环境微生物抗生素及重金属抗性研究范文

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摘要：长期以来，因抗生素和重金属药物的过度使用，致使微生物产生耐药性，耐药细菌的蔓延已成为全人类的重大公共卫生安全议题。人们对微生物的抗生素抗性、重金属抗性进行了大量研究。综述了目前微生物抗生素抗性、重金属抗性以及抗生素与重金属协同抗性方面的研究进展，重点论述了微生物重金属抗性的分子机制。结合课题组相关研究进展对未来研究进行了展望，以期为现有抗性微生物所致危害的减轻和未来抗性相关研究的深入提供参考。

关键词：抗生素；重金属；抗性；抗生素抗性基因；共选择

引言

随着人们生活水平的日益提高，环境问题逐渐成为人们关注的焦点，因药物滥用引起的微生物耐药性越来越受到人们的关注。抗生素是目前使用量最多、应用面最广泛的药物，被使用的抗生素，高达75％被人体和动物排出，最终进入环境。环境中抗生素的残留，使一些微生物产生耐药性，甚至引发了超级细菌的产生，如MRSA，VRE，E.coliNDM-1等，它们能抵抗多种抗生素，E.coliNDM-1甚至是无药可医[1]。除抗生素外，一些金属离子也被广泛应用于医药和其他领域中，如Ag，Sb，Bi等金属化合物用于感染、寄生虫、溃疡等治疗[2]，Cu，Zn，Cd，As等金属化合物用作生长促进剂、杀菌剂、除草剂和抗菌剂等[3]。金属元素 的开发与利用导致环境中出现了重金属累积，因化学性质稳定，在环境中不易降解，更易使微生物产生抗性。抗生素和抗菌金属的复合作用致使一些微生物出现了双重抗性，如鱼、虾体内及沉积物中分离的气单胞菌属(Aeromonasspp.)[4]，医院分离的伤寒沙门菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium)[5]、洋葱伯克氏菌(Burkholderiacepacia)[6]等，给环境和人类健康带来了巨大的威胁。基因型决定着表型，因抗性基因可在不同细菌间转移、传播和自我扩增的生物学特性，给人类健康带来了巨大的潜在威胁[7]。综合已有研究，结合抗生素与重金属抗性研究进展，本文重点对微生物金属抗性的分子机制进行论述，以期为有效减缓微生物耐药性的发展及抗性元件在环境中的扩散作出贡献。

1.微生物抗生素抗性的研究进展

自1937年第一批磺胺类药物问世以来，即出现了磺胺抗性的相关报道，随后陆续发现多种抗性细菌[8]。总结2000年之前一百多年间几个不同时期微生物的耐药性，发现随着抗生素的使用，微生物的耐药种类、耐药率呈现出显著递增的趋势[9]。近年来新型抗生素的发现和开发速度持续下降，而抗生素抗性基因(AntibioticResistanceGenes，ARGs)却快速出现和扩散，如英国某奶牛场的126株大肠杆菌中存在着blaCTX-M，blaTEM和blaOXA基因，控制着超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的产生[10]；巴西南部农场的135株大肠杆菌中，检测到了基因blaCMY-M2、blaTEM-1和qnrS存在[11]；2016年来自中国动物的大肠杆菌（EscherichiacoliSHP45）mcr-1基因的报道[12]，预示着最后一道抗生素防线多粘菌素将失去作用。ARGs的出现和扩散极大地影响了抗生素的治疗效果，威胁着人类的健康，质粒、整合子、转座子这些抗性基因的主要携带者加速了抗性基因在不同微生物间转移和传播，质粒的自我转移性、int1和int2整合子中耐药基因盒的存在使它们成为了抗性基因的主要传递者[13]。

