交替氧化酶在麻疯树盐胁迫中的作用范文

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《生物技术通报杂志》2014年第七期

1材料与方法

1.1材料

供试麻疯树（JatrophacurcasL.）种子源自四川大学生命科学学院植物生理与分子生物学实验室（林宏辉教授惠赠）。

1.2方法

1.2.1盐胁迫处理播种前麻疯树种子用0.1mol/LKMnO4溶液浸泡种子5min进行消毒，并用清水浸泡12h，然后沙层催芽。种子萌发后选取长势一致的幼苗以每盆1颗移入含营养土和蛭石（1∶1）的培养基质上种植，同时每天施以1/2Hoagland营养液，两真叶期幼苗用于盐胁迫试验。盐胁迫处理时，先用200mmol/L、400mmol/L和1mol/LNaCl水溶液进行土壤灌浇，然后将整个花盆苗置于含200mmol/L、400mmol/L和1mol/LNaCl水溶液的托盘中培养，每天上、下午对托盘中的盐溶液进行更换；对照组幼苗用去离子水处理。实时记录不同处理组幼苗的生长变化情况。

1.2.2AOX基因的RT-PCR扩增分析麻疯树叶片总RNA的提取参照林莎等［21］的方法进行。不同处理组RNA浓度经紫外分光光度计（TU-1800）检测后，取1μg总RNA，用FirstStrandcDNAsythesisKit（Fermentas公司），反转录合成cDNA第一链。AOX基因RT-PCR扩增引物参照NCBI数据库中的已知序列（NCBI登录号：GW876353.1）进行设计，上游引物：5''''-CGATGGCTCTTTCACCTT-3''''；下游引物：5''''-CGCAATAGTTTCCAGCAC-3''''。RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，采用Quantityone4.62软件（Bio-Rad公司）进行半定量分析。

1.2.3呼吸测定麻疯树叶片呼吸测定参照Xu等［10］的方法用Clark型氧电极（Hansatech，King’sLynn，UK）进行总呼吸，细胞色素途径呼吸和抗氰呼吸的测定和计算。无呼吸抑制剂时测得总呼吸速率；同时加入细胞色素途径抑制剂KCN（氰化钾，终浓度为1mmol/L）和交替途径抑制剂n-PG（没食子酸丙酯，终浓度为100μmol/L）测得剩余呼吸速率；仅加入KCN时的呼吸速率减去剩余呼吸速率为交替途径呼吸速率。每个样品重复测定3次，取平均值。

1.2.4叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定参照Xu等［10］的方法进行。

1.2.5含水量测定取约1g麻疯树幼苗叶片，用电子天平称重，记录为Wf。将称重后的叶片装入两个洁净培养皿中，在120℃烘箱中干燥处理约50min。取出称重后，再放回烘箱，之后间隔约10min称重一次，直至恒重，记录为WD．

1.2.6丙二醛和过氧化氢含量测定丙二醛（MDA）含量和过氧化氢（H2O2）含量的测定参照Wang等［22］的方法进行。

1.2.7气孔观测分别撕取对照组和盐胁迫条件下的麻疯树幼苗叶片，制作叶表皮临时装片。气孔用两滴KI-I2染色后，置显微镜下观察并拍照记录。

1.2.8数据分析所有的数值都重复测定3次，并计算标准偏差（standarddeviation，SD）。采用GraphpadPrism6.0软件分析数值的变化。以最小显著差异值（leastsignificantdifference，LSD）0.05判断各种结果差异是否显著。

2结果

2.1不同浓度盐胁迫对麻疯树生长的影响如图1-A所示，麻疯树幼苗在200mmol/L和400mmol/LNaCl胁迫条件下生长良好，且当盐浓度提高到1mol/LNaCl处理时，麻疯树仍未表现出明显的胁迫损伤，表明麻疯树具有较强的耐盐适应能力。进一步研究发现，3种浓度盐胁迫处理3d后，麻疯树叶片叶绿素含量与对照组相比无显著差别。此外，盐胁迫处理对叶片含水量的影响也不明显，处理组和未处理组麻疯树叶片含水量均在90%左右，表明麻疯树在盐胁迫条件下具有较强的光系统保护能力和调节水分平衡的机制。3种浓度盐胁迫处理3d后，叶片过氧化氢（H2O2）含量与盐胁迫处理浓度呈正相关，但与对照组幼苗相比并无显著差别。同样，丙二醛（MDA）含量也随着胁迫处理所用盐浓度的上升而增加，但不同处理组之间没有明显差异，与对照组的差异也不显著（图1）。这些结果表明，麻疯树具有较强的盐胁迫适应机制。但是，高浓度盐（1mol/LNaCl）胁迫处理条件下，麻疯树幼苗的生长速率变缓。1mol/LNaCl处理麻疯树幼苗10d后，叶片面积明显小于未处理的对照组（表1）。

