茶多酚与咖啡碱的相互作用范文

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《贵州农业科学杂志》2014年第四期

1方法

1．1偶联蛋白的制备采用双交联法制备偶联蛋白［5］咖啡碱0．3mg溶于0．5mL0．6mol／LNaOH中，加入0．5mL2g／L硼氢化钠，再加入偶联剂进行活化，25℃振荡4h，加入适量的Na2CO3使其终浓度为0．3mol／L，加入5mg载体蛋白，37℃偶联反应24h，反应结束，加入过量的甘氨酸，进行封闭。将反应产物溶液过G－25层析柱进行纯化，用0．01mol／LPBS（pH7．4）洗脱液洗脱，收集的第一个洗脱峰即为目标产物。同法制备EGCG偶联蛋白。

1．2偶联蛋白的检测对制备的偶联蛋白，采用HPLC进行检测（色谱柱为G5000PWXL，流动相0．01mol／LPBS，流速0．8mL／min）以检测经G－25凝胶分离纯化后的偶联物中是否含有游离的咖啡碱。

1．3偶联蛋白的紫外光谱分析采用紫外可见分光光度计（UV－1800）进行紫外扫描记录，测定咖啡碱、载体蛋白和偶联蛋白的紫外吸收曲线。检测波长270nm和278nm．

1．4偶联蛋白中咖啡碱与载体蛋白偶联比的测定采用紫外可见分光光度法对偶联蛋白中咖啡碱与载体蛋白的摩尔比进行测定。测定咖啡碱、载体蛋白、偶联蛋白在波长270nm和278nm的吸光度A，按公式ε＝A／bc计算咖啡碱和载体蛋白在这两种波长下的摩尔吸光系数。其中，ε为摩尔吸光系数、b为液体厚度、c为咖啡碱和载体蛋白的浓度，根据所测定的载体蛋白在两个波长的吸光度，以及咖啡碱和载体蛋白在这两种波长下的摩尔吸光系数，计算出偶联蛋白的偶联比。计算公式：C咖啡碱／CBSA＝（A278×KBSA，270－A270×KBSA，278）／（A270×K咖啡碱，278－A278×K咖啡碱，270），其中，C咖啡碱／CBSA为咖啡碱－BSA分子中咖啡碱与BSA的偶联比，A278、A270为其在波长278nm和270nm的吸光度，KBSA，270、KBSA，278、K咖啡碱，278和K咖啡碱，270为咖啡碱和BSA在这二种波长下的摩尔吸光系数。同法测定EGCG偶联蛋白的偶联比。

1．5间接ELISA操作流程按照免疫学实验方法进行ELISA操作［6］，测定OD值。每个步骤之间均用洗涤液洗涤3次，每次洗3min；每种试剂加入的体积均为100μL。在OD值接近1．0时，以P／N值在2．0以上并呈现最大者的反应条件作为确定ELISA反应条件的参考依据。

1．6咖啡碱偶联蛋白最佳包被浓度的确定采用方阵滴定法，将咖啡碱偶联蛋白分别稀释成8μg／mL、4μg／mL、2μg／mL、1μg／mL、0．5μg／mL和0．25μg／mL，包被。以OD值接近1．0时，且P／N值在2．0以上并呈现最大者为最佳包被浓度。

1．7咖啡碱偶联蛋白最佳包被时间和温度的确定以咖啡碱偶联蛋白最佳包被浓度包被板子，按37℃4h、37℃4h后4℃过夜、37℃2h后4℃过夜、4℃过夜分别包被，以OD值接近1．0时，且P／N值在2．0以上并呈现最大者为最佳包被时间和温度。

1．8EGCG偶联蛋白最佳工作浓度的确定将EGCG偶联蛋白分别作1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000倍稀释，测定其OD值。以OD值接近1．0时，且P／N值在2．0以上并呈现最大者为最佳工作浓度。

1．9咖啡碱与茶多酚EGCG反应最佳时间的确定作用时间分别设为30min、40min、60min和80min，测定OD值。以OD值接近1．0时，且P／N值在2．0以上并呈现最大者为最佳作用时间。

1．10咖啡碱偶联蛋白包被板批内稳定性、批间稳定性测定取4个不同浓度、每个浓度同样的2份样本，分别在同一酶标板上检测4次，测批内变异，在不同酶标板上测4次，测批间变异，根据批内和批间变异系数判定批内稳定性、批间稳定性。

2结果与分析

2．1咖啡碱－BSA偶联蛋白的合成与表征

2．1．1咖啡碱与BSA偶联效果的检测通过检测，仅观察到咖啡碱－BSA偶联蛋白单一吸收峰（11．867min），其出峰时间基本与BSA（12．047min）一致，未观察到咖啡碱吸收峰（26．823min），表明经G－25凝胶分离纯化后的偶联物中不含有游离的咖啡碱。

2．1．2偶联蛋白的紫外光谱分析由图1可知，BSA在278nm处有一明显吸收峰，咖啡碱在270nm有明显的吸收峰，而偶联抗原的紫外吸收图谱同时出现2个特征吸收峰（278nm和271．5nm），分别对应于BSA、咖啡碱的吸收峰，且有一定的位移，表明咖啡碱与载体蛋白BSA发生了偶联反应。

2．1．3偶联蛋白中咖啡碱／BSA偶联比制备的偶联蛋白咖啡碱－BSA中咖啡碱／BSA的偶联比（摩尔比）为8．56，说明偶联蛋白具有较好的免疫性，达到了常规免疫抗原的要求。

