酶联免疫法测定水中氯霉素探讨范文

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《供水技术杂志》2016年第5期

摘要:

氯霉素药物在水产及畜牧业使用广泛，相关的行业用水及抗生素生产废水会在水域中残留，若被人体长期摄取，会造成被动的抗生素滥用，严重影响民众身体健康水平，因此水中氯霉素的检测需要引起重视。开发了一种针对水样品中氯霉素的快速检测方法。通过比较确定氮吹法为最优的前处理方法，并得到了较高的检测灵敏度(25ng/L)。本研究为ELISA法在水质检测中的应用提供了一个范例，给水源污染应急检测提供一个快速检测方案。

关键词:

酶联免疫法;氯霉素;冻干;氮吹

酶联免疫法自1971年建立以来，由于其极高的灵敏度、特异性及适用性，已成为生物及分析化学领域的前沿课题［1］。目前此法在医学、检测食品药物残留方面有广泛成熟的应用，而在水质检测中报导较少。形成这种情况的重要原因之一是ELISA研发过程中的样品处理方式不适用于水质样本检测。氯霉素属广谱类抗生素药物，能抑制尤其是革兰氏阴性菌细菌蛋白质的合成，对各种立克氏体、原虫及部分病毒也有一定的抑制作用［2］。目前氯霉素类药物在水产和畜禽养殖中仍应用广泛，添加氯霉素的水产养殖水和抗生素制药厂偷排的废水是环境中氯霉素的来源。因此氯霉素的环境污染，尤其是水域中的污染是值得重视的问题［3］。目前检测氯霉素方法包括高效液相色谱法［4－5］、气相色谱法［6］、质谱法［7－9］等，其分析时间长、样品前处理复杂、需要昂贵的仪器且对操作人员技能有很高的要求。本文将探索酶联免疫法如何与适合的样品前处理技术结合，以氯霉素(Chloramphenicol)为目标物，测定水中的氯霉素含量。而ELISA方法不但有极高的特异性、准确度和灵敏度，还具有检测速度快、同时检测大量样本、方便易用的特点。

1材料与方法

1.1试剂和仪器

试剂:氯霉素标准溶液100μg/mL(甲醇溶剂，国家标准物质中心)、乙腈(色谱纯)、乙酸乙酯(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，Milli－P超纯水，氯霉素检测试剂盒(深圳市易瑞生物技术有限公司)。仪器:ThermoMultiskanFC96孔酶标仪(配备450和630nm滤光片);Eppendorf5702离心机(转速4000r/min);DenverInstrument天平(感量0．00001g);IKAMS3basic涡旋仪;氮气吹干仪;Thermofinnpippete移液器:单道10～100μL、100～1000μL、多道30～300μL。

1.2试验方法

1.2.1准备

使用试剂盒前将试剂和微孔板回温至室温，用后放回2～8℃。取出需要数量的微孔板，其余的放入自封袋中，保存于2～8℃。建议每个样品和标准液做2次平行试验。

1.2.2加样

加入标准品/样品50μL到相应微孔，然后加入酶结合物50μL到每个微孔，最后加入抗体工作液50μL到每孔，轻轻震荡混匀后，盖上盖板膜。

1.2.3孵育

室温25℃下避光反应30min。

1.2.4洗板

小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加1×洗涤液250μL/孔，重复洗涤5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。

1.2.5显色

每孔依次加入底物液A50μL，底物液B50μL，轻轻震荡混匀后，盖上盖板膜，25℃室温下避光反应15min。

1.2.6终止和读值

加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。

1.2.7样品处理方法

取1mL水样于1．5mL离心管中;采样不同的富集方式进行浓缩;加入样本复溶液0．2mL，涡旋震荡5min后用于点样(样本稀释倍数为0．2倍)。

1.3计算方法

标准品和样品的平均吸光度值(平均OD值)除以零标准的平均吸光度值(平均OD值)，再乘以100。零标准为100%(最大吸光度值)，其他OD值为最大吸光度的百分数。吸光度值%=BB0×100%式中B———标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0———0ppb标准溶液的平均吸光度值校准曲线以log(标准品浓度)为横坐标，以Logit(B/B0)为纵坐标，构建线性回归方程。将样品的Logit(B/B0)值代入上述回归方程，求得的值乘以样本稀释倍数0．2，即为样本中氯霉素含量。

