细胞增殖论文范文

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第1篇

【关键词】骨髓内皮细胞GMCSF细胞增殖

EffectsofGranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactoronGrowthofMurineBoneMarrowEndothelialCells

AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)onthegrowthofmousebonemarrowendothelialcells.Endothelialcellculturemedium（EndoM）wasusedtoculturemurinebonemarrowendothelialcells.EndothelialcellcolonieswerecountedundermicroscopebyWrightGiemsastaining.TheeffectofdifferentconcentriationofGMCSFontheproliferationofbonemarrowendothelialcellswasobservedbytheformationofendothelialcellcolonies,MTTandflowcytometry.TheresultsindicatedthattheendothelialspecificmarkervWFwasexpressedbythecolonycells,GMCSFpromotedtheproliferationofbonemarrowendothelialcellcoloniesandMTTconfirmedtheeffectofGMCSFonpromotingtheproliferationofbonemarrowendothelialcells.TheresultofdetectingcellcycleshowedthattherateofcellsenteringintoSphasewas9.3%inGMCSFaddedgroupandtherateofcellsenteringintoSphasewas2.1%incontrol.Therewasnosignificantdifferenceincellgrowthcurvebetweenthefirstpassageandfourthpassage.ItisconcludedthatGMCSFcanpromotetheproliferationofbonemarrowendothelialcells,theproliferationpotentialofbonemarrowendothelialcellsbetweenthefirstandfourthpassagenosignificantlychanges.

Keywordsbonemarrowendothelialcells;GMCSF;proliferation

JExpHematol2007;15(3):622-625

目前，已有许多报道证明内皮细胞（endothelialcells,EC）、内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPC）可以用来治疗缺血性心脏病以及各种疾病引起的肢体缺血［1,2］也可以用于组织工程的血管构建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］报道，EPC对缺血心脏病进行治疗具有良好的效果，一方面减少了缺血组织的面积，同时改善了心脏的功能。Kalka等［5］则报道了利用EPC对肢体缺血的小鼠模型进行治疗，实验结果表明了EPC能显著增加缺血肢体的灌流，而且组织学检查发现缺血部位毛细血管的数目也大大增加。内皮细胞的来源有多种，可以从外周血、脐血及骨髓中获得［6］，而外周血中的内皮祖细胞来源于骨髓。从病人自体的骨髓中获得内皮细胞，一方面来源比较方便，而且也可以避免GVHD的发生。但是由于骨髓基质细胞种类多，难以分离纯化骨髓内皮细胞或内皮祖细胞。本研究用本实验室配制的内皮细胞培养液（EndoM）体外培养小鼠骨髓细胞，分离纯化骨髓内皮细胞及内皮祖细胞，并观察粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）对小鼠骨髓内皮细胞体外增殖的影响以及体外增殖后内皮细胞增殖机能的改变，这对临床运用内皮细胞或内皮祖细胞治疗疾病有一定的指导意义。

动物

昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供，雌雄不限，普通饮食。

主要试剂和仪器

IMDM为Gibco公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物制品研究所；重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子（rmGMCSF）为R&D公司产品；vWF抗体、CY3标记的羊抗兔IgG为Sigma公司产品；MTT、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；酶标仪为Awarens公司产品；CO2培养箱购自美国Forma。

小鼠骨髓内皮细胞及内皮细胞集落的培养

用颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用IMDM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取1×106个小鼠骨髓单个核细胞种入1ml含有15%新生牛血清的EndoM培养体系，置于24孔板中，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天后,用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按每孔1×104个细胞种入24孔板，每组3孔。于二氧化碳培养箱内培养15天后计数内皮细胞集落数，以≥50个细胞的聚合计为1个集落。

内皮细胞的形态观察及vWF的检测

培养的骨髓内皮细胞集落经WrightGiemsa染色后，显微镜下观察内皮细胞形态。用间接免疫荧光法检测骨髓内皮细胞vWF。将内皮细胞培养于24孔板内放置的盖玻片上，当细胞间没有明显的间隙时，取出盖玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封闭4小时，加入vWF抗体，4℃过夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37℃孵育60分钟,PBS洗3次：置于荧光显微镜下观察。以本室建的小鼠骨髓内皮细胞株［7］为阳性对照，骨髓成纤维细胞为阴性对照。

