转录调控蛋白基因的克隆范文

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《生物技术通报杂志》2014年第七期

1材料与方法

1.1材料

嗜水气单胞菌Zf1菌株由本实验室保藏。细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，pMD18-TVector购自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、PCR扩增试剂均购自上海捷瑞生物工程公司。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成参考嗜水气单胞菌AhyR基因序列（登录号：YP_855090），设计特异性上下游引物（AhyR-F：CGATTGCGAAAGCGATAA；AhyR-R：CTGCTGAGCCATTGGTTTT）用于PCR扩增Zf1菌株AhyR基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2Zf1菌株AhyR基因克隆参考李雪等［10］方法，将Zf1菌株接种于LB液体培养基中，28℃培养12h。取1mL菌液用于提取基因组DNA，具体操作参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书。将提取到的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。PCR扩增采用10μL体系：提取的Zf1菌株基因组DNA模板1.0μL，上下游引物各0.5μL，MasterMix5.0μL，ddH2O3μL。PCR循环条件为：94℃预变性2min，94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸2min，经30个循环后72℃再延伸10min。得到目的条带后，按照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书回收目的基因。将胶回收得到的DN段用1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。将AhyR基因胶回收产物与pMD18-T载体连接，转化到DH5α感受态细胞，阳性克隆菌样送上海生工测序。

1.2.3基因序列及其结构分析用Editseq推测氨基酸序列，利用MotifScan、blastp程序预测结构域，NetPhos2.0Server预测磷酸化位点。通过邻接法（Neighbor-Joining），应用MEGA5.1软件构建系统发育进化树分析。将蛋白氨基酸序列提交SWISS-MODEL预测三级结构，用RasMolVersion2.7.5.2查看蛋白三级结构，并用拉马钱德兰图（Ramachandranplot）检测蛋白模型的合理性。

2结果

2.1Zf1菌株AhyR基因克隆及序列分析PCR扩增得到一条特异性条带（图1），测序获得AhyR基因大小为1063bp，引物序列见图2，推测ORF编码260aa；查找结构域发现AhyR蛋白18-168aa区域为自体诱导物结合域（PF03472），176-241aa区域为LuxR型螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域（PS50043），183-227aa区域为DNA结合域（PF04967）（图3）；预测AhyR蛋白含有13个磷酸化位点，其中有8个丝氨酸（15S、62S、144S、145S、156S、173S、200S、227S）、3个苏氨酸（30T、184T、188T、）和2个酪氨酸（161Y、231Y），进一步预测酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（15S、173S、184T、199T）和蛋白激酶C磷酸化位点（173S、184T、210T、222T）（图4）。

2.2AhyR基因蛋白序列比对及系统进化树分析对AhyR蛋白进行多重序列比对表明气单胞属不同菌种AhyR氨基酸序列高度保守，与杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）、维隆气单胞菌（A.veronii）、豚鼠气单胞菌（A.caviae）、中间气单胞菌（A.media）、简达气单胞菌（A.jandaei）序列同源性分别为100%、99.62%、99.23%、98.85%、94.23%。构建系统发育进化树分析显示AhyR为LuxR同源蛋白之一，AhyR蛋白与嗜水气单胞菌（登录号YP_855090）的AhyR蛋白亲缘性最近，自然聚为一支（图5）。

2.3AhyR基因编码蛋白三级结构预测进一步分析AhyR蛋白三级结构，确定以群体感应控制阻遏物的A链（PDB：3SZT_A）为模板，该蛋白与模板相似性达28.40%，通过SWISS-MODEL在线比较建模结果，如图6-A所示，AhyR蛋白主要由15个α螺旋、5个β折叠和19个转角构成，该三级结构与二级结构序列特征分析结果基本一致；图6-B显示LuxR型螺旋-转角-螺旋结构域主要以α螺旋分布在三级结构C端外侧。拉马钱德兰图检测结果（图7）表明有93.9%氨基酸序列位于最适宜区，5.9%氨基酸序列位于允许区，证实AhyR基因推导蛋白的三级结构模型合理。3讨论嗜水气单胞菌致病因子主要包括外毒素、胞外蛋白酶等，还与转录调控蛋白AhyR基因有关［3］。AhyR蛋白在嗜水气单胞菌蛋白酶活性调节中起重要作用，促使胞外蛋白酶较早表达，有效防御病原菌侵入抵制感染［7］。Bi等利用自杀性重组质粒pJP-AhyR插入诱变嗜水气单胞菌J-1菌株AhyR基因，构建该基因突变株J-1△AhyR，证实AhyR基因。

作者：李雪  胡秀彩 兰云 沈晓静 吕爱军朱爱华单位：江苏师范大学生命科学学院