水溶液中白藜芦醇稳定性研究范文
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《工业微生物杂志》2016年第5期
摘要:
白藜芦醇是一种具有较强抗氧化和防癌、抗癌等生理活性的植物天然产物，其功能与生产是当前的研究热点;然而，白藜芦醇的光稳定性和热稳定性较差。在微生物发酵生产及存储过程中需要采取特殊的工艺，以防止其降解，使得发酵及存储工艺复杂化，增加了成本。本研究对发酵及存储过程中的各类条件，如温度、pH、培养基成分及大肠杆菌对白藜芦醇的降解情况进行了初步的研究;使用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱，对白藜芦醇的降解产物进行了分析。本研究可作为基础资料，为降低发酵生产及存储过程中白藜芦醇的降解提供重要参考。
关键词:
白藜芦醇;降解;液相色谱-离子阱-飞行时间质谱;白藜芦醇二聚体
白藜芦醇是植物界分布较广的羟基二苯乙烯类多酚化合物，来源于花生、葡萄、虎杖和桑葚等植物，是一种植物抗毒素，对革兰氏阳性细菌的生长有一定抑制作用，具有抗炎、抗心血管疾病等多种生理活性［1，2］。同时，白藜芦醇也具有较强的抗氧化［3］和防癌抗癌［4］的生理活性，可作为肿瘤的化学预防剂，亦可降低和防治动脉粥样硬化心血管疾病。白藜芦醇有反式和顺式两种异构体，生理活性方面反式强于顺式。近年来，白藜芦醇的功能和生产成了研究的热点［5］。目前市场上的白藜芦醇多来源于植物提取法，由于其在植物中含量较低，导致其生产成本较高，无法满足日益增长的市场需求。因此，采用合成生物学方法改造微生物合成白藜芦醇成为一个重要的选择［6］。已有多篇文献报道利用大肠杆菌、酿酒酵母等微生物异源合成白藜芦醇［7，8］。已有的研究表明，白藜芦醇在水溶液中的光稳定性和热稳定性均较差［9］。白藜芦醇的合成过程中需要消耗大量的能量，需要在好氧的水相体系中进行。这使得白藜芦醇在水溶液中的积累和其合成产生了不可避免的矛盾［10］，增加了白藜芦醇高效发酵生产的过程的复杂性，导致生产过程中必须采取严格优化的发酵条件及培养基，以尽量减少白藜芦醇的损失［11］。本研究对白藜芦醇在不同温度、pH及培养基成分中降解速率进行了初步研究，并考察了大肠杆菌对白藜芦醇降解的影响。进一步通过液相色谱-离子阱-飞行时间质谱联用，分析了白藜芦醇降解的主要产物。本研究结果有助于理解微生物异源发酵生产白藜芦醇过程中各种环境因子对白藜芦醇降解的影响，对强化发酵过程中目标产物的积累具有重要的参考价值。此外，相关结果也将对减少食品加工和贮存过程中白藜芦醇的降解程度提供必要的依据。
1材料与方法
1．1菌种
大肠杆菌BL21(DE3)，用于考察大肠杆菌对白藜芦醇降解的影响。
1．2仪器与试剂
白藜芦醇标样购自Sigma-Aldrich公司，蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司，M9培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，甲醇和乙腈(色谱纯)购自MerckKGaA公司，流动相所用超纯水由Milli-QUF-Plus超纯水系统制备所得(电阻率＞18MΩ•cm)。其他常规试剂为国产分析纯。UFLC购自日本Shimadzu公司，配备一台LC-20AD二元泵、一台SIL-20AC自动进样器以及一台CTO-20AC柱温箱。质谱设备采用日本Shimadzu公司的离子阱-飞行时间质谱，采用电喷雾离子源(ESI)。
1．3培养基及样品制备
LB培养基:10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl。M9培养基:10×M9盐200mL，1mol/L硫酸镁2mL，1mol/L氯化钙100μL，以无菌水定容至1L。10×M9盐:64g磷酸氢二钠，15g磷酸二氢钾，2．5g氯化钠，5．0g氯化铵，以去离子水定容至1L后灭菌。10×M9盐、硫酸镁和氯化钙分别灭菌后混合，防止沉淀。蛋白胨水溶液:10g/L蛋白胨。酵母粉水溶液:5g/L酵母提取物。白藜芦醇储备液:精确称量10mg白藜芦醇标准品，以乙醇溶解并定容于10mL容量瓶中，获得质量浓度为1g/L的储备液，于－20℃下避光保存。由于白藜芦醇的光稳定性极差，所有本实验中的白藜芦醇溶液均储存于铝箔包裹的离心管中，实验中全程避光。
