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《菌物学报》2016年第四期
摘要：
采用杯碟法对大蝉虫草摇瓶发酵液的乙酸乙酯萃取物进行了抗菌实验，并利用质谱导向的制备高效液相色谱对该乙酸乙酯萃取物中的活性组分进行了跟踪分离得到抗菌活性化合物，根据该化合物的理化性质和波谱数据鉴定其化学结构。结果发现大蝉虫草发酵液的乙酸乙酯萃取物对白色念珠菌有明显的抑制作用，确定白色念珠菌为研究大蝉虫草发酵液抗菌活性的最佳指示菌；从大蝉虫草发酵液中分离得到的抗真菌活性化合物为多壳球菌素。
关键词：
大蝉虫草，抗菌活性，分离，鉴定，多球壳菌素
大蝉虫草Cordycepscicadae(Miq.)Massee分布于浙、皖、闽、赣等地，在浙江民间称“独角龙”。曾有学者认为大蝉虫草是蝉花Isariacicadae的有性型（幸兴球1975），但两者相似之处仅在于寄主都是蝉若虫。蝉花和大蝉虫草C.cicadae，无论在形态上，还是遗传水平上均有显著差别，是两个完全不同的种类（研究中）。王文元和刘晓光（1991）在杭州境内采到了大蝉虫草，并对其生长环境和形态特征作了描述，基本与幸兴球报道的一致，并证明大蝉虫草中含有肝糖、虫草酸和多种生物碱等活性物质。长期以来，大蝉虫草被人们同蝉花混淆，作为中药材进行了大量的药理研究。报道表明蝉花具有滋补强壮（陈万群和陈古荣1994）、抗疲劳抗应激（王砚等2001）、镇静催眠（刘广玉和胡菽英1991）、免疫调节（迟秋阳等1996）等作用，而对于大蝉虫草的药理作用还有待进一步研究。目前，国内外对于大蝉虫草研究的报道甚少，未见到对大蝉虫草抗真菌活性的报道，该菌也没有列入中国药用真菌名录（戴玉成和杨祝良2008）。虽然有少量用了大蝉虫草拉丁名的文献因为分类问题故不在研究背景之列，本研究首次对其抗真菌活性和抗菌物质分离鉴定进行了研究。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1材料、试剂：大蝉虫草Cordycepscicadae由安徽农业大学虫生真菌研究中心分离纯化，菌株命名编号为RCEF6202。枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、大肠杆菌Escherichiacoli、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis、黑曲霉Aspergillusniger由安徽农业大学生命科学学院提供；白色念珠菌Canidiaalbicans安徽医科大学微生物所提供。甲醇（色谱纯，美国Tedia公司），乙腈（色谱纯，美国Tedia公司），甲酸（色谱纯，美国Tedia公司），水为超纯水，其他试剂均为分析纯级。
1.1.2仪器与设备：SENCOR‐501真空旋转蒸发仪（上海申胜公司）；Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Agilent6460/1260液质联用仪（美国Agilent公司）；Waters600E‐2767质谱引导全自动制备纯化系统（美国Waters公司）；AgilentDD2600MHz超导傅立叶变换液体核磁共振波谱仪（美国Agilent公司）。
1.2方法
1.2.1大蝉虫草发酵液萃取物的制备：将培养好的大蝉虫草菌株RCEF6202配制成109CFU/mL的菌悬液，按15%（V/V）的接种量接种到装有250mL沙氏培养基的三角瓶中，置于25℃、150r/min恒温震荡培养箱中培养15d。抽滤获得滤液后，50℃真空旋转蒸发仪浓缩约至原体积的1/5，加入等体积的乙酸乙酯（秦建春等2006），室温，150r/min震荡萃取2h。静置分层后，100Hz，50℃超声至上清液澄清，吸取上清液。再按上述方法重复萃取一次，将两次萃取的上清液混合。利用SENCOR‐501真空旋转蒸发仪，50℃旋转蒸发浓缩至干，获得膏状物，得大蝉虫草发酵液乙酸乙酯萃取物约为1g。
1.2.2抗菌实验（杯碟法）：分别将培养好的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌配制成107CFU/mL的菌悬液，取该6种菌悬液200μL均匀涂布于装有固体LB培养基的平皿上，用无菌镊子夹取灭过菌的牛津杯放置于平皿菌层上，加入1.3.1中浓度为30mg/mL的大蝉虫草发酵液乙酸乙酯萃取物200μL于杯内。最后将涂布有枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌的平皿放入37℃恒温培养箱中培养24h；黑曲霉的平皿放入25℃恒温培养箱中培养120h；白色念珠菌的平皿放入25℃恒温培养箱中培养24h（陈安徽等2008）。每种菌设置3个平行组，同时每组设置乙酸乙酯对照。
