海水鱼腌制过程细菌群落多样性的探讨范文

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摘要:目的揭示海水鱼腌制过程细菌群落组成及优势菌变化规律。方法采用构建16SrDNA基因克隆文库的分析方法检测分析不同盐鱼比的海水鱼腌制过程中细菌群落多样性、优势菌群及其变化规律。结果1∶4和1∶8盐鱼比腌制海水鱼前期(5d)优势菌群都为嗜冷杆菌属，优势菌种为养料嗜冷杆菌;1∶4盐鱼比腌制海水鱼中期(10d)优势菌群为嗜冷杆菌属和假单胞菌属，优势菌种为荧光假单胞菌和养料嗜冷杆菌，1∶8盐鱼比腌制海水鱼中期(10d)优势菌群为嗜冷杆菌属，优势菌种为养料嗜冷杆菌;2个盐鱼比腌制海水鱼中后期(15d)优势菌群都为嗜冷杆菌属，优势菌种为养料嗜冷杆菌;1∶4盐鱼比腌制海水鱼后期(20d)优势菌群为嗜冷杆菌属，优势菌种为Psychrobactersp．P2－18(2011)，1∶8盐鱼比腌制海水鱼后期(20d)优势菌群为嗜冷杆菌属，优势菌种为养料嗜冷杆菌。结论通过16SrDNA克隆文库分析方法可检测分析海水鱼腌制过程细菌群落多样性及变化趋势，对腌制海水鱼的质量保持及食用安全具有重要意义。关键词:海水鱼腌制;16SrDNA基因克隆文库;细菌群落多样性腌制海产品是一种传统的加工保藏产品，其不仅保存了海产品丰富的营养价值，且具有独特的口感和风味，深受大众的喜爱，具有非常广泛的市场需求［1］。腌制过程是以食盐为主要辅料，在海产品表面直接撒上适量的固体食盐(干腌法)或者将海产品浸入食盐水中(湿腌法)［2］。海产品通过腌制能抑制腐败菌生长，从而提高食品的防腐性能，延长保质期，改善产品风味。浙江东南沿海地区食用腌制海产品非常普遍，例如咸带鱼、咸黄鱼、咸鳓鱼等产品［3－5］。海产品腌制过程中作用的细菌菌群种类复杂多样，有害菌群的大量繁殖会危害人体健康。普通的培养法不能完全反应菌群种类的多样性，很多菌群无法用传统培养的方法生长［6］，分子生物学技术突破了传统方法无法得到微生物纯培养的限制，故广泛应用于不同样品生态系统中微生物多样性的调查［7，8］。16SrDNA序列既有保守性，又具有高变性，保守性可以反映生物物种的亲缘关系，并给分析系统发育提供了线索，而高变性能则可以表明生物物种的特征核酸序列，并且具有种、属的结构特征，因此，高变性是生物种属鉴定的分子基础［9］。16SrDNA序列分析目前已成为分子鉴定和系统学研究中最具权威性和准确性的检测方法之一［10］。16SrDNA基因克隆文库分析方法能较好应用于微生物的分类鉴定和系统发育关系［11］，据文献报道在土壤微生物系统、海洋微生物系统等环境微生物群落分析上均有应用［12－14］。本文利用分子生物学技术，采用16SrDNA基因克隆文库分析方法［15］，研究海产品腌制过程中细菌群落的多样性及其变化，可为腌制海产品的食用安全性、品质控制等提供理论依据。

1材料与方法

1．1材料

海水鱼购自中国浙江舟山市农贸市场。

1．2仪器与试剂

MyCyclerPCR仪(美国Bio－Rod公司);GelDocXR凝胶成像系统(美国Bio－Rod公司);Mini－SubCellGT电泳仪(美国Bio－Rod公司);MicrofellR离心机(德国BECKMANCOULTER公司)。Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(批号:SK8255);DreamTaq－TMDNA聚合酶(批号:EP0-702);Dntp(批号:D0056);SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(批号:SK8131);SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(批号:SK8191);pMD18－TVector连接试剂盒(批号:D101A);引物由中国上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1．3方法