2.微生物重金属抗性的研究进展

自1960年人类从外伤病人的伤口分离出抗Hg金黄色葡萄球菌[14]以来，人类就开始了对微生物金属抗性机制的研究。到目前为止，人们有关微生物的Hg，Cu，Ag，As，Zn等金属的抗性机制进行了大量的研究。对耐Hg细菌研究表明，微生物可将Hg2+转化成不溶性的Hg，其在室温下可作为蒸气从细菌细胞中挥发出来[15]。据DAS等[16]所述，窄谱mer操纵子和广谱mer操纵子调控着耐Hg细菌对Hg的挥发。窄谱mer操纵子赋予细菌对无机Hg的抗性，Hg2+与细菌细胞周质空间的MerP结合，MerP将其转运至质膜的MerT上，MerT上的Hg2+通过与跨膜螺旋上的半胱氨酸结合而进入细胞内，在细胞内被merA编码的Hg还原酶还原为Hg0，MerR调控Hg抗性结构基因的表达，MerD起到二次调节的作用。另一个位于merA基因上游的Hg2+转运体merH，通过与半胱氨酸残基结合转运Hg2+并能与merA本身共表达。广谱mer操纵子除包含与窄谱操纵子相似的基因外，还存在其他基因，如merB基因编码的有机Hg（R-Hg）裂解酶裂解C-Hg键，Hg2+被还原为Hg0。近年来的研究发现merB基因仅存在于少数的耐Hg细菌中[17-18]，表明R-Hg对大多数细菌仍存在着抑制、杀伤作用。细菌细胞具有控制正常Cu含量的系统，以抵抗高水平的Cu对其带来的毒害作用。据HOBMAN等[19]所述，4个系统维持着肠杆菌科细菌的Cu稳态，即cus，cue，pco和cop。Cus系统中基因cusR和cusS调节基因簇cusCFBA的表达，表达后的CusCFBA蛋白质控制细胞内Cu2+的流出与细胞外H+的流入，但该系统仅在好氧条件下赋予细菌在中低等Cu水平的抗性。Cue，cop系统是调节大肠杆菌Cu抗性的主要机制，系统中cueO基因编码氧化Cu+的多Cu氧化酶将Cu+氧化为毒性较小的Cu2+，再通过copA基因编码的P型ATP酶驱动Cu外排系统将细胞质中的Cu排出细胞。Pco系统中含有多个pco基因簇，作为补充为大肠杆菌提供进一步的Cu抗性。除上述提到的一些铜抗性基因，细菌中还存在着copB，copC，copD，cueR，cutC，cutF等基因[20]，赋予其Cu抗性。NEUBERT等[20]发现铜分子伴侣CupA可促进Cu2+还原成Cu1+，进而促进铜的减少。Ag抗性由细菌中的sil基因座（silPGABFCRSE）赋予，基因座中的3个转录单位（silCFBAGP，silRS，silE）由不同的启动子表达并相互作用，形成ATPase外排泵，将Ag+泵出细胞外，从而赋予细菌Ag抗性[21]。通过序列分析与定点诱变发现SilE上含组氨酸与甲硫氨酸的基序可促进SilE与Ag+的结合，使SilE类似于一个吸收Ag+的“分子海绵”[22]。SAEB等[20]发现一些细菌中oprB，oprM和cusC_1基因编码的CusC蛋白所决定的外排泵系统可同时赋予细菌Cu/Ag抗性。As抗性一般由ars操纵子调控，arsC编码的As还原酶还原As5+为As3+，随后arsB编码的亚As酸盐逆向转运蛋白ArsB或ArsAB将As3+排出；一些细菌还可通过arsM编码的甲基转移酶ArsM使甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移至As3+，随后被挥发或被甲基As酸盐转运蛋白ArsP排出；某些细菌体内还存在着gapdh和arsJ组成的双基因系统，通过gapdh调控的生化反应和ArsJ的外排作用赋予对V价R-As的抗性[23]。Zn抗性被认为是由Zn进入和Zn外排泵的组合系统控制，如ZntA，ZntB等[24]。LU等[25]研究发现ZntA不仅参与细菌的Zn稳态，还能传输非生理性底物Cd和Pb，还发现存在于苜蓿中华根瘤菌（SinorhizobiummelilotiCCNWSX0020）中编码Cu+/Ag+转运蛋白的一个基因copA1b，对Cu抗性没有任何贡献，却有助于Zn，Cd和Pb的耐受性。Cd，Cr，Pb，Ni等金属相对来说使用量较少，微生物相关的抗性机制研究也相对较少，据DAS等所述[16]，也是由相关的操纵子与基因赋予。如Cd抗性由质粒携带的cad操纵子和czc操纵子调控，Pb抗性由pbr操纵子赋予，Cr抗性由chrA基因编码的Cr酸盐外排蛋白控制，Ni抗性由cnrYHXCBAT基因系统编码的cnrCBA外排泵介导。CABRAL等[26]对巴西红树林沉积物中的微生物群落进行宏基因组与转录组分析时，鉴定出编码Zn，Cd，Co抗性蛋白的基因czcR，czcD，czcB，czcC和czcA以及阳离子外排系统蛋白cusA基因。由上可见，人们对微生物金属抗性机制的研究已经取得了很大进步，但仍需进一步探究与微生物金属抗性相关的基因以及机制，以期从分子角度为医学及环境污染问题提供解决方案。

