发酵培养及增溶作用研究范文

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《中山大学学报》2015年第五期

VOCs因排放量大、种类多、毒性强已成为全球关注的焦点。目前已鉴定的VOCs达300多种，最常见的是苯、甲苯、二甲苯、三氯甲烷等。苯已被世界卫生组织列为强致癌物。VOCs处理方法很多，包括冷凝法、吸收法、吸附法和膜分离法、催化燃烧法、等离子体法、光催化氧化法及生物法等。目前应用较多是吸附法、催化燃烧法和生物法。前两种方法成本高，给治理企业带来了很大负担。生物法操作简单、成本低、无二次污染备受青睐。然而，由于VOCs水溶性差，导致其可生化性偏低，故限制了该技术的应用。

提高VOCs可生化性的重要途径就是对其增溶。表面活性剂对VOCs具有良好的增溶作用。利用表面活性剂提高疏水性有机污染物的溶解性已有展开，但大多利用的是化学表面活性剂。而化学表面活性剂具有毒性且难降解，易引起二次污染。生物表面活性剂(简称BST)不仅具有良好的表面活性和乳化性能，且具无毒、易于生物降解等独特优势，使其在VOCs生物治理方面具有广阔的应用前景。本研究针对VOCs水溶性差影响其生物降解问题，驯化VOCs增溶微生物，使其产BST。利用BST使VOCs增溶。本研究选择苯和甲苯作为VOC的代表进行实验。为了满足实际工程的需要，直接用发酵液对VOC进行增溶，不仅降低生产成本，且发酵液完成增溶后还将为下一步降解微生物带来营养。本研究建立一个完全开放式的自然发酵体系，可为BST的大批量生产提供技术支持。通过本研究，有望突破VOC因难溶于水而影响其生物降解这一瓶颈，为VOCs的高效生物处理提供科学依据。

1实验材料

1.1主要仪器摇床(SUKUNSKY－211，上海苏坤)、干燥箱(DHG－9240A，上海申贤)、电子天平(FA2204，上海安亭)、灭菌器(LS－B50L)、培养箱(SGSP－02黄石恒丰)、超净台(SW－CJ－1D，苏州净化)、水浴锅(HH－4)、离心机(TDZ5－WS，长沙平凡)、pH计(DELTA320)、气泵、流量计及液相色谱仪(日本岛津)等。

1.2主要试剂苯(分析纯，广州化学试剂厂)、甲苯(分析纯，广州化学试剂厂)、苏丹红Ⅲ((分析纯，广州化学试剂厂)、甲醇(色谱纯，广州化学试剂厂)。

1.3培养基硫酸铵5g/L，废石油20g/L，葡萄糖1.0g/L，氯化钾1.0g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，pH7～7.5，自来水1L。

1.4种源样品样品来自某污水处理池。

2实验方法

2.1增溶菌的驯化

2.1.1摇床驯化在无菌条件下，于500mL三角瓶中加入200mL灭菌培养基，污泥按一定比例接入，摇床驯化。

2.1.2扩大培养于2.5L用纱布封口的广口瓶中加入1.5L发酵培养基，高压灭菌。在无菌条件下，按一定比例转接驯化种液，曝气培养。按同样方法，进行多次转接。逐渐由无菌接种变为自然接种，再过渡到完全开放式自然培养。设对照组。

2.2增溶活性指标及测定方法

实验时先用液态苯及液态甲苯进行验证。

2.2.1增溶能力及测定方法取一直径为9cm平皿，加入20mL去离子水，然后在水面上缓慢滴加2mL染色苯或染色甲苯，待形成稳定薄膜后，在薄膜中心滴加1mL离心后的发酵液。发酵液若能增加苯或染色甲苯在水中的“溶解”，便形成一圆圈，即增溶圈。测量增溶圈直径。每组设3个平行，取其平均值。染色苯和染色甲苯是苯和甲苯分别用苏丹红Ⅲ染色而成的。