不同浓度的GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞形成集落的影响

取纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于24孔板中，每孔5000个细胞，在基本培养体系（含1%浓度EndoM）的基础上分别加入5、10、25ng/ml的rmGMCSF，对照组不加入GMCSF，每组3孔。置于CO2培养箱培养15天，于倒置显微镜下记数集落数，≥50个细胞的聚合计为1个内皮细胞集落。

GMCSF对内皮细胞增殖影响的MTT法测定

将纯化的小鼠骨髓内皮细胞按5000个/孔培养于96孔板，每孔0.2ml，每组3孔。实验组培养体系中分别加入5、25、100ng/ml的rmGMCSF，对照组内不加。在37℃、5%CO2、饱和湿度下分别培养5天和10天，取出培养板吸去培养液，然后加入无血清的IMDM180μl和20μlMTT溶液，放入培养箱孵育4小时，吸去液体，各孔加入DMSO150μl，振荡10分钟，使结晶充分溶解。选择492nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值（OD492）。

生长曲线

纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于96孔板中，每孔5000个细胞，加0.2ml含15%新生牛血清的基本培养液，并加入25ng/ml的rmGMCSF。共种6组，每组3孔，培养5天后，分别于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后计数细胞，每次3孔，求平均值，做出生长曲线。按公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代内皮细胞生长的倍增时间。

细胞周期的流式细胞术检测

无菌条件下取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2ml培养体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入两种不同培养体系，对照组加含15%新生牛血清的IMDM，实验组加15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，每组各10孔，置于CO2培养箱培养3天后，用胰酶消化细胞，200×g,离心5分钟，用PBS洗涤细胞2次之后，用300μlPBS重悬细胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）约700μl（终浓度为70%），将细胞放于-20℃过夜处理后，用流式细胞仪检测细胞周期。

细胞传代培养

取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2ml体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入15%新生牛血清的IMDM培养液和100ng/ml的rmGMCSF，促使细胞融合，再按1∶4传代于6孔板中，同样加入15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，等细胞生长至融合，按1∶4传代，加入相同培养体系。按上述方法传4代后，绘制生长曲线，方法同前。公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代内皮细胞生长的倍增时间，并与第1代的倍增时间进行比较。

统计学处理

实验数据为3次结果，以mean±SD表示。不同处理组两组间比较采用t检验，应用SPSS软件分析，P<0.05表示有统计学意义。

结果

细胞形态每孔种入小鼠骨髓内皮细胞5000个，对照组加基础培养液,实验组在基础培养液的基础上分别加入rmGMCSF5、10、25ng/ml。与对照组相比，实验组集落数均明显增多（图3），说明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞的增殖有明显刺激作用。

rmGMCSF对内皮细胞增殖的影响

小鼠骨髓内皮细胞培养5、10天，分别进行MTT的检测，结果表明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长促进作用明显，各组与对照组相比差异显著（P<0.01）（图4）。

GMCSF对EC细胞周期的影响

运用流式细胞仪检测细胞周期，观察GMCSF对EC细胞周期的影响。结果显示GMCSF使细胞进入S期的比例为9.3%，与对照组2.1%相比有明显差别。此结果说明GMCSF能够促使细胞进入S期，加快细胞的分裂，从而促进了细胞的增殖（图5）。Figure5.EffectofGMCSFoncellcycleofendothelialcells.A:grouptreatedbyGMCSF.B:controlgroup.

体外扩增传代对内皮细胞增殖的影响

图6为小鼠骨髓第1代和第4代内皮细胞的生长曲线。利用计算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］计算出第1、4代细胞生长的倍增时间分别为30.25±0.55小时、31.67±0.26小时。第1代与第4代的细胞倍增时间相比，无明显差异，表明经体外扩增传代4次，仍能保持传代早期的增殖潜能。

Figure6.Growthcurveofthefirstandfourthpassagegenerationsofmurineboneendothelialcells.讨论