1．3．1海水鱼的腌制

采用传统干腌法腌制海水鱼。将市场购买的海水鱼(带鱼和黄鱼)洗净并去除内脏，称重并放入坛中，以一层鱼一层盐的顺序进行放置，盐鱼比分别为1∶4和1∶8。

1．3．2样品总DNA提取

采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，按试剂盒给定步骤，取0d、5d、10d、15d、20d的腌制海水鱼制成的1∶10样品液5ml进行总DNA的提取。

1．3．3PCR扩增

1．3．3．1扩增通用引物

16SrDNA扩增通用引物具体为7F(5'－CAGAGTTTGATCCTGGCT－3')和1540R(5'－AGGAGGTGATCCAGCCGCA－3')。

1．3．3．2PCR扩增反应体系

PCR扩增所用反应体系:10×Buffer(含Mg2+)2．5μl、dNTP(各2．5mmol/L)1μl、DreamTaq－TMDNA聚合酶0．2μl、上游引物及下游引物(10μmol/L)各0．5μl、模板DNA0．5μl，用无菌ddH2O补足25μl体系。

1．3．3．3PCR循环条件PCR反应的循环条件:94℃预变性4min，30个循环(94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min)，72℃修复延伸10min。

1．3．4纯化回收采用1%琼脂糖电泳，150V、100mA20min电泳观察。PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，采用纯化试剂盒对目的条带进行纯化回收。

1．3．5克隆测序

按TakarapMD18－TVector连接试剂盒操作将纯化后的PCR产物与pMD18－T载体连接，并转化感受态细胞E．coliJM109。将连接转化后的菌液涂布在预先用20μl100mmol/LIPTG和100μl20mg/mlX－gal涂布的氨苄青霉素平板上于37℃培养过夜。按SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒操作提取质粒，用引物M13+和M13－进行扩增测序。5个时期共检测300个阳性克隆。1．4统计学处理测得序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，分析出克隆所属物种的系统位置和与之最近似的种类。

2结果

2．1不同盐鱼比样品总DNA提取和PCR扩增将1∶4和1∶82个盐鱼比的样品不同腌制时期(0d、5d、10d、15d、20d)样品稀释液提取的总DNA用通用引物进行扩增，PCR扩增产物经电泳检测如图1所示。从检测结果发现，在约1500bp处均出现了荧光条带，适合16SrDNA克隆文库的构建。

2．216SrDNA克隆文库构建

2．2．11∶4盐鱼比腌制过程细菌16SrDNA克隆文库构建1∶4盐鱼比的海水鱼腌制的5个不同时期150个阳性克隆子的测序结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，150个克隆子与GenBank数据库中已知细菌的16SrDNA序列相似性为95%～100%。1∶4盐鱼比腌制海水鱼不同时期细菌群落测定结果见表1。1∶4盐鱼比腌制海水鱼，腌制开始(0d)主要菌属有芽胞梭菌属、假单胞菌属、沙雷菌属、金黄杆菌属、嗜冷杆菌属，优势菌属为芽胞梭菌属和假单胞菌属，其中芽胞梭菌属占53%，假单胞菌属占30%，优势菌属中的优势菌种分别为腐化芽胞梭菌和莓实假单胞菌;腌制5d主要菌属有嗜冷杆菌属、芽胞梭菌属，优势菌属为嗜冷杆菌属，占77%，芽胞梭菌属占23%，优势菌属中的优势菌种为养料嗜冷杆菌;腌制10d主要菌属有假单胞菌属、嗜冷杆菌属、芽胞梭菌属，优势菌属为假单胞菌属和嗜冷杆菌属，其中假单胞菌属占47%，嗜冷杆菌属占37%，芽胞梭菌属占16%，优势菌属中的优势菌种分别为荧光假单胞菌和养料嗜冷杆菌;腌制15d主要菌属有嗜冷杆菌属、芽胞梭菌属、藻青菌属，优势菌属为嗜冷杆菌属，占67%，芽胞梭菌属占30%，优势菌属中的优势菌种依旧为养料嗜冷杆菌;腌制20d主要菌属有嗜冷杆菌属、芽胞梭菌属、藻青菌属，优势菌属为嗜冷杆菌属，占77%，芽胞梭菌属占20%，优势菌属中的优势菌种则发生了变化，由养料嗜冷杆菌变为Psychrobactersp．P2－18(2011)。