2.2.2乳化能力及测定方法苯或甲苯与发酵液按一定比例作用，若发酵液中有BST的产生，则二者即可形成乳化层。乳化能力以乳化百分率(EI)衡量。

2.3乳化液乳化性质的鉴别乳状液两类型［15］:一类是水包油型(O/W);另一类是油包水型(W/O)。为了提高鉴别的准确性，分别用亲油性染料(苏丹红Ⅲ)和亲水性染料(沙黄和结晶紫)对乳状液进行染色。用苏丹红Ⅲ染色的乳状液若整体为红色，则为W/O型;若仅乳滴为红色，则为W/O型。用沙黄或结晶紫染色的乳状液若整体为红色或紫色，则为O/W型;若仅乳滴为红色或紫色，则为W/O型。

2.4增溶实验

2.4.1增溶实验方法实验系统由气泵、吸收瓶、气体混合瓶、流量计及增溶瓶等通过胶管连接而成。增溶瓶有两个。一个装发酵液，为增溶实验瓶;另一个装空白培养基，为对照瓶。实验所用苯及甲苯为气态苯及甲苯。气态苯及甲苯采用吹脱法配制。气泵将空气分别鼓入装有液态二苯的吸收瓶和气体混合瓶。通入吸收瓶中的空气将气态二苯载入混合瓶，与空气按一定比例充分混合后分别被送入增溶瓶和对照瓶中。混合气体的流量由流量计控制，保证通入增溶瓶的流量(16L/h)相等。连续6h后停止通气，静止6h，共持续12h，取样，每1h取样一次。

2.4.2增溶率的测定增溶率的测定采用高效液相色谱法测定“溶解”态苯的浓度。具体方法如下:(1)色谱条件。流动相甲醇水溶液，配比为V(甲醇)/V(水)=80/20，检测器SPD－20AV、色谱柱SHIMADZUVP－ODSC18、流速0.8mL/min、柱温40℃、检测波长260nm。(2)增溶率(IS)的计算。增溶率(IS)为苯及甲苯在发酵液中的最大“溶解度”(Sf)与苯及甲苯在空白发酵培养基中的“溶解度”(Sc)之差与Sc的比值，为无量纲量。实验所测得的溶解度为气态苯及甲苯的表观溶解度。因此，用表观溶解度计算所得到的增溶率为表观增溶率。实验中用表观增溶率来衡量发酵液中BST对气态苯的增溶效果。通气过程中定时测定发酵液对气态苯及甲苯的“溶解量”及停止通气后发酵液中苯及甲苯的溶解量。以时间为横坐标，以发酵液中“溶解”态苯及甲苯的含量为纵坐标，绘制溶解量随时间的变化曲线，确定发酵液对苯与甲苯的增溶稳定性。

3结果与分析

3.1摇床驯化结果

3.1.1葡萄糖质量浓度对驯化效果的影响设葡萄糖质量浓度为0、0.5、1.5和2.0g/L，其他条件不变，通过增溶能力和乳化能力，确定最佳葡萄糖质量浓度，结果见图1。由图1可知，当ρ(葡萄糖)为0g/L时，增溶直径和乳化率都为0，说明发酵液没有BST的产生。当ρ(葡萄糖)分别为0.5、1.5和2.0g/L时，发酵液都有BST的产生，但含量都偏低。当ρ(葡萄糖)为1.0g/L时，增溶直径和乳化率都最大，即发酵液中BST含量最高。因此，发酵液最佳葡萄糖质量浓度确定为1.0g/L。以上结果表明，BST的产生需要一定糖类物质。废石油是碳源，但不是唯一碳源，还需糖类碳源的帮助。废石油起到的可能是刺激或诱导作用，在被微生物利用的同时，刺激其产BST。

3.1.3初始pH值对驯化效果的影响取葡萄糖质量浓度为1.0g/L，将初始pH值设为6.65、6.75、6.85、6.95、7.05、7.15、7.25和7.35，通过测定发酵液的增溶能力和乳化能力，确定最佳初始pH。结果见图2。由图2可知，初始pH值在6.95～7.05之间时，发酵液的增溶直径和乳化率都相对比较高。高于或低于此范围，增溶直径和乳化率都将减小。由此确定，发酵最佳初始pH值在6.95～7.05之间。

