共生藻对温度变化的响应范文

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《山西大学学报杂志》2015年第五期

地衣中共生藻的光合作用为地衣体制造有机营养，而共生菌则吸收环境中的水分和无机盐为共生藻的光合作用提供原料。目前已报道的地衣共生藻约有40属120种，主要分布于是蓝藻和绿藻。Honegger指出地衣共生藻在受到外界环境剧烈变化时（如低温、干旱等），其原生质体会大幅收缩，从而促使地衣体进入生理休眠状态，反之，当外界环境有利于地衣体生长时，其生理活动也能迅速恢复。植物在长期的进化过程中，逐渐产生了一系列适应低温变化以增强其抗寒性的能力。当植物遭受低温伤害时，其自身会合成或分解形成一些小分子物质，增加细胞内的渗透调节物质，维持细胞膜系统的稳定性，缓解或降低低温所造成的伤害［2］。此外，低温胁迫会影响活性氧的产生与清除，造成氧化胁迫，进而引起细胞膜脂过氧化、核苷酸损伤和蛋白质变性等现象的发生，甚至导致细胞的死亡。超氧化物歧化酶（SOD）是植物体内重要的抗氧化酶，维持活性氧在植物体内的代谢平衡，减轻活性氧的对其的伤害。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化重要的产物，其含量的变化能间接反应细胞膜系统的损伤和抗逆性。一般认为植物在低温胁迫下可溶性蛋白和可溶性糖含量会有所上升，以修复低温对植物细胞所带来的损伤。本实验以采于山西管涔山的壳假网衣（Porpidiacrustulata）为材料，研究了其共生藻在不同培养温度条件下，其SOD活力、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白的含量，以期了解地衣共生藻对温度变化的响应，为今后从地衣体中筛选抗逆性的藻株提供参考。

1材料与方法

1．1实验材料壳假网衣（Porpidiacrustulata），采自山西宁武管涔山。凭证标本保存于山西大学植物标本馆（SXU）。共生藻经分离纯化后保存于本实验室，经鉴定为小球藻属植物（Chlorellasp．GC）［8－9］。

1．2实验方法在250mL三角瓶中加入150mL已灭菌的BG11培养液（pH＝7．5），接种1mL藻液，Chlorellasp．GC的初始接种浓度分别为3．8×106个／mL。实验设置6个温度梯度，分别为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃，在人工气候箱（上海博讯，BSG－300）中培养，每个温度设置3个平行，光暗比12h∶12h，光照强度2000lx。

1．2．1MDA含量的测定MDA含量采用南京建成生物工程公司MDA酶标法试剂盒测定。在培养0、3、6、9、12d时分别取5mL藻液，在高速台式冷冻离心机（TGL－16G－C，上海安亭）中离心15min，4500r／min，10℃，弃上清液，加入1mLPBS（pH7．2，0．05mol／L）。在细胞破碎仪（JY92－Ⅱ，宁波新芝）中进行破碎，功率600W，工作8s，间隙5s，20min。冷冻离心10min，3500r／min，4℃。取50μL上清液，加入1000μL工作液，混匀。95℃水浴20min，取出后冷却。在530nm处，用多功能酶标仪（MD，SpectraMax－M5，美国）测吸光度。按照试剂盒说明书提供的计算公式计算。

1．2．2SOD活力测定SOD采用南京建成生物工程公司WST－1法试剂盒测定。在培养0、3、6、9、12d时分别取5mL藻液，在高速台式冷冻离心机中离心15min，4500r／min，10℃，弃上清液，加入1mLPBS（pH7．2，0．05mol／L）。在细胞破碎仪中进行破碎，功率600W，工作8s，间隙5s，20min。冷冻离心10min，3500r／min，4℃。取20μL清液，加入20μL工作液，200μL底物应用液。37℃恒温培养箱（HPX－9052MBE，上海博讯）温浴20min。在450nm处，用多功能酶标仪测吸光度。按照试剂盒说明书提供的计算公式计算。

1．2．3可溶性糖含量测定采用蒽酮法测定可溶性糖含量。吸取浓度为0、10、20、30、40、60、80μg／mL的标准葡萄糖液1mL，加蒽酮试剂4mL，各管快速摇匀后立即放入沸水浴10min。取出后冷却，以空白作对照，用多功能酶标仪测定其在620nm波长下的吸光度。以吸光度为纵坐标，可溶性糖含量为横坐标，绘制标准曲线。在培养0、3、6、9、12d时分别取5mL藻液在高速台式冷冻离心机中离心15min，4500r／min，10℃，弃上清液，加入1mLPBS（pH7．2，0．05mol／L）。在细胞破碎仪中进行破碎，功率600W，工作8s，间隙5s，20min。冷冻离心10min，3500r／min，4℃。取200μL上清液，加入800μL蒽酮试剂沸水浴10min，取出后冷却。在620nm处，用多功能酶标仪测其吸光度。可溶性糖含量（％）＝（C×V总×D）／W×V测×106×100，式中：C由标准曲线所得的糖含量（μg），V总提取液总体积（mL），D稀释倍数，W样品重量（g），V测吸取的提取液体积（mL）。

