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《生物技术杂志》2014年第二期
1方法
1.1藻种培养条件及实验设置N.oculata选用海水培养基，其余3株藻采用改良BG－11培养基。将培养至对数生长中期的藻细胞离心(3500×g，5
min)收集，用无菌水洗涤后接种，初始接种OD750为0.6，设置3个重复，微藻培养采用3cm柱状光合生物反应器，通入含1%CO2的压缩空气搅拌，使用300μmolphotons•m－2•s－1的光强持续光照，培养温度25±1℃，培养周期21d。
1.2藻细胞生物质浓度的测定将孔径为0.45μm的混合纤维滤膜在80℃烘至恒重，取10mL藻液真空抽滤至滤膜，80℃烘至恒重，将两次结果相减即得细胞干重。
1.3藻细胞色素组成和含量的测定称取5mg藻粉，加入5mL乙醇振荡后室温黑暗中过夜，3500×g离心5min，收集上清色素提取液，用0.45μm滤膜过滤后上柱。采用UltiMate3000HPLC系统，流动相A:乙腈－水(90:10V/V)，流动相B:乙酸乙酯;检测波长:445nm，波长扫描范围:300～800nm;柱温:20℃，流速:1mL•min－1，进样量:20μl。
1.4藻细胞吸收光谱的测定采用紫外可见分光光度计，测定第6d的4株藻细胞和色素提取液的吸收光谱，藻液调整到相同的OD750，色素提取液调整到相同的OD680，狭缝宽度2nm，扫描速度200nm•min－1。
1.5藻细胞低温荧光光谱的测定采用日立F－4500荧光分光光度计，在77K温度下，测定4株藻细胞的低温荧光光谱，激发波长分别为436nm、470nm，波长扫描范围:600～750nm。发射波长分别为696nm、715nm、700nm，波长扫描范围:400～600nm。狭缝宽度2nm，扫描速度240nm•min－1。
1.6藻细胞光合放氧及呼吸速率的测定采用液相氧电极测定光合放氧速率，先用Na2S2O3对氧极的基线进行校准，取适量样品低速离心，再用含有5mmol/LNaHCO3的相应氮浓度的培养基重悬藻体，测定时间为5min。Chla的测定参见李其雨等人提到的方法，公式为Chla(mg•L－1)=(11.64A663－2.16A645－0.10A630)v/(lV)，其中v为有机溶剂体积，V为藻液体积，l为测定池光程。
1.7数据处理用Origin8.5和SPSS13.0软件对数据进行统计分析。
2结果与分析
2.14株真眼点藻的生长曲线图1为4株真眼点藻生物质浓度变化曲线。在培养周期内，随时间延长各实验组生物质浓度均先快速上升后缓慢上升。V.helvetica在第18d达到最大生物量7.26g•L－1，其他3株藻则是第21d，分别为9.4g•L－1(E.sp.)、10.42g•L－1(E.polyphem)、7.15g•L－1(N.oculata)，其中E.sp.和E-.polyphem的最大生物量极均显著高于V.helvetica和N.oculata(p＜0.01)。说明不同生活环境和种属的4株真眼点藻的生长特性存在一定的差异性。
2.24株真眼点藻的色素组成及含量表24株真眼点藻的色素组成及含量表2为4株真眼点藻的色素组成及含量变化。4株藻均含有Chla、Vio、Vau和β－car。N.oculata的Chla含量显著高于其余3株藻(p＜0.05)。4株藻的Chla和Vio的含量随培养时间延长均降低，Chla/β－car和Vio/β－car的值也下降，而N.oculata的Chla/β－car和Vio/β－car均显著高于其余3株藻(P＜0.05)。说明4株真眼点藻的色素组成一致，但其色素含量存在差异。
2.34株真眼点藻的吸收光谱图2为N.oculata藻细胞和色素提取液吸收光谱，其余3株藻的扫描结果与其类似(结果中未显示)。由图可知，4株藻的细胞和色素提取液吸收光谱中，可见光区均有3个吸收峰，436～440nm和666～680nm分别是Chla在蓝、红光区的吸收峰，470～486nm处则属于类胡萝卜素;与色素提取液的最大吸收峰相比，藻细胞的吸收峰均有一定的红移，这是由于藻细胞中色素与蛋白质的结合而导致的。
