磷酸盐还原菌的菌株鉴定范文

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摘要：目的：筛选出磷酸盐还原菌。方法：将污泥稀释并采用平板涂布法分离提纯磷酸盐还原菌，选取除磷效果良好的细菌通过显微镜观察进行形态学鉴定和分子生物学的鉴定。培养得到一株磷酸盐还原菌YING18并通过细菌形态、生理生化指标、培养特征和16SrDNA序列进行同源性比较，鉴定该菌株与登录号为Enterobactersp.KC736654.1的同源性高达99%。

关键词：磷酸盐还原菌；菌株纯化；菌株鉴定 

磷酸盐还原现象的发现改变了人们对磷素循环的认知，磷酸盐还原工艺以其特有的优势、效能逐渐成为除磷工艺研究的热点。迄今为止，关于磷酸盐还原菌的生长和除磷的特性研究鲜见报道。为探究磷酸盐还原菌的生长特性和除磷能力，加深对磷酸盐还原菌的了解，通过以厌氧除磷反应机理为理论依据，采用经过磷酸盐还原菌驯化和富集的厌氧活性污泥作为种泥，使用微生物的分离、提纯以及鉴定方法提纯出具备磷酸盐还原功能的细菌，再对分离出的磷酸盐还原菌进行鉴定，希望为磷酸盐还原工艺的开发提效、功能菌群的富集驯化提供理论支持。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试污泥接种污泥取自抚顺三宝屯污水处理厂的厌氧池内污泥，其含水率为98%，MLSS质量浓度和MLVSS质量浓度为4.53g/L和2.36g/L，pH为7.4。1.1.2筛选磷酸盐还原菌的基础培养液C6H12O60.9g，Na2PO4•12H2O0.46g，NH4Cl0.76g，微量元素0.3mL配比见表1

1.2试验方案

1.2.1磷酸盐还原菌的分离、纯化在磷酸盐还原反应器启动成功后，提取反应器中的活性污泥1mL，于无菌三角烧瓶中，加入适量的无菌水及数粒无菌玻璃珠震荡摇匀，将污泥震荡打散，使菌粒均匀分布于溶液中，再利用10倍稀释法对菌悬液，将菌悬液稀释至适宜浓度。之后在无菌操作台中，将稀释后的菌悬液接种于富磷发酵培养基，采用平板涂布法使细菌均匀分布于培养基表面，每个浓度3组平行样，并将平板以保险膜密封，于30℃在恒温培养箱培养，待菌落长出后，从菌落分布均匀，数量适宜的培养皿中挑选具有明显特征的菌落转接至新的培养基中，以达到菌种的分离。如图1所示。图1菌种分离1.2.2菌株的纯化根据菌落的外观和革兰氏染色的观察结果，在超净工作台上用接种环挑取第一代培养基中特征明显的菌落，观察菌落外观和革兰氏染色结果，将相同的菌株只保留一个，之后在新的固体培养基的表面进行连续的划线操作。重复划线4～5次，结合对菌落的观察和革兰氏染色的结果，共获得22株纯种细菌。如图2所示。图2菌种纯化1.2.3菌株的富集配制富磷发酵液体培养基装于三角烧瓶中，并利用吹氮法排除空气（O2）于121℃的条件下灭菌20min，待培养基冷却至室温后接种纯化后的细菌，放入30℃的恒温培养箱中培养24h，以达到富集培养的作用，如图3所示。此程序获得的细菌用于细菌的生长特性试验。图3菌株富集1.2.4菌株的初筛在长出细菌的平板上，对分离纯化后的22株细菌进行菌落特征的观察，记录细菌的透明度、颜色、边缘等形态，以及革兰氏染色后细菌的形态。将22株细菌分别接种于含磷发酵培养基的厌氧管中（PO43--P为10mg/L），如表2所示为分离出的22株细菌的菌落特征及培养3d后各菌株对PO43--P的降解情况由表2可知，所筛选出的22株细菌有以下四种形态：短杆状、长杆状、球状、链杆状，其中以杆状为主，菌株之间的菌落形态差别较大，染色结果显示，绝大多数的细菌是革兰氏阴性菌。从表2中可以看出，培养3d后，每株细菌都表现出了不同的对PO43--P的去除能力。其中YING6、YG7、YG13、YING18、YING21、YING22，去除率超出20%，具备较良好的除磷能力，因此对以上6株细菌进行磷化氢产气的试验。1.2.5磷酸盐还原菌的复筛将1.2中挑选出的6株具有良好除磷能力的细菌接种于磷化氢检测装置中，表3所示为6株细菌的产气试验结果。由表可知，筛选出的6株细菌其中有YG7、YING18号菌具有产磷化氢气体的功能。故对以上两株细菌进行进一步的研究。菌株YG7的菌落特征为：浅白色，微光泽，圆形，点状小；镜检结果为革兰氏阳性菌，短杆状，有芽孢（其形态见图4）。菌株YING18的菌落特征为：浅黄色，薄，雾状，边缘整齐，勃稠；镜检结果为革兰氏阴性菌，短杆状，无芽孢（其形态见图4）。图4菌落形态1.2.6生理生化指标鉴定利用《常见细菌系统鉴定》的检测方法，对细菌的接触酶、葡萄糖发酵、醇发酵、甲基红、V-P、淀粉水解等指标进行试验。1.2.7DNA提取、PCR扩增、基因序列对比使用TaKaRa试剂盒，将基因组DNA纯化后提取出来备用。试验方法详见试剂盒说明书。然后对提取出的DNA进行PCR扩增，其程序为：94℃变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s共30个循环72℃补充延伸5min；4℃终止保存。所得扩增产物送往北京华大基因公司进行高通量测序。据所得的16rDNA基因序列，在Genblank数据库中进行Blast序列的相关性搜索。

