农杆菌介导的愈伤组织的转化范文

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《生物技术杂志》2014年第二期

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验材料胀果甘草(GlycyrrhizainflataBatal.)愈伤组织由为作者实验室诱导并继代保存;含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pBI121－gfp质粒由河北大学生命科学学院曲占良老师馈赠;根癌农杆菌EHA105和LBA4404菌株由中国农业大学于静娟教授馈赠。

1.1.2试剂DM2000marker，日本Takara公司;oligodT15primer(10μmol/L)，美国Promega公司;dNTPs(各2.5mmol/L)，日本Takara公司;6×LoadingBuffer，Takara公司赠;琼脂糖，北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3仪器设备BINTA2020D凝胶成像分析仪，北京宾达英创科技有限公司;HYA恒温摇床，中国科学院武汉科学仪器厂;DYY－Ⅲ－6B型稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂;DHP－2000型电热恒温培养箱，天津市华北实验仪器有限公司;SANYOMDF－192型卧式超低温冰箱，日本三洋公司;DXZ25－370型低温冰箱，北京医用低温设备总厂。

1.1.4培养基

1.1.4.1MS基本培养基:MS微量元素，MS大量元素，MS铁盐，MS有机成分，蔗糖30g/L，固体培养基另加琼脂8g/L，pH5.8。

1.1.4.2LB培养基:酵母粉5g/L;蛋白胨10g/L;NaCl10g/L;固体培养基另加琼脂15g/L，pH7。

1.1.4.3YEB培养基:酵母浸膏1g/L;蛋白胨5g/L;牛肉膏5g/L;MgSO4•7H2O4g/L;蔗糖5g/L;固体培养基另加琼脂15g/L，pH7。

1.2方法

1.2.1愈伤组织的继代培养挑选结构疏松、颜色淡黄，生长状况良好的胀果甘草愈伤组织转入继代培养基25℃，暗处进行继代培养，继代培养基为MS基本培养基+KT0.5mg/l+2，4－D1.0mg/l，每4w继代1次［4］。

1.2.2抗性愈伤组织的筛选和检测共培养后的愈伤组织转入筛选培养基进行筛选，在筛选培养基上筛选45d后，统计愈伤组织转化率。以共培养3d后的愈伤组织块数为总块数，45d后筛选平板上仍然能够继续生长，并且结构疏松，颜色淡黄的愈伤组织为抗性愈伤组织，统计并计算结果。转化率=抗性愈伤组织块数/总块数×100%。筛选培养基为MS继代培养基+Kan100mg/l+Cb500mg/l。筛选中愈伤组织每两周换一次新鲜培养基。共培养完成后及筛选培养转化愈伤组织时，分别挑取少量愈伤组织在OLYMPUSBX53荧光显微镜下用于470nm波长蓝光观察绿色荧光，以检测绿色荧光蛋白在植物细胞中的表达情况。

1.2.3根癌农杆菌的转化取含有植物表达载体pBI121－gfp质粒的DH5α菌株于LB培养基中37℃、200r/min过夜培养。取过夜培养的菌液于新鲜培养基，培养至OD600=0.6时，收集菌体提取质粒。利用改良的热激法转化农杆菌EHA105和LBA4404两种菌株的感受态细胞，转化后在YEB+Kan100mg/l+Rif125mg/l抗性平板上筛选重组菌。得到含有pBI121－gfp质粒的两种重组农杆菌可直接活化用于植物细胞转化或用终浓度为20%的甘油保存在－80℃冰箱中，备用。

1.2.4根癌农杆菌介导的甘草愈伤组织转化挑取含有植物表达载体pBI121－gfp质粒的EHA105和LBA4404菌株的单菌落接种于YEB+Kan100mg/l+Rif125mg/l培养基中，28℃、180r/min过夜培养活化菌体。取1ml菌液至5ml新鲜培养基中，培养至OD600=0.6时，4000r/min离心5min收集菌体，用MS盐溶液(pH7.0)重悬后，侵染甘草愈伤组织。分别取继代培养3d、7d、10d、15d的愈伤组织置于重悬菌液中侵染15min;取继代培养7d的材料设定10min、15min、20min等不同侵染时间;侵染后的愈伤组织用无菌滤纸吸干表面多余菌液后接种于铺有无菌滤纸的MS基本培养基上，25℃黑暗条件下共培养3d。