1．4温度及pH对白藜芦醇降解的影响
用PBS缓冲液(pH7．4)将白藜芦醇储备液稀释至50mg/L，分装至铝箔包裹的14mL培养管中，分别放置于25℃、30℃、37℃和42℃条件下，用于检测温度对白藜芦醇降解的影响。用pH分别为3．0、5．0、7．0、9．0和11．0的缓冲液，将白藜芦醇储备液稀释至50μg/mL，分装至铝箔包裹的14mL培养管中，放置于25℃条件下，用于检测pH对白藜芦醇降解的影响。所有的样品取出后立即12000r/min离心1min，经过0．2μm滤膜过滤后用于LCMS-IT-TOF检测，取样时间点为2h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h和72h。
1．5不同培养基对白藜芦醇降解的影响
分别用水、蛋白胨水溶液、酵母提取物水溶液、LB培养基和M9培养基将白藜芦醇储备液稀释至50μg/mL，分装至铝箔包裹的14mL培养管中，放置于30℃培养箱中，用于检测不同培养基对白藜芦醇降解的影响。将一株大肠杆菌BL21(DE3)接种至LB培养基，于37℃、200r/min培养至OD600=0．6时，转接至含有50μg/mL白藜芦醇的LB培养基中，于30℃，200r/min继续培养48h，用于检测大肠杆菌对白藜芦醇降解的影响。所有的样品取出后都立即12000r/min离心1min，经过0．2μm滤膜过滤后用于LCMS-IT-TOF检测，取样时间点为2h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h和72h。
1．6降解动力学参数的计算
温度对白藜芦醇降解速率影响的参数利用阿累尼乌斯方程计算:lnk=lnA－EaRT其中A为指前因子，Ea为活化能(J/mol)，R为摩尔气体常量(8．314J/kmol)，T为绝对温度。
1．7LCMS-IT-TOF分析
样品采用ShimazuVP-ODSC18柱(2mmi．d．250mm，5mm)进行色谱分离［12］，进样量为5μL，流动相为0．1%的乙酸(30%，A)和乙腈(70%，B)，柱温为35℃，流速为0．2mL/min，进入质谱的分流比为100%。TOF检测使用ESI离子源，检测模式为负离子模式，检测电压1．56kV，雾化气(N2)流速1．5L/min，干燥气(N2)压力100kPa;离子收集时间30ms;碰撞能量50%，MS1扫描范围(100～600)m/z，MS2扫描范围(100～500)m/z。
2结果与讨论
2．1温度对白藜芦醇降解的影响
不同温度(25℃、30℃、37℃和42℃)下白藜芦醇的降解过程如图1所示。pH7．0时，白藜芦醇在37℃和42℃迅速的降解，在25℃时降解速度稍有减慢。不同温度下计算所得的白藜芦醇降解动力学参数如表1所示。白藜芦醇在pH7．0时不同温度下的降解过程符合一级动力学方程，温度对白藜芦醇降解速率的影响遵循阿累尼乌斯方程:logkobs=24．896－9360．8(1/T)(r2=0．99)。白藜芦醇降解速率对温度敏感的原因在于其活化能位于50～96kJ/mol范围内［13］。由上述结果可以看出，温度上升能明显加快白藜芦醇的降解速率，因此在生理温度下进行的白藜芦醇研究(白藜芦醇的生理活性以及胞内药物传递，白藜芦醇的微生物合成等)都需要注意白藜芦醇的高降解速率。有些研究时间长达48h［14］甚至72h［15］，在此过程中，超过一半的白藜芦醇可能会被降解，从而影响实验结果。
2．2pH对白藜芦醇降解的影响
白藜芦醇在不同pH条件(3．0、5．0、7．0、9．0和11．0)下的降解过程如图2所示。白藜芦醇在酸性条件下相对稳定，然而在碱性条件下却快速降解。白藜芦醇在酸性条件下稳定是由于其羟基被大量带正电荷的H3O+所保护［16］。当pH高于7．0时，白藜芦醇的降解速度显著加快;当pH高于9．0时，白藜芦醇能在数分钟内以肉眼可见的速度被降解，溶液颜色迅速加深。在pH9．0时，白藜芦醇的一个羟基部分去质子化;而当pH达到10．0时，白藜芦醇的一个羟基完全去质子化而另一个羟基也部分去质子化［17］。这表明白藜芦醇碱降解的机制可能与其羟基解离的程度有关。然而，目前大部分围绕白藜芦醇的实验都是在pH7．0左右的环境里进行的，因此不可避免的会受到白藜芦醇降解的影响。