3.微生物抗生素抗性与重金属抗性的协同选择研究进展

人们最初研究微生物对金属Hg的抗性时，发现含有质粒R100的微生物具有Hg抗性的同时，还对链霉素、四环素、磺胺和氯霉素有抗性[27]。随后人们陆续发现一些大肠杆菌具有类似的抗性[28]。如今越来越多的具有重金属和抗生素协同抗性的细菌被筛选出来[4-6]。根据研究者对现有抗性机制的解析结果，协同抗性、交叉抵制、协同调控和生物膜的诱导4类机制控制着微生物的多重耐药性[29]。近年来，人们还发现在重金属残留地区，ARGs的水平会随着重金属污染水平的增加而增加。如GAO等[30]研究环境中残留的抗生素和重金属对城市污水中红霉素抗性基因（ERY-ARGs）的影响时，发现ere（A），ere（B），erm（B）等ERY-ARGs丰度与Zn残留水平呈现出显著的正相关；ZHOU等[31]在研究重金属的选择对ARGs的流行与传播时，发现ARGs的数量与重金属的总浓度具有正相关性；ZHANG等[32]研究垃圾渗滤液处理厂及周围土壤和地表水中ARGs发生时，发现sul2基因与Zn，Cr呈显著的正相关，同时还发现int1的丰度与金属Zn，Ni，Cr也具有显著的正相关性。现阶段仍需进一步探究重金属水平对ARGs丰度的影响，以评估ARGs对环境和人类可能带来的威胁。

4.微生物抗性的未来研究展望

微生物的抗生素抗性、重金属抗性以及抗生素与重金属的协同抗性已经成为了威胁人类、动植物和环境的全球性问题。医药、农业、畜牧业领域中抗生素与重金属药物的合理使用，环境中抗生素与重金属的残留累积是目前环境治理的重中之重，它不是某个组织、某个国家的问题，应是全人类为之奋斗并解决的问题。本课题组于近期对某城市污水河道中的大肠杆菌抗生素耐药性进行了分析，结果显示检测的17种抗生素中，69.1%的分离株对其中的1~13种抗生素具有抗性（结果另文发表）。与2013，2014年对该流域的大肠杆菌抗生素抗性检测结果[33]比较，显示目前的大肠杆菌对11种抗生素抗性呈现大幅度的下降，表明抗生素的减量使用及污水河道治理对微生物的耐药性存在着显著的消减作用。尽管已有大量研究报道了金属压力可以增加微生物的抗生素抗性，但其中仅少数研究确定了一些重金属的浓度水平与某些抗生素抗性的关联，本课题组检测了上述污水河道大肠杆菌对Cu，Hg，Ag，Zn这4种重金属的抗性，结果显示大多数的分离菌株对4种重金属无抗性，仅少数的分离菌株对Ag和Hg呈现出较弱程度的抗性（结果另文发表），抗生素和金属表型数据未呈现显著关联。到目前为止大多数的研究仍缺乏金属抗性与抗生素抗性表型及基因型对应关系的数据，这方面研究亟待加强。同时需进一步研究和了解水平遗传元件（质粒、整合子和转座子）的性质，进一步开展环境中抗性基因和多重抗性污染水平的研究，为更加有效地遏制抗性基因在环境中的扩散，评估复合污染和多重抗性带来的生态风险与公共健康威胁提供理论依据。

【参考文献】

[2]柴晓华,王飞利,黄洁,等.金属药物研究新进展[J].化学试剂,2008,30(2):99-104.

[7]吕亮,张静,姜浩.土壤中兽用抗生素污染的研究进展[J].环境科技,2010,23(2):68–70.

[9]田宝玉,马荣琴.环境微生物的抗生素抗性和抗性组[J].中国生物工程杂志,2015,35(10):108–114.

[29]张佳奇,徐艳，罗义,等.重金属协同选择环境细菌抗生素抗性及其机制研究进展[J].农业环境科学学报,2016,35(3):409-418.

[33]徐国峰.碳青霉烯不敏感大肠杆菌分子特征及NDM-1适应性代价研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2015.

作者：王小垒 李凤姿 何家乐 刘言 杨洪岩 单位：东北林业大学