烟叶类胡萝卜素代谢特征研究范文

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《江西农业大学学报》2016年第一期

摘要:

为研究江西不同土壤条件下烟叶类胡萝卜素代谢的差异，在江西省抚州广昌烟区典型的旱地紫色土和水田砂壤土条件下，对烟草(NicotianatabacumcLcv．K326)叶片类胡萝卜素积累规律、类胡萝卜素代谢关键酶基因的表达规律进行了比较研究。RT-PCR分析表明，类胡萝卜素合成相关基因(PSY、PDS、LCYb、ZEP)及降解相关基因(CCD1)转录水平的表达在水田沙壤土烟叶中更为活跃;但LC/MS检测结果显示，旱地紫色土烟叶中类胡萝卜素积累水平较高，尤其是在烟叶成熟后期，β-胡萝卜素、叶黄素、新黄质等含量明显高于水田沙壤土烟叶。虽然烤后烟叶中，旱地紫色土和水田砂壤土烟叶类胡萝卜素降解产物总量相近，但巨豆三烯酮、二氢大马酮、香叶基丙酮等物质在旱地紫色土烟叶中含量较高，这可能是形成紫色土烟叶风格特征的主要因素之一。

关键词:

土壤;烟叶;类胡萝卜素;代谢;比较

烟叶的质量和风格特色受到烟草品种特性、栽培措施及生态环境等多种因素的综合影响［1］，其中，土壤作为烟株赖以生存的基本条件，与烟叶生长发育和物质代谢密切相关，是决定烟叶特色风格的关键因素之一。逄涛等［2］对云南烟区不同土壤类型K326烟叶化学成分进行了的比较研究，发现总糖、还原糖等多个指标在不同土壤类型间存在显著差异。陈杰等［3］对贵州不同质地烤烟的质量分析表明，砂壤土种植的烟叶具有高糖、低碱、高糖碱比和高氮碱比的特征;粉黏土具有低糖，高碱，低糖碱比和低氮碱比的特征。已有的研究证明，土壤类型对烤后烟叶的质量风格影响显著，但关于土壤影响烟叶质量风格的机制仍不清楚，尤其是对不同土壤条件下烟叶类胡萝卜素代谢特征缺乏研究。江西土壤类型多样。其中，旱地紫色土和水田砂壤土是植烟土壤的典型代表。紫色土以酸性和中性土壤为主，通气性好，质地上轻下重，有较强的保水保肥性能，钾含量较高，氮和有机质的含量较低［4］;水田砂壤土:砂壤土质地偏轻，土壤的通透性较好，具有较高的基础肥力，土壤有效养分含量较高，肥效较快［5］。不同土壤条件下烟叶质量风格迥异，为研究江西典型特色烟叶的形成机制，本文以K326为材料，比较了旱地紫色土和水田砂壤土条件下烟叶类胡萝卜素积累、降解规律，以及类胡萝卜素代谢关键酶基因的表达规律，以探索土壤条件对烟叶质量风格影响的代谢机制，为彰显江西烟叶特色风格奠定理论基础。

1材料与方法

1．1材料供试品种为K326。试验于2013年在江西省抚州市广昌长桥镇(水田砂壤土)和甘竹镇(旱地紫色土)。按照当地优质烟栽培技术规范实施管理。在打顶后10，20，30，40d取中部叶片，去除主脉后迅速用锡箔纸包裹后放入液氮冷冻，后置于－80℃冰箱保存。

1．2方法

1．2．1类胡萝卜素含量检测将冷冻烟叶用冻干机进行冷冻干燥处理，即为待测样品。类胡萝卜素含量的测定采用YC/T382—2010烟草及烟草制品质体色素测定、高效液相色谱法。液相色谱分析仪系统包括Waters2487紫外可见光分光光度检测器和Waters515泵，Rheodyne7725i型手动进样阀，Empower色谱工作站。工作条件为:色谱柱:SymmetryC18反相色谱柱(3．9mmi．d．×150mm，5μm，美国Waters公司)。流动相A∶甲醇的异丙醇溶液(体积比为1∶1);流动相B:超纯水。流速:0．5mL/min。梯度洗脱:0～10min(70%A+30%B);10～17min(100%A):17～30min(90%A+10%B)。以曲线6线性递增(减)的梯度条件，平衡10min后手动进样。进样量:10μL。检测波长:450nm。柱温:室温。