2．3不同的培养基成分对白藜芦醇降解的影响
白藜芦醇在不同培养基(水、蛋白胨水溶液、酵母提取物水溶液、LB培养基和M9培养基)中的降解过程如图3。在本研究中，白藜芦醇的降解速率都一定程度的受到温度和pH的影响，因为培养基都是在适合菌体生长的温度和pH条件下放置，很少会有需要在低温和pH较低的条件下进行实验的培养基。由结果可以看出，M9培养基对白藜芦醇降解的影响最小，在经过72h之后仍有超过70%的白藜芦醇未被降解;酵母提取物对白藜芦醇的降解有一定的影响，72h时白藜芦醇含量相比水中的多降解了23%;而在含有蛋白胨的水溶液以及含有蛋白胨的LB培养基中，白藜芦醇降解速率明显加快，经过72h后几乎没有白藜芦醇残留，全部被降解。由此可见，培养基中的蛋白胨成分会较明显的促进白藜芦醇的降解。由于许多丰富培养基中都含有蛋白胨成分，因此当使用这些培养基培养微生物进行白藜芦醇发酵生产时，会受到白藜芦醇降解的影响，从而影响产量。
2．4大肠杆菌对白藜芦醇降解的影响
大肠杆菌对白藜芦醇降解的影响如图4所示。在添加大肠杆菌BL21(DE3)的LB培养基中，在前24h白藜芦醇的降解速率稍有加快;24h之后，白藜芦醇的降解速率开始减慢;到72h时，未添加大肠杆菌BL21(DE3)的LB培养基中白藜芦醇已经完全降解，而添加大肠杆菌BL21(DE3)的LB培养基中还有10%白藜芦醇残留。该现象可能的原因是发酵过程中pH的降低，减慢了白藜芦醇的降解;培养基中的蛋白胨被大肠杆菌消耗，减少了蛋白胨的含量。由此可知，大肠杆菌的生长对白藜芦醇的降解并没有显著的影响，利用代谢工程改造的大肠杆菌生产白藜芦醇不会增加白藜芦醇的降解。
2．5LCMS-IT-TOF分析降解产物
白藜芦醇主要降解产物的分析通过LCMS-IT-TOF来完成。利用全扫描模式对白藜芦醇的降解产物进行分析之后，得到主要的降解产物的质谱图，见图5。结果表明，白藜芦醇降解的主要产物有两个，即m/z453．1683和m/z243．0636。为了得到这两种物质可能的结构，将m/z453．1683和m/z243．0636作为母离子，进一步打碎检测二级质谱，得到的二级质谱图如图6和图7。由二级质谱结果可知，m/z453．1683和m/z243．0636打碎之后都得到了一个碎片峰m/z227，为白藜芦醇的［M-1］－峰。m/z453．1683对应［2M-2H-1］－，来源于两分子白藜芦醇脱去两个氢结合成的白藜芦醇二聚体;而m/z243．0636对应［M+O-1］－，是白藜芦醇被氧化得到的产物氧化白藜芦醇(2，3'，4，5'-四羟基二苯乙烯)。将二级质谱结果导入MZmine-2．10进行处理，处理结果与KEGGCompound数据库进行比对，结果表明，加入大肠杆菌和白藜芦醇的培养基中甲基胞嘧啶含量有较大程度的增加，这可能与白藜芦醇多聚物抑制细菌DNA合成有关［18］。其他降解产物在总离子流图(TIC)上出峰较小，无法逐一进行分析。
3结论
通过研究不同温度、pH和培养基成分等环境因子对白藜芦醇降解的影响，本研究发现，较高的温度、pH，以及培养基中蛋白胨的存在，均会导致白藜芦醇降解速率的加快;而在低温、酸性及不含蛋白胨的条件下白藜芦醇稳定性较高。该发现有助于降低发酵过程中白藜芦醇的降解速率，同时可作为白藜芦醇长期保存的重要参考。通过对白藜芦醇的降解产物进行分析，得到了其中两个主要的降解产物，即白藜芦醇二聚体和氧化白藜芦醇。此外，通过在培养基中添加大肠杆菌BL21(DE3)发现，大肠杆菌的生长不会增加白藜芦醇的降解速率，证明了利用代谢工程改造大肠杆菌生产白藜芦醇的可行性。
参考文献：
［2］于贞，张影陆，赵光鳌．葡萄酒中白藜芦醇的分析．工业微生物，2001，31(4):34-36．
［12］戴群，赵光鳌．HPLC测定葡萄中活性物质———白藜芦醇的含量．工业微生物，1999，29(3):22-24．
作者:朱屹东 周景文 堵国成 单位:江南大学生物工程学院