2．2．21∶8盐鱼比腌制过程细菌16SrDNA克隆文库构建1∶8盐鱼比的海水鱼腌制的5个不同时期150个阳性克隆子的测序结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，150个克隆子与GenBank数据库中已知细菌的16SrDNA序列相似性为92%～100%。1∶8盐鱼比腌制海水鱼不同时期细菌群落测定结果见表2。1∶8盐鱼比腌制海水鱼，腌制开始(0d)主要菌属有芽胞梭菌属、嗜冷杆菌属、假单胞菌属、紫色杆菌属，优势菌属为芽胞梭菌属，占83%，其他菌属占17%，优势菌属中的优势菌种为解朊梭菌;腌制5d主要菌属有嗜冷杆菌属、假单胞菌属，芽胞八叠球菌属，优势菌属为嗜冷杆菌属，占70%，假单胞菌属和芽胞八叠球菌属分别占17%和13%，优势菌属中的优势菌种为养料嗜冷杆菌;腌制10d主要菌属有嗜冷杆菌属、假单胞菌属，优势菌属为嗜冷杆菌属，占93%，假单胞菌属占7%，优势菌属中的优势菌种依旧为养料嗜冷杆菌;腌制15d主要菌属有嗜冷杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属，优势菌属为嗜冷杆菌属，占90%，其他菌属占10%，养料嗜冷杆菌在嗜冷杆菌属中仍然占绝对优势;腌制20d主要菌属有嗜冷杆菌属、葡萄球菌属、藻青菌属，优势菌属仍为嗜冷杆菌属，占77%，葡萄球菌属占20%，优势菌属中的优势菌种仍然为养料嗜冷杆菌。种，1∶8盐鱼比腌制体系不同时期总共检测出7个菌属29个菌种，盐度高低对腌制体系菌群构成有一定影响，低盐度的腌制体系菌群构成比高盐度的腌制体系菌群构成更复杂，细菌种类更多。腌制前期(5d)，2个盐鱼比的腌制体系菌群组成不同，但优势菌属和优势菌种一致，优势菌属均为嗜冷杆菌属，优势菌种均为养料嗜冷杆菌。

腌制中期(10d)，1∶8盐鱼比腌制体系的菌群组成比1∶4盐鱼比腌制体系的菌群组成少了芽胞梭菌属，1∶4盐鱼比腌制体系的优势菌属除了嗜冷杆菌属外增加了假单胞菌属，而1∶8盐鱼比腌制体系的优势菌属只有嗜冷杆菌属，两者有相同优势菌属嗜冷杆菌属和相同的优势菌种养料嗜冷杆菌，且养料嗜冷杆菌的占比较前一时期有所增加。腌制中后期(15d)，2个盐鱼比的腌制体系菌群组成依然不同，但优势菌属和优势菌种一致均为嗜冷杆菌属和养料嗜冷杆菌，且优势菌种养料嗜冷杆菌的占比都继续增加。腌制后期(20d)，2个盐鱼比的腌制体系菌群都由3个菌属组成，其中2个菌属相同，只有1个菌属不同，而优势菌属都相同为嗜冷杆菌属，优势菌种有所不同，1∶4盐鱼比腌制体系的优势菌种为Psychrobactersp．P2－18(2011)，1∶8盐鱼比腌制体系的优势菌种依然为养料嗜冷杆菌，且养料嗜冷杆菌的占比较上一时期都有所下降。上述表明，不同盐度对海水鱼腌制过程中的菌群构成有所影响，但不影响优势菌属及菌群的动态变化趋势，优势菌属嗜冷杆菌属在不同盐度的腌制过程中均占优势地位，且优势菌种养料嗜冷杆菌的变化趋势相同。上述研究表明，16SrDNA克隆文库分析方法可以较好分析海水鱼腌制过程中细菌群落结构，菌群变化规律，一定程度上打破传统培养方法检测的局限性［16－17］。通过分析细菌群落多样性及变化趋势对腌制海水鱼的质量保持及食用安全具有重要意义。

作者：孙瑛；王萍亚；黄朱梁；彭志兰；崔洁 单位：舟山市食品药品检验检测研究院