2结果与分析

2.1水中氯霉素的富集

2.1.1富集方式的选择

水中痕量抗生素富集方法可以用冻干法或氮吹浓缩富集法。冻干法是取1mL水样品，冷冻成冰干燥过夜后再测定。选取了新鲜制备的双蒸水作为阴性样本。通过在1mL阴性样本中添加不同量的氯霉素，对两种方法进行回收率对比实验，结果见表1。对比试验表明冻干法回收率略高于氮吹法。冻干法可很好地实现水溶液中氯霉素的富集，但操作时间过长(16h以上)，且需要配备冻干机。氮吹浓缩时间较短，试验回收率也能满足回收率＞70%的检测要求。本次选用氮吹浓缩进行水中氯霉素的富集。

2.1.2富集用有机溶剂的选择

因水相对常用有机溶剂来说沸点较高，不易吹干，需通过往水中掺和有机溶剂形成低沸混合物的方法来有效降低水的沸点，从而提高氮吹浓缩时效。根据氯霉素的溶解性、有机溶剂与水的互溶性、共沸物形成情况等因素，选定乙腈作为水中氯霉素浓缩富集的有机溶剂。

2.1.3富集用有机溶剂与水比例的选择

1mL水样品中添加不同含量乙腈对浓缩干燥时间有一定影响。在78℃加热，1mL水样品中添加1，3，5，7，9和11mL的乙腈，干燥时间如下表2所示。随乙腈加量增加，干燥时间先降后升。当乙腈:水比例为9∶1时，所需时间最短，此时最接近乙腈－水共沸物(乙腈含量85%，共沸点76℃)［10］。故选用乙腈∶水(9∶1)作为富集用低沸混合溶剂。不同乙腈掺和量的样品干燥时间如表2所示。

2.2试剂盒有效性复核

2.2.1线性检测

配置0，25，100，400和1600ng/L的5点标准点，绘制标准曲线，标准曲线的R2值为0．993，线性较好，符合检测要求。氯霉素ELISA的标准曲线如图1所示。

2.2.2检出限

以超纯水为空白样品，测定6个空白样品的平均值，再加上3倍标准差，即为检测限。配置0，25，100，400，1600ng/L的5点标准曲线(R2=0．993)，计算由上表可知检测限为24．81ng/L，与试剂盒检出限标识相符。

2.3实际样品测试

选取了具有代表性的5个出厂水和6个管网水点位的样本进行了实际样品检测。5个出厂水，分别编号为:CC1，CC2，CC3，CC4，CC5;6个管网水，分别编号为GW1，GW2，GW3，GW4，GW5，GW6。平行测试3次，取平均值，测定结果如表4所示。

3结论

①通过优化选择，获得了水质样本ELISA检测前处理的合适方法。将进一步提高ELISA检测在水环境检测中的应用前景。

②氮吹－ELISA法的建立应用，大大提高了检测时效，适合水质样品的快速筛查定量。该方法对控制水质安全，应对突发性安全事件等水质监控具有重要意义。

参考文献:

［2］周正红，邓斌，林保银．氯霉素类抗生素残留分析研究进展［J］．肉类研究，2006，2(1)，34－38．

［3］韩敏奇，蒋增辉，陆志惠，等．酶联免疫法测定上海原水中四环素浓度［J］．供水技术，2015，9(6):57－59．

［4］彭莉，岳秀英．高效液相色谱法测定牛奶中的氯霉素残留［J］．中国兽医药志，2002，36(8):23－24，22．

［5］李兰生，王勇强．氯霉素在对虾全内的动力学研究［J］．色谱，1997，15(5):431．

［6］王太全，钱成，徐成，等．气相色谱法测定出品龙虾中氯霉素残留量的研究［J］．肉品卫生，2003，9(1):11－14．

［7］孙亮，陈海东．GC－MS/MS测定虾仁中氯霉素的研究［J］．中国卫生检验杂志，2003，13(3):293－294．

［8］张辉．离子阱时间串联质谱测定食品中的氯霉素［J］．浙江科技学院学报，2003，15(11):46－47．

［9］杨成对，宋莉晖，毛丽哈，等．对虾中氯霉素残留的分析方法研究［J］．分析化学研究简报，2004，32(7):905－907．

［10］穆光照．实用溶剂手册［M］．上海:上海科技出版社，1990．

作者:刘静 董煜杰 严义勇 单位:成都市自来水有限责任公司水质中心 深圳市易瑞生物技术有限公司