浅析湿地微生物多样性的研究范文

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摘要：描述了现在湿地微生物活性的研究状况、环境因子对微生物群落多样性产生的影响、湿地环境下功能性微生物的探究情况。重点就目前应用比较多的测定微生物多样性的研究方法如传统培养法、磷脂脂肪酸法、高通量测序技术等作出细致描述并针对各种研究方法的优势及劣势进行了比对分析。根据当前微生物数量和多样性的检查方式，在以后的分析过程中引进更优良的技术同时找到新的研究方法，以此来发现微生物种群很多未知的领域。

关键词：湿地；微生物多样性；分子生物学；环境因子

湿地兼具水生生态系统和陆地生态系统的特性，能调节局部区域气候和维持群落微生物多样性[1]。微生物多样性包括微生物遗传的多样性，还包含了群落组成的变异、营养需求和供给水平、互相影响的复杂性以及共位群带来的生物复杂性[2]。湿地微生物的研究有助于人们了解湿地微生物与其他因子间是否存在协同作用，从而构建更高效稳定的湿地系统。

1湿地微生物群落的研究方法

1.1传统培养法培养法一般采用的培养基内所含的营养物质不同，针对能够在培养基环境下生长的微生物进行研究。这种方式主要针对具有一种作用的微生物或某种病原菌的研究。但培养法的局限在于无法探明微生物的整体群落结构，且目前技术可培养微生物种类尚且不足微生物总体的百分之一。

1.2微生物群落生理代谢的研究方法1.2.1磷脂脂肪酸技术磷脂几乎是所有具有活性细胞细胞膜的组成要素，一般伴着细胞凋亡逐渐脱落分解[3]。磷脂脂肪酸技术利用有机溶剂将活体微生物中的磷脂脂肪酸浸提出来经分离纯化后，对磷脂脂肪酸图谱进行解析从而了解微生物群落结构以及生物量[4]。在2001年，DuongruitaiNicomrat借助PLFA分析在废弃矿山中湿地微生物的种类，结果显示真菌和细菌是湿地系统中的主要种类，古细菌所占的相对丰度尚未到总微生物整体的0.01%[5]。该技术适用于批量分析，能够反映出湿地污染状况的改变。但目前还无法通过PLFA技术对微生物类群精准鉴定到种，并且土壤中有植物残体存在，其中的磷脂脂肪酸会产生干扰。因此将PLFA技术与分子生物学技术结合，会对湿地微生物群落的多样性有更加全面的认识。1.2.2BIOLOG碳素利用法BIOLOG碳素利用法是基于不同微生物利用碳源能力的区别以及代谢差异。该方法具有灵敏度高分辨力强等优点，能够尽可能保证微生物可以通过以往的代谢方式进行生产，这种形式通常适用于评估土壤环境功能及微生物的群落结构。但是该方法使用中也存在着底物是否氧化完全等问题

1.3分子生物学方法1.3.1荧光原位杂交技术（FISH）FISH方法主要借助寡核苷酸探针再结合核酸，通过特殊的荧光显微镜发现所要寻找的DNA或RNA分子[6]。FISH方法现在主要是在特定环境条件下辨别微生物类群和定量检查种群密度，描述水平细致的条件符合当前要求。荧光原位杂交技术的优势在于不需要选择核酸，还能确保微生物细胞结构和状态能保证基本完整[7]。但该技术易受探针长度、杂交温度和时间等因素的影响。1.3.2变性梯度凝胶电泳(DGGE)DGGE的原理是当达到DNA双螺旋分离所需温度的最小值时，双链DNA会出现分解现象，最后形成的单链DNA无法在凝胶中顺畅运行，同时螺旋位置分离是根据双链基因的碱基序列进行执行的。因此观察DGGE指纹图谱的条带数目可以发现各种样品细菌群落所具有的相同一面。然而在进行PCR产物电泳时会导致共性迁移现象出现，对结果的准确性有一定的影响[8]。在2003年，Ibekwe通过PCR-DGGE技术针对氨单加氧酶基因(amoA)扩增条以及16SrRNA基因和带都分别进行研究，分析湿地环境下细菌种群的总数目以及氨氧化后的细菌种群出现了哪些改变[9]。1.3.3荧光定量PCR多聚酶链式反应简称PCR技术，是上世纪发展起来的一种体外扩增特异性DN段的技术。Ochsenreite等研究了18处陆地环境中泉古菌的多样性和丰度，利用qPCR确定了泉古菌在沙地根际和土壤中的相对丰度[10]。qPCR精确性高、特异性强且后期操作简单，同时可从基因水平对微生物功能基因定量分析，特别是对氮循环相关功能菌群定量分析[11]。其优点在于可以在一个反应中进行一个以上基因的定量检测。但其反应成本过高，实验设计较为复杂。1.3.4高通量测序技术由于近些年来很多学者利用变性梯度凝胶电泳和荧光定量PCR等技术分析湿地微生物种类，然而该形式对微生物品种无法实现定性和定量研究同时进行。HelicoBioScience企业2008在Science杂志发表了其研发的在全内反射显微镜的测序技术-单分子测序技术的基础上，总共发现了28万条序列信息，打开了在单分子且通量高的情况下进行测量序列的大门。然而在通量高情况下检测的碱基序列如何去解读，也是科研工作者面临的科学问题。

2展望

湿地环境中的微生物对维持湿地体系的基本运作以及构造都发挥至关重要的功能。现在针对功能性微生物的调查和分析存在欠缺，在湿地环境中，菌落的功能性是整个湿地系统运行的关键，所以研发借助功能基因主导的各种分子技术手段进行探索各种湿地环境中微生物种群的功能特征和差异，辨别和掌握微生物给湿地系统带来的去污效果，有利于将来对湿地进行开发、利用等方面工作的顺利开展。

参考文献： 

［1］陈宜瑜，吕宪国.湿地功能与湿地科学的研究方向[J].湿地科学，2003，1(1):7-11.

［5］颜慧，蔡祖聪，钟文辉.磷脂脂肪酸分析方法及其在土壤微生物多样性研究中的应用[J].土壤学报，2006，43(5):851-859.

［7］钟文辉，王薇，林先贵，等.核酸分析方法在土壤微生物多样性研究中的应用[J].土壤学报，2009，46(2):334-143.

［8］高淑静，吴凤芝.PCR-DGGE技术在土壤微生物多样性研究中的应用[J].生物信息学，2008，55(4):174-175.

作者：赵思宇 马信 陈星宇 王欣钰 孙长龙 张阳 单位： 沈阳师范大学