小鼠骨骼肌萎缩潜在的分子机制探讨范文

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【摘要】目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型小鼠骨骼肌萎缩可能存在的分子机制。方法按随机数字表法将6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组和COPD模型组，每组各10只，均在标准环境下饲养。COPD模型组用香烟烟熏12周，正常组不予特殊干预，通过肺脏病理验证COPD小鼠造模是否成功。免疫组化分析两组小鼠骨骼肌中自噬相关蛋白Beclin1及P62的表达和肌肉萎缩相关分子标记物FBXO32及TRIM63的表达;免疫荧光分析炎症标志物NF－κBP65入核表达情况。结果烟熏12周造模成功，肺脏病理结果提示COPD模型组平均肺泡间隔里衬(83．00±12．71)明显高于正常对照组(30．60±4．39)，差异有统计学意义(P＜0．001)。免疫组化分析显示，在COPD模型组小鼠骨骼肌中，自噬相关分子Beclin1较正常对照组升高，P62较正常对照组下降，肌肉萎缩相关分子标记物FBXO32及TRIM63均明显高于正常对照组，差异均有统计学意义(P＜0．001)。免疫荧光分析显示，在COPD模型小鼠骨骼肌中，NF－κBP65入核表达(18．00±2．55)明显高于正常对照组(7．60±1．52)，差异有统计学意义(P＜0．001)。结论COPD小鼠骨骼肌萎缩潜在的分子机制可能与香烟烟雾激活的自噬调控炎症因子表达有关。

【关键词】小鼠；慢性阻塞性肺疾病；骨骼肌；萎缩

慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是一种以气流受限且不完全可逆为特征的常见呼吸系统疾病，严重影响患者身心健康，死因位列全球第3位，致残率位列全球第5位［1］。目前研究发现，COPD不仅为表现在肺部的单一疾病，而且还累及全身多个系统，产生广泛的肺外损伤效应，包括心血管系统疾病、自主神经功能紊乱及骨骼肌萎缩等［1，2］。其中骨骼肌萎缩可严重影响患者的劳动力水平、生活质量甚至是预后，有研究认为其与COPD病死率密切相关，是预测COPD患者死亡的独立危险因素之一［3］。故本研究立足于COPD小鼠动物模型来探讨COPD骨骼肌萎缩可能存在的分子机制。

1材料与方法

1．1实验动物

选取健康雄性6～8周龄SPF级C57BL/6J小鼠20只，体重18～22g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号:SCXK(京)2014－0004，动物批次合格证号:11401300070688。所有动物均在标准环境下饲养，室温20～26℃，相对湿度40%～70%。

1．2仪器和试剂

仪器:脱水机(型号:JJ－12J)、冻台(型号:JB－L5)和包埋机(型号:JB－P5)购自武汉俊杰电子有限公司，病理切片机(型号:RM2016)购自上海徕卡仪器有限公司，组织摊片机(型号:KD－P)购自浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，烤箱(型号:DHG－9140A)购自上海慧泰仪器制造有限公司，微波炉(型号:P70D20TL－P4)购自格兰仕微波炉电器有限公司，摇床(型号:TSY－B)购自武汉谷歌生物科技有限公司，显微镜(型号:DMi1)购自德国徕卡公司。试剂:一抗:Beclin1(货号:ab207612)和P62(货号:ab56416)购自Abcam公司(美国)，FBXO32(货号:12866－1－AP)和TRIM63(货号:55456－1－AP)购自ProteintechGroup公司(美国)，NF－κBP65(货号:8242)购自CellSigna-lingTechnology公司(美国);二抗:辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗鼠以及荧光标记的山羊抗兔均购自KPL公司(美国)，组化试剂盒DAB显色剂购自武汉谷歌生物科技有限公司。

1．3建立COPD动物模型

按照随机数字表法将小鼠随机分为正常组和干预组，每组各10只。正常组不予特殊处理，干预组置于一约50L的密闭容器中，每天全身暴露于10支大前门牌香烟(每支香烟含11mg煤焦油，0．8mg尼古丁)所产生的烟雾中，保持容器中含氧量为18%左右，每次暴露约60min，持续12周，具体方法参见文献［4］。

1．4病理检测

烟熏12周后取小鼠肺组织行苏木精－伊红染色，观察COPD是否造模成功。对两组小鼠趾长伸肌进行取材，4%甲醛固定，对固定后的组织进行脱水、包埋、切片，依次将组织切片放入二甲苯及乙醇中进行脱蜡处理，而后置入抗原修复缓冲液中于微波炉内进行抗原修复，3%牛血清蛋白均匀覆盖组织，室温封闭30min，加入相应的一抗，4℃孵育过夜。滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，室温孵育50min，DAB显色，苏木素或DAPI染核，脱水封片，普通显微镜或荧光显微镜下观察，免疫荧光需避光处理。

1．5计算平均肺泡间隔里衬(meanlinearintercept，MLI)

低倍镜200倍，每个切片随机观察10个视野，每个视野中心划“十”字交叉线，测量“十”字线总长度(L)，计算与交叉线相交的肺泡间隔数(NS)，MLI=L/NS［4］，可反映肺泡平均直径大小。

1．6免疫组化及免疫荧光数据收集

随机选取10个不同的视野，采用图像处理软件IPP6．0进行分析，免疫组化采用光密度值(opticaldensity，OD)表示，免疫荧光采用计算单位视野下merge后核红染的细胞个数。1．7观察指标①观察肺组织病理改变;②比较两组小鼠MLI;③免疫组化法分析两组小鼠骨骼肌中自噬相关蛋白Beclin1及P62的表达和肌肉萎缩相关分子标记物FBXO32及TRIM63的表达;④免疫荧光分析炎症标志物NF－κBP65入核表达情况。1．8统计学方法采用SPSS20．0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(x珋±s)表示，组间比较采用t检验。P＜0．05认为差异具有统计学意义。