1.2.5PCR分析质粒DNA的少量制备采用碱裂解法;转化愈伤组织基因组DNA提取采用CTAB法。扩增gfp基因使用的引物为:正向引物:5’－CCGCCGAGGCATGAGTAAAG－3’;反向引物:5’－GCCATCGCCAATTGGAGTAT－3’。预期扩增产物大小为500bp的片段。扩增反应程序:热启动94℃3min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环。最后72℃延伸3min，终止反应。反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2结果与分析

2.1抗生素敏感性试验

为了筛选出转化后的抗性愈伤组织，首先要对未转化的甘草愈伤组织进行抗生素敏感性试验，以确定合适的抗生素筛选浓度。选颜色淡黄、结构疏松、分散性好的愈伤组织，分散成体积大约为0.5cm2的小块接种在分别含有0、25、50、100、125mg/l等不同浓度Kan的继代培养基上，每个浓度做3个平行。分别在继代培养0d、15d、45d测定愈伤组织鲜重，并计算其相对生长量。结果见表1，愈伤组织的生长速度随着抗生素浓度的升高而越来越缓慢且相对生长量降低。如果继续培养愈伤组织会逐渐失水皱缩，褐化死亡，在Kan浓度为125mg/l时，相对生长量达到最低。考虑到筛选抗生素浓度为Kan125mg/l时，可能会对转化后的抗性愈伤组织的生长产生抑制，并且Kan100mg/l已经对未转化甘草愈伤组织的生长具有较理想的抑制效果，因此选择Kan100mg/l作为转化后的抗性愈伤组织的抗生素筛选浓度。

2.2根癌农杆菌介导绿色荧光蛋白基因导入甘草愈伤组织

2.2.1转化体系建立及转化愈伤组织的绿色荧光蛋白(GFP)荧光检测选择EHA105和LBA4404两种根癌农杆菌菌株，热激法转入含有绿色荧光蛋白GFP基因的植物表达载体pBI121－gfp，挑选转化的农杆菌用于侵染胀果甘草愈伤组织。设置不同继代培养时间的愈伤组织和农杆菌不同侵染时间两组条件，经共培养3d后的甘草愈伤组织置于荧光显微镜下观察。470nm蓝光激发，愈伤组织细胞中明显可见绿色荧光产生，而在未经农杆菌侵染的愈伤组织以及用不含植物表达载体的农杆菌侵染的愈伤组织细胞中均未见绿色荧光产生，图1为共培养3d时的检测结果。经过筛选培养基中筛选45d，获得了具有卡那霉素抗性的愈伤组织，对抗性愈伤组织进行荧光检测同样可见绿色荧光产生(图略)，说明抗性愈伤组织中表达了绿色荧光蛋白基因。

2.2.2转化愈伤组织细胞gfp基因的PCR检测选取筛选培养45d时在筛选平板上能继续生长的抗性甘草愈伤组织，提取基因组DNA用PCR方法扩增gfp基因，琼脂糖凝胶电泳图谱显示在转化的愈伤组织中扩增出了预期的500bp的gfp片段，而在未转化愈伤组织中未扩增出此片段，图2显示了部分抗性愈伤组织的检测结果。PCR结果证明在抗性愈伤组织中gfp基因整合到了植物基因组中，也表明GFP荧光检测与PCR扩增在gfp验证结果一致。试验结果表明，以农杆菌浸染胀果甘草愈伤组织共培养3d后，用含有100mg/L卡那霉素的愈伤组织继代培养基筛选45d后，可以获得gfp基因整合到甘草细胞基因组中的转化愈伤组织，并且表达出了绿色荧光蛋白。