1.2.3抗菌活性组分HPLC分离条件：利用Agilent1200高效液相色谱仪，确定大蝉虫草乙酸乙酯萃取物组分分离的条件：称取1.3.1中得到的乙酸乙酯萃取物300mg，加入10mL的乙酸乙酯，100Hz、50℃浸提1h，置于4℃冰箱过夜后，10000r/min离心10min取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，备用。分离条件：色谱柱为AgilentEclipseXDB‐C18（5μm，2.1mm×150mm），流动相为甲醇：水=4：6，两相中均加入5‰的甲酸，进样量：20μL，流速：0.5mL/min，检测波长：201nm，柱温：25℃。
1.2.4抗菌活性成分的跟踪分离：用Waters600E‐2767质谱引导全自动制备纯化系统分离1.3.1中得到的乙酸乙酯萃取物，流动相与1.2.3中相同，进样量1mL，流速为17mL/min。将每个峰收集的分离液进行浓缩，分别进行白色念珠菌的杯碟法抗菌试验，确定抗菌活性成分。
1.2.5抗菌活性成分的制备：根据1.2.4中确定的抗菌活性成分的分离条件，多批次进样，利用Waters600E‐2767质谱引导全自动制备纯化系统大批量分离制备，累计目标流分，浓缩，冷冻干燥得抗菌活性成分。
1.2.6抗菌活性成分的LC‐MS分析：利用Agilent6460/1260液质联用仪进行LC‐MS分析，得出该抗菌活性成分的分子量等初步理化性质。色谱条件：色谱柱：AgilentEclipseXDB‐C18（5μm，2.1mm×150mm），进样10μL，柱温25℃，流速0.5mL/min，流动相A：水，流动相B：乙腈，两相中均加入1‰的甲酸，洗脱条件：0–10min，10%–100%B；10–20min，100%B。质谱条件：流速10L/min，雾化气压35psi，阳离子模式采集，毛细管电压4000V，破碎电压215V，采集范围m/z：150–1000。
1.2.7抗菌活性成分的NMR分析：将目标化合物转移至核磁管中，加入氘代二甲基亚砜溶解，用AgilentDD2600MHz超导傅立叶变换液体核磁共振波谱仪测定其NMR谱图，得出该化合物的相关波谱数据，推断其化学结构。
2结果与分析
2.1大蝉虫草抗菌活性测试结果大蝉虫草发酵液乙酸乙酯萃取物的抗菌活性测试结果见表1。大蝉虫草发酵液乙酸乙酯萃取物对黑曲霉和白色念珠菌有抑菌作用，对其他供试菌均无抑菌作用，尤其对白色念珠菌的抑制作用最为明显。大蝉虫草发酵液乙酸乙酯萃取物抑制白色念珠菌的效果见图1。结果显示，牛津杯中加有乙酸乙酯萃取物的实验组平均抑菌圈直径约为27.83mm（以上抑菌圈直径均包括牛津杯的直径7.76mm在内），加乙酸乙酯的对照组的抑菌圈直径为零，即说明大蝉虫草发酵液乙酸乙酯萃取物有较强的抑制白色念珠菌的活性。因此，确定白色念珠菌为研究大蝉虫草发酵液抗菌活性的最佳指示菌。
2.2抗菌活性成分的制备分离及抗菌活性将1.2.1中的制备好的萃取液，按照1.2.3所述的色谱条件进行HPLC分析，图2为波长在201nm下的波谱图。利用Waters600E‐2767质谱引导全自动制备纯化系统，分离大蝉虫草乙酸乙酯萃取液形成不同的组分峰，收集每单个峰流出的组分，分别检测不同出峰时间收集的组分对白色念珠菌的抗菌活性，结果表明在10.5min对应的峰下收集的组分有抗菌活性，抗菌效果图见图3。图3中抑菌圈的平均直径约为18.85mm。
2.3抗菌活性成分的LC‐MS分析将2.2中10.5min左右收集分离得到的抗菌活性组分进行LC‐MS分析，该组分在阳离子模式下的质谱图如图4、图5所示，在阳离子模式下的离子峰（m/z）为402.4，根据ESI离子化特征，可知该峰为准分子离子峰[M+H]+,其相对分子质量应为401.4。
2.4抗菌活性成分的纯度检测取少量1.2.5中制备干燥的抗菌成分，溶于甲醇，用HPLC进行纯度分析，结果见图6。利用峰面积归一法计算出该抗菌活性成分的纯度为95.8%。
3结论
本研究对大蝉虫草发酵液抗真菌活性进行了研究，发现其对白色念珠菌有明显的抑制作用。同时，对大蝉虫草中抗真菌活性成分进行了分离并对目标化合物进行了结构鉴定。分离鉴定的过程采用了高效液相色谱探索分离条件。实验证明色谱柱为AgilentEclipseXDB‐C18（5μm，2.1mm×150mm），流动相为甲醇:水=4:6，两相中均加入5‰的甲酸，进样量：20μL，流速：0.5mL/min，检测波长：201nm的条件下，能分离出抗真菌成分。进一步通过质谱导向的制备纯化系统分离得到单一抗菌物质。综合MS和NMR等数据，可鉴定该抗菌活性化合物为多壳球菌素。多球壳菌素已被证实能有效地抑制白色链珠菌的生长，显示多种显著的药理作用（徐红娟等2010；Banfietal.1985），已于临床广泛研究。本实验从大蝉虫草中分离出多球壳菌素尚属首次，为该虫草资源的研究与开发提供实验依据。
作者：胡凯 程文明 李春如 单位：安徽农业大学生命科学学院 安徽医科大学药学院 浙江泛亚生命科学研究院