2.2盐胁迫对AOX呼吸和AOX基因表达的影响AOX途径已被证实在植物逆境胁迫响应中扮演着减轻胁迫损伤、稳定植物生长速率和增加植物抵御能力的作用，本研究进一步检测了盐胁迫处理对AOX呼吸和AOX基因表达的影响。图2-A显示，盐胁迫条件下，麻疯树叶片总呼吸被不同程度抑制。与对照组幼苗相比，400mmol/L和1mol/LNaCl处理组叶片总呼吸下降最为明显，但在处理后第2天趋于稳定。相反，AOX呼吸在盐胁迫处理条件下被显著诱导（图2-B）。在正常生长条件下，AOX呼吸约占总呼吸的28%。200mmol/LNaCl处理1d后，AOX呼吸约占总呼吸的40%。更明显的是，400mmol/L和1mol/LNaCl处理1d后，AOX呼吸占总呼吸的比例超过了50%。此外，图2-C显示，盐胁迫处理明显诱导了AOX基因的转录。与对照组相比，200mmol/L和400mmol/LNaCl处理3d后，AOX基因的转录水平上升近两倍。1mol/LNaCl处理后，AOX的转录水平上升近3倍。因此，AOX呼吸途径的诱导表达可能是麻疯树具有耐盐胁迫能力的原因之一。

2.3盐胁迫处理后叶片气孔比较分析为进一步分析麻疯树的盐胁迫反应，本研究还检测了盐胁迫处理对气孔开合度的影响。结果（图3）表明，200mmol/LNaCl处理时，麻疯树叶片气孔大小与对照组几乎相同。400mmol/LNaCl处理时，麻疯树叶片气孔开度明显减小。当盐浓度提高到1mol/LNaCl处理时，麻疯树叶片气孔大部分处于半闭合状态。因此，麻疯树可能通过调节气孔开合度来维持叶片较高的含水量，这可能也是麻疯树具有较高耐盐性的原因之一。

3讨论

麻疯树耐贫瘠，生命力旺盛，根系强大，能在降水量少、环境恶劣的地区种植，但到目前为止麻疯树的抗逆机理仍不清楚。本研究通过检测不同浓度盐胁迫处理对麻疯树生长的影响及交替氧化酶在盐胁迫条件下的表达变化，以期进一步揭示麻疯树对逆境胁迫的耐受机制。研究结果表明，麻疯树在200mmol/L、400mmol/L和1mol/LNaCl处理条件下均表现出较强的耐盐适应性。麻疯树幼苗在200mmol/L和400mmol/LNaCl处理条件下生长状况良好，长势几乎与对照组相同。1mol/LNaCl处理减缓了麻疯树幼苗的生长速率，但并没有造成明显的胁迫损伤。陈健妙等研究表明，100-150mmol/LNaCl处理对麻疯树幼苗的长势影响不大，且低浓度盐处理（20-50mmol/LNaCl）还能促进麻疯树幼苗的生长和生物量的积累。本研究也发现，3种浓度盐胁迫条件下，麻疯树幼苗叶片叶绿素、H2O2和丙二醛含量与对照组相比并无显著差异。

