以及16SrDNA序列分析和BIOFOSUN微生物鉴定系统分析结果，菌株WSW－1001被鉴定为荧光假单胞杆菌Pseudomonasfluorescens。

2.2菌株低温氨氮降解能力菌株WSW－1001低温氨氮降解效果见图4。菌株在8℃条件下具有较强的脱氮能力，48h内，随着菌体的生长，氨氮浓度持续下降，24h对初始氨氮浓度为5.23mg/L的氨氮降解率为71.7%，48h的降解率为80.4%，脱氮过程中无亚硝态氮积累，有少量(约0.48mg/L)硝态氮产生。

2.3菌株的异氧反硝化能力菌株WSW－1001在以硝酸钾为唯一氮源的培养基中生长与硝态氮含量变化情况见图5。菌株在8℃条件下能够利用硝态氮生长，24h对初始5.03mg/L硝态氮的降解率为3讨论纳氏试剂光度法是测定氨氮常用方法，纳氏试剂与氨氮反应生成黄棕色络合物，颜色深浅与氨氮浓度成正比。固体平板中的氨氮被微生物降解后不能与纳氏试剂进行显色反应，因此可以通过菌落周围半透明圈大小定性测定固体平板上生长的菌株氨氮降解能力。本研究采用纳氏试剂平板法可以对氨氮降解菌进行快速初筛。细菌的鉴定方法包括传统方法、分子生物学鉴定和仪器自动化鉴定，每种方法都有其各自的优缺点，三种方法结合可以确保鉴定结果的准确性。国内外对于异氧硝化细菌的研究报道较多，多数菌株在常温下脱氮效率较高，辛玉峰等报道不动杆菌YF14在30℃培养3d，可去除92%的氨氮，邱晓帆等报道1株假单肥菌WSH1001在20～35℃培养9h，氨氮去除率达95%。对于低温菌的研究报道较少，本文报道的菌株WSW－1001低温氨氮降解能力高于已有报道。ZhangD等人报道从松花江水中分离出1株异氧硝化细菌MicrobacteriumspSFA13，5℃培养30h后对5.09mg/L初始氨氮的降解率为63.6%;ZhangJ等人报道PseudomonasstutzeriYZN－00110℃培养2d氨氮降解率为45.5%。本文报道的菌株WSW－1001低温氨氮降解能力高于已有报道。

异氧硝化细菌的脱氮途径因菌株而异。菌株WSW－1001在氨氮降解过程中检测到少量硝态氮和微量亚硝态氮，说明该菌株能够通过硝化作用去除氨氮。该菌株能够利用硝酸盐生长，而且能够检测到微量亚硝酸盐生成，说明菌株具有反硝化功能，由于没有对菌株代谢过程中与硝化和反硝化作用相关的生化酶进行检测，也没有对氨氮降解后的最终产物进行检测，因此不能明确该菌株的脱氮途径。菌株WSW－1001的脱氮效率与菌株的生长速度有关，生长速度越快，氨氮降解率越高。菌株生长初期，氨氮降解效率较低，降解的氨氮主要用于菌株生长，随着菌株生长，产生一系列生化反应，对氨氮进行生物降解。

作者：张淑梅姜威李晶孟利强曹旭陈静宇赵晓宇张云湖单位：黑龙江省科学院微生物研究所黑龙江省科学院高技术研究院