2结果

2．1正常对照组和COPD模型组肺组织病理改变比较与正常对照组相比，COPD模型组小鼠肺泡腔直径明显增大，肺泡壁破坏增加，肺泡间隔断裂增多(见图1)，提示COPD小鼠模型成功建立。

2．2两组小鼠MLI比较经统计，COPD模型组小鼠MLI(83．00±12．71)μm明显高于正常对照组小鼠(30．60±4．39)μm，差异具有统计学意义(t=－8．71，P＜0．001)。2．3两组小鼠免疫组化比较与正常对照组相比，自噬相关蛋白Beclin1在COPD模型组小鼠骨骼肌中表达增加，P62在COPD小鼠骨骼肌中表达减少，骨骼肌萎缩相关蛋白TRIM63和FBXO32在COPD小鼠骨骼肌中表达增加，由此可知COPD模型组小鼠骨骼肌中自噬水平较正常组升高，骨骼肌萎缩相关蛋白的表达同样较正常组升高。

2．4两组小鼠骨骼肌细胞NF－κBP65入核比较经统计，COPD模型组NF－κBP65入核阳性细胞数(18．00±2．55)(个/单位视野)明显高于正常对照组(7．60±1．52)(个/单位视野)，差异有统计学意义(t=－7．84，P＜0．001)，由此可知COPD模型组小鼠骨骼肌中炎症水平较正常对照组升高。

3讨论

目前研究已经证实COPD为累及全身多系统的慢性炎症疾病，与吸烟密切相关，骨骼肌萎缩为COPD重要的肺外表现之一。骨骼肌萎缩引起的劳动力下降会给COPD患者及其家庭、社会带来沉重的经济负担［5］。本研究发现，COPD模型小鼠的骨骼肌自噬水平均较正常组升高，NF－κBP65入核表达较正常组升高，同时肌肉萎缩相关分子标记物TRIM63和FBXO32的表达较正常组升高。表明COPD骨骼肌萎缩机制可能与由香烟烟雾激活自噬调控炎症因子表达有关。平均肺泡间隔里衬(MLI)可间接反映肺泡直径的大小，常用来评估COPD模型动物是否造模成功［4］。自噬是指吞噬细胞自身受损、变性的蛋白或细胞器包被入囊泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体并对其进行消化降解的过程［6］。自噬在机体的生理和病理过程中均可发生，有研究表明自噬是把双刃剑，在细胞生理状态下自噬负责降解受损的蛋白或是细胞器以完成细胞的代谢及细胞器的更新。但是在某些病理条件下，过度激活的自噬或是自噬受损会加剧机体的炎症反应及细胞凋亡［7］。Beclin1与P62是常见的自噬相关蛋白，常用来评价自噬水平的高低。Beclin1是参与自噬过程的重要信号分子，可介导多种自噬蛋白定位于自噬体，与多种信号分子发生反应调控自噬的形成与成熟，故Beclin1在自噬激活时表达升高，可作为自噬水平高低的标记物。P62是一种细胞内的多功能蛋白，参与调控多种信号通路，P62可将受损的蛋白或是细胞器等“货物”转运至自噬溶酶体，然后与这些“货物”一起降解，故P62的表达在自噬激活时下降，也常作为自噬水平的标记物［8］。TRIM63与FBXO32是泛素蛋白酶体系统中调节蛋白质降解的关键酶，可作为骨骼肌萎缩的分子标记物［3］。Vij等［9］研究表明，香烟烟雾可诱导自噬从而加重COPD的肺衰老。Ryter等［10］研究发现，香烟烟雾诱导的自噬激活可引起气道上皮细胞的凋亡。抑制自噬可抑制香烟烟雾或是细微颗粒诱导的气道上皮细胞的炎症反应及黏液高分泌［11，12］。我们此前研究表明14，15－环氧二十碳三烯酸可通过抑制自噬减轻香烟烟雾诱导的支气管上皮细胞的炎症反应［13］。本研究提示，在香烟烟雾诱导的COPD模型小鼠MLI高于正常对照组，骨骼肌中自噬相关分子Beclin1表达升高及P62的表达下降，TRIM63和FBXO32的表达升高，NF－κBP65入核表达较正常对照组高，说明在COPD小鼠的骨骼肌中自噬及炎症水平与气道中一致，在香烟烟雾刺激下均升高。NF－κB广泛存在于真核细胞中，是重要的转录调节因子，可参与细胞的炎症、凋亡及增殖等多种生理及病理过程。研究表明，激活NF－κB可导致骨骼肌萎缩［14］。COPD患者膈肌中泛素蛋白酶体系统被激活，可加速膈肌蛋白的降解，导致肌肉萎缩［15］。Haegens等［16］发现，NF－κB的激活可诱导FBXO32及TRIM63的表达，从而启动泛素蛋白酶体系统，加快骨骼肌蛋白的降解。由此可知，抑制自噬和NF－κB转录活性可降低由于香烟烟雾刺激引起的COPD的骨骼肌萎缩。

4结论

COPD骨骼肌萎缩机制复杂，本研究提示可能与香烟烟雾激活自噬引起的骨骼肌细胞NF－κBP65入核表达增加有关。但本研究仅限于动物模型，具体的分子机制及相关通路需我们更为深入的研究。

作者：吴艳军；李云霄；王浩彦；谭春婷；徐波；于刚刚单位：首都医科大学附属北京友谊医院呼吸内科