2.44株真眼点藻的低温荧光光谱图3为4株真眼点藻的低温荧光发射光谱。由图3(a)可知，以436nm为激发波长时，E.sp.和V.helvetica的主峰为715nm，肩峰为696nm;而E.polyphem的主峰为696nm，肩峰为715nm;N.oculata只有一个696nm处的发射峰。由图3(b)可知，以470nm为激发波长时，E.sp.、E.polyphem和V.helvetica均有2个发射峰，主峰为700nm，肩峰为715nm，而N.oculata只有700nm处的一个发射峰。其中696～700nm附近的荧光峰来自PSⅡ，715nm附近的荧光峰来自PSⅠ。以上结果说明4株真眼点藻的荧光发射均没有高等植物PSⅠ730nm处的荧光特征峰，预示着其光系统的结构和能量传递与高等植物存在一定差异。图4为4株真眼点藻的低温荧光激发光谱。424nm、442nm的荧光峰来源于Chla，470nm、483nm、496nm、518nm和525nm的荧光峰均来源于类胡萝卜素，从荧光激发光谱可以看出Chla和类胡萝卜素之间具有能量偶联。以696nm和700nm为发射波长时，荧光激发光谱在480～550nm的波段处不同藻间出现的差异反映出4株真眼点藻PSⅡ色素蛋白复合物存在一定的差异。
2.54株真眼点藻的光合放氧及呼吸效率图5(a)为4株真眼点藻不同生长阶段最大光合速率变化。4株藻在不同生长阶段最大光合速率先上升后下降，在第6dN.oculata的最大光合速率为59.62μmolO2•mg－1Chla•h－1，显著高于其他3株藻(P＜0.05)，其余3株藻之间并无显著性差异(P＞0.05)。图5(b)为4株真眼点藻不同生长阶段呼吸速率变化。4株藻的呼吸速率呈现上升趋势。在第21d，N.oculata的最大呼吸速率为54.23μmolO2•mg－1Chla•h－1，显著高于其他3株藻(P＜0.05)，其余3株藻之间并无显著性差异(P＞0.05)。
3讨论
Chla和类胡萝卜素是真眼点藻主要的光合色素。本实验测定4株真眼点藻均只含有Chla和3种主要的类胡萝卜素而黄藻纲中含有Chla、叶绿素c、β－car和叶黄素等，因此，与黄藻纲相比，真眼点藻的色素组成是其分类的重要特征之一。N.oculata在培养过程中β－car含量下降，与前人对6种来自海水的真眼点藻的测定结果一致，但与本实验的其他3株真眼点藻相反，表明来自不同生境的真眼点藻色素含量变化存在差异。本研究中4株藻在450－500nm波段的吸收峰为类胡萝卜素，前人对其他真眼点藻的研究中也检测到相似的吸收峰，这也是真眼点藻吸收光谱的特征之一。77K温度下藻细胞只有光能传递的物理过程，所以77K低温荧光光谱能直观反应能量在PSⅡ和PSⅠ之间的传递和分配。本研究中E.sp.、V.helvetica和E.polyphem的低温荧光发射光谱与JeanChrystal等人研究的Nannochloropsissalina相似，均有2个峰，而N.oculata则与WafaArsalane和JeanChrystal的Vischeriapunctata和N.sp.相似，只有1个发射峰，由此可见来自不同科属和生境的真眼点藻在PSⅡ和PSⅠ之间的能量传递和分配存在差异性。本实验结果表明，4株真眼点藻均没有高等植物PSⅠ730nm处的荧光特征荧光峰，这与硅藻和绿藻等大多数藻类的情况相同，这也预示着4株真眼点藻在光系统的结构和能量传递方面与高等植物不同。多数藻类的PSⅠ没有F730荧光，是因为藻类适应以黄绿光为主的弱光环境。
本研究表明，Chla和类胡萝卜素之间具有能量偶联，该结果与前人的研究结果一致，他们还证实在490nm附近的激发峰主要为Vio，Vio直接作用于PSⅡ从而推动光合作用的发生。本实验中，4株真眼点藻的荧光激发光谱在480～550nm的波段处出现差异，反映出真眼点藻PSⅡ色素蛋白复合物组成上存在一定差异。随着培养时间延长，培养基内营养盐逐渐消耗，导致藻细胞内有机大分子(如:叶绿素)合成受阻，从而使藻细胞的生长代谢和光合速率受到影响。吕秀平等人的实验表明，光合作用参数的变化很大程度上是由胞内Chla质量浓度变化所引起的，这与本实验结果一致，N.oculata细胞内Chla的含量较高，所以其最大光合速率也明显的高于其余3株藻。而徐芳等人测得N.sp.在对数期的最大光合速率为172.28±5.87μmolO2•mg－1Chla•h－1，呼吸速率为30.14±8.7μmolO2•mg－1Chla•h－1，这与本实验对4株真眼点藻的研究结果不同，可能与实验的条件以及真眼点藻的种类有关。海水的光照、温度和渗透压等环境异于淡水和土壤，本实验中来自海水的N.oculata在生长代谢和光合生理上都与其他3株来自淡水和土壤的真眼点藻有显著性的差异，这是他们长期适应生存环境的结果。本研究全面探讨了4株真眼点藻的生长和光合生理特性，进一步证实其与黄藻纲和高等植物之间的差异，为研究真眼点藻光合作用机理及其代谢机制奠定理论基础。
作者：王元丽李其雨李爱芬张成武单位：暨南大学水生生物研究中心生态学系