1．2．2RT-PCR分析按照InvitrogenTRizolReagent说明书进行烟草总RNA的提取，通过随机引物法反转录合成cDNA。采用PremierPrime5．0软件，根据Genbank的PDS、PSY、ZEP、LCYb、CCD1和L25序列设计各基因扩增引物，进行RT-PCR。其中L25作为内参基因。PCR反应体系为20μL:10μLTaqMix，1μL上游引物，1μL下游引物，2μLcDNA模板，7μL水。扩增程序为:94℃预变性5min;94℃30s变性，50℃30s退火，72℃1min延伸，共33个循环;72℃延伸10min。PCR产物在10g/L琼脂糖凝胶中电泳后，鉴定其亮度和特异性。

1．2．3类胡萝卜素降解产物含量测定烤后烟选取C3F等级。采用“水蒸气蒸馏•二氯甲烷溶剂萃取”法进行前处理后，并用HP5890II-5972气质连用仪对烟叶样品进行定性分析。色谱柱为HP-5［60m×0．25mm(i．d．)×0．25m(d．f．)］;载气及流速为He，0．8mL/min;进样口温度为250℃，传输线温度为280℃;离子源温度为177℃;升温程序为在50℃停留5min，以每分钟5℃的升温速度升至120℃，停留15min，再以每分钟5℃的升温速度升至180℃，停留5min，然后以每分钟6℃的升温速度升至250℃，停留15min;分流比和进样量为1∶15，2L，电离能为70eV;电离方式为EI;质量数范围为50～500Da。采用NIST02谱库检索定性。假定相对校正因子为1，采用内标法定量。

2结果与分析

2．1不同土壤烟叶类胡萝卜素积累规律为比较不同土壤条件下烟叶成熟过程中类胡萝卜素的积累变化规律，分别在旱地紫色土和水田砂壤土条件下进行K326的规范化种植和管理，并在打顶后不同时间内选取中部叶片(第10～12叶位)进行类胡萝卜素的检测和分析(图1)。可以看出，在不同土壤条件下，随着叶片发育成熟，烟叶中类胡萝卜素各组分都呈现总体下降的趋势。水田砂壤土条件下，烟叶类胡萝卜素素各组分含量持续下降;但旱地紫色土烟叶在打顶后40d时，β-胡萝卜素、叶黄素、新黄质含量有明显回升。在两种土壤条件下，烟叶紫黄质的含量呈下降的趋势，打顶后，旱地紫色土的稍高于水田砂壤土;之后，两者间的差别较小。在叶片成熟过程中，旱地紫色土烟叶中类胡萝卜素各个组分的含量都明显高于水田砂壤土烟叶，表明旱地紫色土条件有利于烟叶类胡萝卜素的积累。

2．2不同土壤烟叶类胡萝卜素代谢关键酶基因表达分析为比较不同土壤条件下烟叶类胡萝卜素代谢相关基因在转录水平的差异，采用半定量RT-PCR技术，分别对旱地紫色土和水田砂壤土条件下K326中部叶片进行类胡萝卜素相关基因的表达分析，结果如图2所示。PSY编码八氢番茄红素合酶，催化八氢番茄红素的合成，是类胡萝卜素生物合成途径的关键调节酶基因［5-8］。在叶片成熟过程中，旱地紫色土烟叶PSY表达逐渐增强，而水田砂壤土烟叶无明显变化。从表达强度来看，水田砂壤土烟叶PSY基因转录水平的表达明显比旱地紫色土烟叶更为活跃。PDS编码八氢番茄红素脱氢酶，催化八氢番茄红素转化为ζ－胡萝卜素，继而在ζ－胡萝卜素脱氢酶ZDS催化下生产番茄红素。PDS的表达在旱地紫色土条件下，随叶片成熟而逐渐增强，但在水田砂壤土烟叶中的表达丰度明显较高。LCYb基因编码番茄红素－β－环化酶，催化番茄红素形成β－胡萝卜素。该基因的表达在水田砂壤土烟叶成熟后期有明显增强，但在旱地紫色土烟叶成熟后期有所减弱。ZEP基因编码玉米黄素环氧化酶，催化玉米黄素环氧化形成紫黄质。在叶片成熟过程中，该基因在水田砂壤土烟叶中维持较高的转录表达水平。CCD1编码类胡萝卜素裂解双氧合酶，可催化多种类胡萝卜素底物生成许多天然活性化合物。该基因在旱地紫色土烟叶中的表达持续增强，在水田砂壤土烟叶中表达水平高且稳定。2．3不同土壤烟叶类胡萝卜素降解产物含量变化分析为比较不同土壤条件下烤烟类胡萝卜素降解产物的差异，利用HPLC技术对不同土壤烟叶烤后样C3F进行中性香味物质进行定性、定量分析，结果如表2所示。可以看出，不同土壤烟叶调制后类胡萝卜素降解产物的种类基本一致，含量较高的有巨豆三烯酮、大马酮、法尼基丙酮、二氢猕猴桃内酯等几种物质，其中巨豆三烯酮包括A、B、C、D等4种异构体。从总量上看，不同土壤条件下K326烟叶类胡萝卜素降解产物差异并不明显，水田砂壤土略高于旱地紫色土。从类胡萝卜素降解产物组分看，巨豆三烯酮、二氢大马酮、香叶基丙酮的含量在旱地紫色土烟叶中较高，β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、法尼基丙酮等含量在水田砂壤土烟叶中较高。另外，番茄红素的降解产物6-甲基-5-庚烯-2-酮的含量在旱地紫色土烟叶中的含量明显高于水田砂壤土烟叶。