国内外对于骨髓内皮细胞的纯化报道较少，但已经进行了一些关于细胞因子对内皮细胞增殖影响的研究，如Yonekura等［8］报道VEGF可以促进内皮细胞的增殖，Rieck等［9］则报道bFGF可促进角膜内皮细胞的生长。我们此前曾报道了VEGF、bFGF、SCF、IL6、GMCSF等对内皮细胞株的增殖有促进作用［10］。GMCSF对未经转化的骨髓内皮细胞增殖的作用尚未见报道。本研究中，我们用本室配制的培养基在较短的时间内纯化了小鼠的骨髓内皮细胞，vWF为阳性，并在此基础上观察了GMCSF对骨髓内皮细胞增殖的影响。应用基本培养基培养内皮细胞集落时，形成的集落数较少，加入rmGMCSF后，集落生成明显增多。MTT的结果亦支持GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长的刺激作用。细胞生长曲线的结果表明，在含GMCSF培养的条件下，内皮细胞生长的倍增时间为30.25±0.55小时，经4次传代后细胞倍增时间无明显延长，表明体外培养扩增4代后，细胞仍能保持早期的增殖能力，GMCSF对骨髓内皮细胞的体外增殖有明显刺激作用。文献报道内皮细胞表面有GMCSFR的存在，而内皮细胞本身也可以分泌GMCSF［11］。结合细胞周期测定的结果，可以认为，GMCSF促内皮细胞增殖的机制可能是GMCSF与GMCSFR结合，通过细胞内信号传递使更多的细胞进入S期来实现的。

【参考文献】

1LuttunA,CarmelietG,CarmelietP.Vascularprogenitors:frombiologytotreatment.TrendsCardiovascMed,2002;12:88-96

2RafiiS,LydenD.Therapeuticstemandprogenitorcelltransplantationfororganvascularizationandregeneration.NatMed,2003;9:702-712

3ZammarettiP,ZaischAH.Adult‘endothelialprogenitorcells’.Renewingvasculature.IntJBiochemCellBiol,2005;37:493-503

4KalkaC,MasudaH,TakahashiT,etal.Transplantationofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization.ProcNatlAcadSciUSA,2000;97:3422-3427

5KawamotoA,TkebuchavaT,YamaguchiJ,etal.Intramyocardialtransplantationofautologousendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularizationofmyocardialischemia.Circulation,2003;107:461-468

6HristovM,ErlW,WeberPC.EndothelialProgenitorCells:isolationandcharacterization.TrendsCardiovascMed,2003;13:201-206

7王绮如，严燕，汪保和.小鼠骨髓内皮细胞系的建立.中国实验血液学杂志，1997；5：360-366

8YonekuraH,SakuraiS,LiuX,etal.PlacentagrowthfactorandvascularendothelialgrowthfactorBandCexpressioninmicrovascularendothelialcellsandpericyts.Implicationinautocrineandparacrineregulationofangiogenesis.JBiolChem,1999;274:35172-35178

9RieckP,OliverL,EngelmannK,etal.Theroleofexogenous/endogenousbasicfibroblastgrowthfactor(FGF2)andtransforminggrowthfactorsbeta(TGFbeta1)onhumancornealendothelialcellsproliferationinvitro.ExpCellRes,1995;220:36-46

第2篇

【关键词】人乳铁蛋白；癌细胞；细胞增殖

人乳铁蛋白(HumanLactoferrin，hLF)是主要存在于人乳清中的球蛋白，乳汁别是初乳中含量最高，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用。国外有学者将其应用于肿瘤患者的治疗，但是对其作用机制的研究较少。目前国内较少有关于hLF作用于细胞的报道，我们选用易早期转移的鼻咽癌(NPC)细胞作为研究对象，以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肝脏细胞(L02)作为正常细胞对照，观察hLF在体外是否具有抑制癌细胞生长的作用，探讨hLF抗肿瘤的作用机制，从而为肿瘤的治疗提供研究基础，为临床实验及应用提供新的理论依据。

一、材料与方法

1.1材料人鼻咽癌细胞(CNE)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肝脏细胞(L02)均购自中国科学院上海细胞资源中心。重组hLF(Lot:L0520，溶于PBS中，储存浓度5mg/ml，-20℃储存备用)和噻唑蓝(MTT，Lot:M2128)均购自Sigma公司。RPMI1640、胎牛血清购自HyClone公司。其他试剂均为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养各细胞系均应用含10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI1640培养基，5%CO2，37℃培养。

1.2.2MTT法检测细胞增殖设空白对照组和hLF干预组。待细胞生长至对数生长期，接种于96孔细胞培养板，接种数为5×104/孔。每组细胞设5个平行孔，各组细胞分别加入不同浓度的hLF(0，1.25×10-3,2.5×10-3，5×10-3，10×10-3，20×10-3，40×10-3g/L)，每孔均为200μl。作用24h后，加入MTT(5g/L，每孔20μl)，继续培养4h，测定A570nm吸光度。