1．2．4可溶性蛋白含量测定可溶性蛋白含量使用南京建成生物工程公司蛋白定量测试试剂盒（考马斯亮蓝法）进行测定。在培养0、3、6、9、12d时分别取5mL藻液，在高速台式冷冻离心机中离心15min，4500r／min，10℃，弃上清液，加入1mLPBS（pH7．2，0．05mol／L）。在细胞破碎仪中进行破碎，功率600W，工作8s，间隙5s，20min。冷冻离心10min，3500r／min，4℃。取50μL上清液，加入3mL考马斯亮蓝应用液，混匀，静止10min后精确吸取250μL加入酶标板。在595nm处，用多功能酶标仪测吸光度。按照试剂盒说明书提供的计算公式进行计算。

1．2．5数据处理采用单因素方差分析对数据进行统计处理，并用t－检验方法对回归方程进行回归显著性检验；P＜0．05时，差异显著。

2结果与分析

2．1温度对共生藻MDA含量的影响由图1可知，共生藻在5℃、10℃和15℃的低温培养条件下培养3d后，MDA含量迅速上升，之后，MDA含量又呈下降趋势。0到3d的培养过程中MDA含量的迅速上升表明在5℃、10℃和15℃的低温培养条件下，共生小球藻的细胞膜系统受到了损伤。培养3d后共生藻逐步适应了低温的生长环境，其MDA含量也回落。

2．2温度对共生藻SOD活力的影响在适宜的培养条件下，藻细胞内的活性氧处于动态平衡。当藻细胞的生长受到外界环境影响时，其SOD活力的高低间接反映了机体清除活性氧自由基的能力。刚分离出的共生藻SOD活力远高于经过培养后的（图2），这可能与其长期生活在寒冷的环境有关。培养3d后SOD活力整体呈下降趋势，30℃培养条件下SOD活力最高，5℃到20℃培养条件下SOD活力逐渐升高，间接表明温度的上升影响了共生藻细胞的生长。培养3d后SOD活力越来越低，这可能与其逐渐适应培养条件和“地衣化”影响有关。为了更好地适应共生关系，共生藻有着更强的活性氧自由基清除能力。

2．3温度对共生藻可溶性糖含量的影响可溶性糖是植物细胞重要的渗透调节物质，对细胞质胶体和细胞液有重要的作用。一般认为，植物细胞可溶性糖含量的高低与其抗寒性呈正相关［7］。由图3可知，共生藻初始可溶性糖含量较高。随着培养天数的增加和共生藻摆脱“地衣化”而自由生活，可溶性糖含量逐步升高。5℃和10℃培养条件下，可溶性糖含量高于其他培养温度，表明共生藻在低温条件下加强了水解作用，将淀粉、蛋白质等大分子化合物大量降解成可溶性糖，增加细胞液浓度，以调节细胞渗透压，提高机体抗寒能力。由此可见，共生藻对低温有较好的耐受性。为了更好地适应共生生活，共生藻可能逐渐建立起了适应寒冷气候的适应机制。

2．4温度对共生藻可溶性蛋白质含量的影响植物细胞内的可溶性蛋白质含量与其抗寒性密切相关，可溶性蛋白质含量的增加有利于提高植物体的抗寒性。从图4可以看出，共生藻初始可溶性蛋白质含量较少，这可能与其被“地衣化”影响和生长环境有关。随着培养时间的增加，可溶性蛋白质含量经历了先升高再降低，再升高的过程。5℃和10℃培养条件下的可溶性蛋白质含量较其它培养温度下更高，表现出具有较好的抗冷性。这可能与其长期生活在寒冷的气候环境有关，在与地衣的共生中建立了适应寒冷气候的机制。

3讨论

据报道，低温可降低植物细胞的代谢活力，破坏细胞膜系统，引起膜脂过氧化，破坏活性氧代谢系统的平衡，减弱呼吸作用，使细胞内可溶性糖和可溶性蛋白含量增加。本研究采用多项指标对壳假网衣共生藻对温度变化的响应进行了初步研究，结果显示，在5℃和10℃的培养条件下，地衣共生藻MDA含量逐渐减少，可溶性糖和可溶性蛋白质含量逐步增加，与有关文献的结果相一致。Thüs等指出，自由生活的藻细胞在逐渐演变为地衣共生藻细胞的过程中，其细胞结构和生理特性会受到“地衣化”的影响而发生变化。本实验中壳假网衣共生藻在与真菌体的长期互惠共生中，可能逐渐建立起了适应管涔山地区寒冷气候的机制，表现出较强的抗冷性。由于地衣这一特殊的生物类群，生境要求严格，多数种类生长相对较慢。因此，目前关于地衣共生藻生理生化特性方面的研究还很少。但正是由于其特殊性，有些地衣共生藻具有抗逆性较强、营养物质积累较多等特性，这也提示我们今后应重视和加强对这一类群的深入研究，为筛选优良藻种提供更多的途径。

作者：李博 谢树莲 单位：太原师范学院 地理科学学院 山西大学 生命科学学院