2.3不同因素对甘草愈伤组织遗传转化效率的影响

2.3.1受体材料继代培养时间的影响用LBA4404－gfp和EHA105－gfp分别侵染继代培养时间为3d、7d、10d、15d的愈伤组织各15min，共培养3d，100mg/lKan筛选，45d后统计结果并计算甘草愈伤组织的转化率。如表2，表明LBA4404－gfp和EHA105－gfp均对继代培养7d的愈伤组织转化效率最高，LBA4404－gfp菌株的转化率在3d、7d、10d、15d时，均低于EHA105－gfp。EHA105－gfp的转化率在继代培养时间为7d时最高，达到96%。

2.3.2不同侵染时间的影响取继代培养7d的愈伤组织，LBA4404－gfp菌株和EHA105－gfp分别侵染愈伤组织10min、15min、20min，共培养3d后，100mg/lKan筛选，45d后统计转化率。同时以不含pBI121－gfp质粒的农杆菌LBA4404和EHA105菌株分别侵染培养7d愈伤组织做为阴性对照。LBA4404－gfp和EHA105－gfp侵染愈伤组织材料，在侵染时间为10min，15min，20min时，统计结果见表2、3，两种菌株都是在侵染时间为15min时，转化率最高。并且侵染时间为15min时的转化率高于10min，侵染时间为10min时的转化率高于20min。因此15min是最佳侵染时间。

2.3.3不同菌株的影响通过使用不同预培养时间的受体愈伤组织和农杆菌不同侵染时间两种实验条件，转化甘草愈伤组织后，转化愈伤组织的抗性筛选实验结果如表2、表3，表明EHA105－gfp菌株的转化率高于LBA4404－gfp菌株。但是，EHA105－gfp侵染后的愈伤组织，农杆菌生长旺盛，很难除去，影响愈伤组织生长，所以在转入筛选培养基之前，用附加500mg/lCb的无菌水清洗三遍，可以除去多余的EHA105－gfp。以上结果表明，对于根癌农杆菌介导的胀果甘草愈伤组织遗传转化，选择继代培养7d的愈伤组织作为受体材料，用EHA105－gfp侵染15min，共培养3d后用含有100mg/lKan的继代培养基进行筛选，45d后可以获得具有Kan抗性的转化愈伤组织细胞，转化效率可达97.14%。

3讨论

目前，对甘草的研究主要集中在植株的有效药用成分方面，对甘草愈伤组织次生代谢的基因工程调控研究和利用尚少。程焕欣等研究表明甘草愈伤组织有效成分(如黄酮类化合物)的含量较野生型高，所以通过组织培养技术获得大量愈伤组织，并对其加以开发利用，将成为有效缓解甘草资源日益枯竭等问题的有效途径。通过基因工程的手段，唐克轩课题组显著提高了颠茄毛状根莨菪烷类生物碱的合成效率和产物的积累;通过采用一系列的转基因调控方法，美国加利福尼亚大学伯克利分校的JayD.Keasling等利用酵母合成了产量超过100mg/l的青蒿素前体物质———青蒿酸，为进一步降低抗疟药物的成本提供了希望。基因工程手段已日益成为调控次生代谢的有效途径。范洪琼通过诱导何首乌愈伤组织，得到高大黄素，大黄酸的细胞系;马贵香等通过对黄芩愈伤组织培养过程中添加不同的外源激素，探索了外源激素对黄芩愈伤组织中黄芩含量的影响。虽然愈伤组织在研究植物次生代谢途径方面也扮演着重要角色，但是运用基因工程的手段通过愈伤组织来进一步研究植物次生代谢的机理仍然存在着大片空白。王康济构建了棉花遗传转化体系并实现了AtABA2基因的转化，为甘草愈伤组织的遗传转化提供了借鉴。因此，把基因工程手段应用于甘草愈伤组织的研究，可以对其主要药用次生代谢基因进行相应的调控和改良，扩大其利用空间，提高其利用价值。本研究建立了根癌农杆菌介导的甘草愈伤组织的遗传转化体系，为目的基因的导入，利用基因工程手段调控甘草次生代谢产物生物合成的研究奠定了基础。

作者：陈子龙梁玉玲鲜于梁艳韦阅单位：河北大学生命科学学院河北省生物工程技术研究中心