3.1.3温度对驯化效果的影响在最适碳源浓度、最适初始pH值条件下，将摇床温度分别设20、22、24、26、28、30、32、34和36℃，通过测定发酵液的增溶能力和乳化能力，确定其最佳驯化温度。结果见图3。由3可知，驯化温度在26～32℃时，BST释放量最大，高于或低于此范围，增溶直径和乳化率都将减小。故确定发酵最佳温度范围为26～32℃。

3.2扩大培养结果

3.2.1BST产生规律通过测定发酵液对苯和甲苯的增溶活性，得到BST产生随时间的变化规律(图4)。由图4可见，接种12h内，发酵液对苯和甲苯的增溶活性明显增加。这说明增溶菌对新环境有较强的适应能力。自接种至36h，发酵液对两种苯的增溶与乳化一直呈快速增加的趋势，36h后缓慢下降。BST产生规律的研究对实际生产具有重要指导意义，可依据该规律，确定发酵周期。

3.2.2发酵液增溶效果(1)发酵液对苯的增溶效果。通过前面的实验，已证明BST对液态苯及甲苯有优良的增溶及乳化能力，但实际生产时，被处理的VOCs成分为气态形式。为了进一步证明BST对VOCs的增溶作用，即提高气态苯类在水相中的“溶解度”，对其进行了增溶实验。结果见图5。由图5可知，连续通气1h后，苯在发酵液中的“溶解”量约为1.67g/L;苯在空白培养基的质量浓度只有0.7g/L。此后继续通气，两种溶液中苯的含量都在增加。通气4～6h，发酵液中苯的质量浓度基本稳定，达2.0g/L。6h后停止通气时，空白培养基中苯的质量浓度仅为0.9g/L，而发酵液中苯的质量浓度一直在1.8g/L以上。在随后的6h中，空白培养基中的苯一直在减少，平均挥发速率约为0.064g•L－1•h－1，而发酵液中苯的质量浓度维持在约2g/L。由此可见，在通气过程中，发酵液对苯有明显的“溶解”效果，且较稳定。发酵液的表观溶解度达空白培养基的2.7倍。可见BST对气态苯具有良好而稳定的增溶效果。(2)发酵液对甲苯的增溶效果(图6)。从图6可见，甲苯在纯培养基中的表观溶解度只有0.0047～0.0070g/L。但在发酵液中，甲苯的质量浓度在通气开始时为0.11g/L，表观增溶量是空白培养基的9倍。随着甲苯气体的持续通入，其在发酵液中的量不断增加。通气0～3h时，发酵液对甲苯的表观增溶率达空白培养液的27倍。随着时间的延长，空白培养基中的甲苯持续挥发，发酵液中甲苯含量比较稳定，说明BST能与甲苯稳定地结合在一起。在12h时，发酵液的表观增溶量为空白培养基的30倍。可见发酵液对气态甲苯也具有理想的增溶效果。

3.3乳化类型鉴定发酵液与苯和甲苯的乳化类型鉴定结果是:用苏丹红Ⅲ染色时，整体未被染色，染料与分散相不能互溶，而乳滴被染为红色。初步判定乳化层为O/W型。用沙黄和结晶紫染色时，整体分别被染成了红色和紫色，进一步证明乳化层为O/W型。水包油的“壳”外层亲水，故可与水相混。本实验中苯与BST所形成的乳滴为水包油，故易溶于水。这对苯类及其VOCs的生物降解是极为有利的。

3.4增溶菌的初步鉴定结果出于生产应用的考虑，本研究所驯化的增溶菌非单一纯种。通过革兰氏染色与显微观察，大都为革兰氏阴性短杆菌。相关内容将进一步研究。

4结论

成功驯化获得了产BST的微生物，确定了产BST的最适条件。BST具有明显的产生规律，约36h时产生量最大。驯化所得到的BST对苯与甲苯都具有良好的增溶效果，发酵液对苯的表观“溶解度”为空白培养基的2.7倍。在12h时，发酵液对甲苯的表观增溶量为空白培养基的30倍。苯和甲苯与BST所形成的乳滴为水包油，易溶于水，这有利于苯类及其VOCs的生物降解。产BST的细菌大都是G－短杆菌。

作者：王国惠 许亚楠 单位：中山大学环境科学与工程学院