此外，本研究表明麻疯树在盐胁迫条件下具有较强的水分调节能力。试验期间，胁迫处理组和对照组麻疯树幼苗叶片细胞含水量均维持在一个较高的水平。据此，我们分析可能与调节气孔开合度有关，麻疯树幼苗在200mmol/LNaCl处理条件下叶片气孔开合度与对照组没有太大差异，但用400mmol/LNaCl和1mol/LNaCl处理时，气孔开度明显减小，尤其是在1mol/LNaCl处理条件下，气孔大多处于半闭合状态。前人的研究也表明麻疯树具有较强的抗渗透胁迫能力。窦新永等曾报道麻疯树幼苗在高浓度的PEG（25%）处理15d后仍能存活，表明其具有对干旱缺水的环境有较强的适应性。陈友根等也曾报道，适度的渗透胁迫不会影响麻疯树的生长，反而会增强细胞叶绿素的合成。1mol/LNaCl处理的麻疯树幼苗叶片面积明显小于对照组幼苗。叶面积的减少可降低相对蒸腾速率，从而减少水分散失；加上气孔开度的减小，麻疯树能较好地维持叶片的相对含水量。但是，高浓度盐处理引起的叶片气孔开度的减小可能是植株生长减缓、叶面积降低的主要原因。因此，盐胁迫对麻疯树的作用是多方面的，麻疯树在抗盐反应过程中自身代谢反应也受到了影响。

麻疯树对盐胁迫的适应性还应与AOX呼吸途径有关。本研究显示，3种浓度盐胁迫处理条件下，叶片细胞总呼吸受到了不同程度的抑制，但AOX途径呼吸和AOX基因转录水平明显上升。高浓度盐处理（400mmol/L和1mol/LNaCl）1d后，AOX呼吸占总呼吸的比例超过了50%。此外，200mmol/L和400mmol/LNaCl处理3d后，AOX基因的转录水平高出对照组幼苗近两倍。当用1mol/LNaCl处理3d后，AOX基因的转录水平较对照组上升近3倍。这些结果表明，盐胁迫诱导AOX的表达可能是麻疯树对盐胁迫高度适应的另一原因。事实上，近年来国内外的一系列研究表明AOX在盐胁迫条件下扮演着至关重要的角色，且盐胁迫诱导AOX基因表达已在拟南芥、烟草、黄瓜、番茄等诸多植物中得以证实。研究人员在这些植物的抗逆应答研究中发现，AOX表达的上升有助于减少胁迫条件下活性氧（ROS）的积累，减轻氧化损伤，从而维持植物的正常代谢生长。Xu等研究表明，胁迫条件下AOX表达上升还有助于减轻逆境胁迫对光系统的损伤，使植物保持正常的光合效率。由此可见，本试验中AOX基因表达的上升可能与减轻盐胁迫引起的氧化损伤有关。此外，越来越多的研究把AOX当作细胞氧化损伤的标记基因，甚至视为植物的“存活因子”。例如，拟南芥植物过表达AOX基因能显著增强植物在逆境条件下的存活率；相反，沉默或抑制AOX基因表达的植株在胁迫条件下表现出严重的细胞损伤，逆境适应性大大减弱。因此，麻疯树幼苗AOX呼吸途径的上升在一定程度上弥补了盐胁迫对细胞色素途径呼吸的影响，稳定了线粒体中正常的电子传递，从而减少胁迫引起的氧化损伤。本研究表明麻疯树具有较强的耐盐适应性，AOX基因也在麻疯树盐胁迫应答过程中受明显的诱导表达。但是，交替氧化酶的诱导机制是什么，及与其它抗逆因子间存在怎样的关系，尚需进一步研究证明。此外，麻疯树在盐胁迫条件下气孔导度的调节机制是什么，是否与脱落酸（ABA）和乙烯等抗逆激素有关，加强相关的研究有助于进一步阐明麻疯树的耐盐机理。

4结论

研究了盐胁迫处理对麻疯树生长的影响及AOX在麻疯树盐胁迫响应中的作用。结果表明，麻疯树具有较强的耐盐性，200mmol/L和400mmol/LNaCl处理对麻疯树幼苗生长影响不大。1mol/LNaCl处理时麻疯树生长减缓，气孔开度降低，但未表现出明显的胁迫损伤。此外，AOX呼吸和AOX基因的转录水平在盐胁迫条件下明显上升，表明AOX可能在麻疯树盐胁迫应答过程中起重要作用。

作者：余璐璐吴阳晨王静静 魏倩 徐飞单位：武汉生物工程学院生物科学与技术系四川大学生命科学学院