2．2EGCG－OVA偶联蛋白的合成与表征

2．2．1EGCG–OVA偶联蛋白的检测通过检测，仅观察到EGCG–OVA偶联蛋白单一吸收峰（12．647min），其出峰时间基本与OVA（12．813min）一致，未观察到EGCG吸收峰（29．842min），表明经G－25凝胶分离纯化后的偶联物中不含有游离的EGCG。

2．2．2偶联蛋白的紫外光谱分析由图2可知，OVA在280nm处有一明显吸收峰，EGCG在270nm有明显的吸收峰，而偶联蛋白的紫外吸收图谱同时出现2个特征吸收峰（280nm和269nm），分别对应于OVA、EGCG的吸收峰，且有一定的位移。表明，EGCG与载体蛋白OVA发生了偶联反应。

2．2．3偶联蛋白中EGCG／OVA偶联比试验结果表明，所制备的偶联物EGCG－OVA中EGCG／OVA的偶联比（摩尔比）为6．35，说明偶联蛋白具有较好的免疫性，达到了常规免疫抗原的要求。

2．3咖啡碱－BSA偶联蛋白的最佳包被浓度测定咖啡碱—BSA偶联蛋白6个不同包被浓度的OD值，结果表明，包被浓度为2μg／mL时，OD值接近1．000，且P／N值最大，为3．12。所以咖啡碱－BSA偶联蛋白的最佳包被浓度为2μg／mL。

2．4咖啡碱－BSA偶联蛋白最佳包被时间和温度咖啡碱－BSA偶联蛋白以2μg／mL浓度包被板子，测定4个不同包被时间和温度下的OD值，结果表明：4℃过夜条件下，OD值接近1．000，且P／N值最大，为2．87。所以咖啡碱－BSA偶联蛋白最佳包被条件为4℃过夜。

2．5EGCG－OVA偶联蛋白最佳工作浓度当EGCG－OVA偶联蛋白的工作浓度为1∶1000时，OD值接近1．000，且P／N值最大，为2．67，所以EGCG－OVA偶联蛋白最佳工作浓度为1∶1000。

2．6咖啡碱与EGCG反应最佳作用时间的确定由表1可知，在作用时间为60min时，咖啡碱与EGCG的OD值均接近1．000，P／N值均为最大，因此，咖啡碱与EGCG反应最佳作用时间为60min。

3结论与讨论

3．1结论试验采用双交联法制备偶联蛋白，通过紫外光谱对偶联蛋白进行分析，计算偶联比，所制备的偶联物咖啡碱－BSA中咖啡碱／BSA的偶联比（摩尔比）为8．56，偶联物EGCG－OVA中EGCG／OVA的偶联比（摩尔比）为6．35。说明，偶联蛋白具有较好的免疫性，达到了常规免疫抗原的要求。EGCG与咖啡碱相互作用的条件：咖啡碱－BSA偶联蛋白的最佳包被浓度为2μg／mL；最佳包被条件为4℃过夜；EGCG－OVA偶联蛋白最佳工作浓度为1∶1000；咖啡碱与EGCG反应最佳作用时间为60min。

3．2讨论3．2．1载体蛋白的筛选载体蛋白主要用于偶联剂与EGCG或咖啡碱相连接，偶联后成为ELISA反应的基本单位，分别与咖啡碱、EGCG相偶联的载体蛋白必须不同。载体蛋白的筛选主要考虑以下3个方面：1）不同小分子与不同载体蛋白的非特异性结合小；2）蛋白自身及不同蛋白的相互作用小；3）包被固相载体效果好。牛血清白蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）是ELISA反应中常用的2种蛋白，蛋白自身及彼此之间相互作用小，因此试验选取牛血清白蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）作为与咖啡碱及EGCG偶联的适宜载体蛋白。

3．2．2偶联剂的选择筛选出载体蛋白后，偶联剂的选择及反应条件的确定就是EGCG与咖啡碱相互作用的ELISA检测方法建立的关键之一。偶联剂可防止大分子载体蛋白对咖啡碱、EGCG的屏蔽效应，即防止咖啡碱、EGCG与载体结合时，被包埋在卷曲凹陷的大分子结构中，影响两者的相互作用。在和载体蛋白的偶联过程中还应充分考虑到咖啡碱、EGCG与载体蛋白的比例，偶联时pH值、温度、光照、渗透压、加样速度等条件对偶联效果也有影响。因1，4－丁二醇二缩水甘油醚（双环氧试剂）偶联条件温和，偶联效果好。因此试验选取1，4－丁二醇二缩水甘油醚（双环氧试剂）作为偶联剂。

3．2．3ELISA检测反应条件的研究ELISA检测法的影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，咖啡碱偶联蛋白包被浓度、包被时间和温度是关键因素。茶多酚EGCG偶联蛋白的浓度也是影响反应的主要因素之一。在ELISA检测中，咖啡碱与茶多酚EGCG反应的完成需要有一定的温度和时间，控制不同的反应温度和时间，可以使反应达到最佳效果。因此，试验选取咖啡碱偶联蛋白包被浓度、包被时间和温度、EGCG偶联蛋白浓度、咖啡碱与EGCG反应时间等参数进行ELISA检测反应条件的研究，以确定反应的最佳条件。试验利用ELISA法特异性强、灵敏度高的特点，将ELLSA法用于测定茶多酚与咖啡碱之间的相互作用，大幅提高茶多酚与咖啡碱之间相互作用检测的特异性与灵敏度，解决了分光光度法和C—NMR法存在的特异性差、灵敏度低、定量困难、资金投入高、操作要求严等不足，为茶饮料浑浊沉淀产生机理的分析提供特异性更强、灵敏度更高的方法。

作者：杨玲张高贺登芳陶于菊单位：贵州省生物研究所贵州都匀优加加生物科技有限公司