3讨论

烟叶类胡萝卜素是烟叶重要致香物质的前提物，类胡萝卜素降解产物的种类和含量直接或间接决定着烟叶的质量和特色［9-13］。类胡萝卜素相关研究也因此而成为烟草的热点研究领域。已有的研究证明，类胡萝卜素的积累和降解过程，随着烟草品种［14-15］、生长发育时期［16］、生态环境［17-21］、栽培技术［22-25］及调制方法［26-29］的不同而各具特点。土壤条件影响着烟株的生长发育和物质代谢，对烟叶质量和风格具有决定性作用。但关于不同土壤条件下烟叶类胡萝卜素积累和降解规律、及其代谢关键基因表达特征的研究，目前还未见报道。在旱地紫色与和水田砂壤土条件下，针对烟草K326叶片类胡萝卜素代谢规律进行比较分析。从类胡萝卜素积累趋势来看，随着叶片发育成熟，不同土壤条件下烟叶类胡萝卜素各组分含量呈现整体下降趋势，这与前人的研究结果相一致［30-32］。但旱地紫色土条件下，在烟叶成熟后期，即打顶后40d时，β-胡萝卜素、叶黄素、新黄质的含量表现出上升趋势;RT-PCR的分析结果也支持了这一结果:类胡萝卜素合成关键酶基因PSY、PDS、ZEP等在打顶后30d和40d的表达有增强趋势。这可能是由于旱地紫色土质地偏黏，后期雨水过多，影响了烟叶的正常成熟衰老过程所致。在烟叶成熟的过程中，旱地紫色土烟叶中除紫黄质以外，β-胡萝卜素、叶黄素、新黄质的积累水平都高于水田砂壤土烟叶。然而，从基因表达来看，无论是类胡萝卜素合成相关基因PSY、PDS、LCYb、ZEP，还是类胡萝卜素降解相关基因CCD1，皆在水田砂壤土烟叶中更加活跃，表明水田砂壤土条件更有利于类胡萝卜素的合成和降解。由此推测，旱地紫色土烟叶中类胡萝卜素的高水平积累，主要是由于类胡萝卜素降解水平较低所致。烤后烟叶中，旱地紫色土类烟叶胡萝卜素的降解产物虽然总量上并不占优势，但种类上有较大差异。旱地紫色土烟叶中，如巨豆三烯酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二氢大马酮、香叶基丙酮等明显高于水田砂壤土烟叶，而β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、法尼基丙酮在水田砂壤土烟叶中含量较高。推测这些物质可能对紫色土烟叶风格特征的形成具有较大的影响。类胡萝卜素及其降解产物是烟叶重要的致香成分，对烟叶质量和风格的影响显著。近年来对江西烟叶检测分析结果表明，烟叶类胡萝卜素降解产物含量整体偏低(通信交流)，这可能是制约江西烟叶质量提高和特色彰显的主要原因之一。虽然旱地紫色土烟叶中类胡萝卜素较高，但烤后烟中类胡萝卜素降解产物总量并不高，这可能受到现有烘烤工艺的限制。因而，根据不同的土壤条件，进行个性化的烟草栽培管理以提高烟叶类胡萝卜素的积累水平，制定个性化烟叶调制策略以提高类胡萝卜素的降解效率，是彰显江西烟叶特色风格的重要途径之一。

参考文献:

［1］李润田．中国烟草地理［M］．北京:农业出版社，1988:30-31．LiRT．GeographyoftobaccoinChina［M］．Beijing:AgriculturalPublishingHouse，1988:30-31．

［2］逄涛，林茜，李勇．云南烟区不同土壤类型对K326烤烟主要化学成分的影响［J］．安徽农业科学，2012，40(16):8897-8898．

作者：王晶 杨永霞 冯小虎 程谦 杨胜男 何朋朋 崔红 单位：国家烟草栽培生理生化研究基地/河南农业大学烟草学院 江西省烟草公司抚州市公司 江西省抚州市烟草公司广昌分公司