2结果与分析

2.1菌株的生理生化特征

微生物的生理生化特征是指微生物的代谢产物或需要代谢的物质参与化学反应而表现出不同的现象和结果，通过这些化学反应的结果可以鉴别一些在形态和其他方面不易区分的微生物。因此微生物的生理生化特征是微生物分类鉴定的重要依据之一。如表4所示为7、18号细菌的生理生化特性。根据以上得出的试验结果，并查阅《常见细菌系统鉴定》，初步鉴定YG7菌是芽孢杆菌属，YING18菌是肠杆菌属。

2.2YING18菌株的基因序列分析

YING18菌株的16rDNA的PCR扩增电泳结果见图5，通过与marker-dl2000标准条带比对，发现代表菌株的片段长度处于1000~2000，条带清晰明亮，无杂质。图5PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳成像图将测序后的结果在NCBI上进行Blast对比，得出菌株YING18与登录号为Enterobactersp.KC736654.1的相似度最高，相似度为99%，确定其为肠杆菌属，此结果对应第2.1节中的细菌的生理生化实验。

3结语

以污水厂厌氧池污泥为种泥，经过分离和多次纯化，得到菌落特征不同的纯培养物，共计22株。而后对提取出的22株分别进行除磷能力分析，培养3d后，磷酸盐去除率超过20%的细菌共有6株细菌。对这6株细菌进行磷化氢的检测试验，发现YG7、YING18有磷化氢气体产生，之后对两株细菌进行生理生化鉴定初步确定YG7是芽孢杆菌，YING18是肠杆菌。并通过细菌形态、生理生化指标、培养特征和16SrDNA序列进行同源性比较，鉴定YING18菌株与登录号为Enterobactersp.KC736654.1的同源性高达99%。

参考文献：

［1］周康群，刘晖，孙彦富，等.厌氧条件总磷还原为磷化氢种泥筛选及功能菌株鉴定［J］.生态环境，2007（06）：1669-1673.

［2］王瑾丰，牛晓君，马金玲，等.厌氧条件下微生物将磷还原为磷化氢［J］.微生物学通报，2015，42（01）：34-41.

［3］李海云.高盐度废水处理中优势耐盐菌的鉴定及其生长特性初步研究［D］.青岛：青岛大学，2009.

［4］付玲玲.苯酚降解菌的筛选及其特性的研究［D］.沈阳：东北大学，2009.

［5］陈舒.反硝化聚磷菌的筛选鉴定及其脱氮除磷特性研究［D］.青岛：青岛大学，2012.

［6］李海云.高盐度废水处理中优势耐盐菌的鉴定及其生长特性初步研究［D］.青岛：青岛大学，2009.

作者：马榕徽 单位:沈阳建筑大学