1.2.3细胞形态观察细胞经hLF处理后，倾去上层悬浮死细胞并用PBS洗两遍，加入新鲜培养基。同样处理对照孔细胞，将细胞置于倒置显微镜下，观察细胞形态的变化。

1.3统计学处理数据用x±s表示，组间比较用方差分析。

二、结果

2.1重组hLF对鼻咽癌细胞CNE、人肝脏细胞L02、中国仓鼠细胞CHO系的增殖能力的影响对CNE呈现剂量依赖性的抑制作用，而对正常细胞无抑制作用。人乳铁蛋白对各细胞体外增殖的影响与空白对照比较:1)P<0.05

2.2细胞形态学观察显微镜镜下可见，空白对照组癌细胞密集成片生长，如铺路卵石状，细胞膜圆润，透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。hLF处理组癌细胞形态发生明显的改变，随hLF浓度增加，细胞从正常的增殖旺盛的贴壁生长，逐渐表现为生长缓慢，黏附力降低，细胞变圆，细胞胞质粗糙，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差，细胞形态完整性受损，而正常细胞在细胞镜检图hLF作用下无显著变化。

三、讨论

hLF多种生物学功能通过免疫系统的激活与调节得以实现。Bezaul研究发现，乳铁蛋白能抑制鼠实体瘤的生长和转移。肿瘤内注射LF，可以明显的减小实体瘤的体积，且作用效果与LF干预天数相关。研究发现，乳铁蛋白的抗头颈部肿瘤作用是通过抑制肿瘤细胞增殖实现的。Wolf等发现，人乳铁蛋白通过阻断头颈部肿瘤细胞由G0到G1期的转化来抑制肿瘤细胞的增殖。人乳铁蛋白对鼠的SCC细胞系生长的抑制作用，与剂量成正相关；而且人乳铁蛋白抑制头颈部细胞癌的作用是通过直接的细胞毒作用及系统性的免疫调节作用实现的。

Varadhachary等人做了大量的口服临床试验，证实乳铁蛋白无药物相关的有害作用。鼻咽癌作为头颈部肿瘤之一，其恶性程度较高，早期即可出现颈部淋巴结转移，临床上有转移至骨盆、肺、肝等多器官的病例。选用鼻咽癌细胞作为研究对象，具有一定的代表意义。

本研究结果显示，人乳铁蛋白可以抑制鼻咽癌细胞增殖，且呈剂量依赖性，对正常细胞的增殖无明显抑制作用。这一结果，为开发乳铁蛋白的抗癌功效提供了理论依据。

【参考文献】

第3篇

固定资产折旧额，是固定资产磨损价值货币表现，在一定时期内提取折旧的数额，取决于固定资产的规模与固定资产的磨损程度，这是传统会计核算折旧额时所遵循的原则。但在通货膨胀、物价上涨过快的条件下，计算折旧时，除了仍应遵循上述基本原则外，还应当考虑通货膨胀、货币贬值的因素，因为只有这样，才能保证所提折旧基金，能够从使用价值上恢复原有规模。如1985年投资100万元，购买每辆载重吨位4吨的10辆载重汽车，寿命期为10年，提取折旧100万元，1995年这批汽车报废，由于物价上涨，再用这100万元折旧额就无法购买具有原使用价值的10辆载重汽车。因此，在新的条件下，折旧额应当要保证固定资产原有使用价值得以补偿，这是折旧额应当遵循的原则之一，同时，亦是资产保值应遵守的准则。

二、折旧额的核算方法

（一）固定资产磨损价值贬值的量变规律。

为了正确地核算折旧额，即在通货膨胀条件下，能抵补货币贬值的损失，在固定资产寿命期各个时间阶段上所计算的折旧额之和，能够满足从使用价值上恢复原有固定资产规模的需要，这首先就需要分析固定资产磨损价值贬值的量变规律。

固定资产是长期使用的物质资料，而生产性的固定资产是物质产品生产过程中的劳动资料。因而，固定资产再生产的过程是：

购置建造一交付使用一报废一再购置建造。

从上述过程可以看出：建（购）置是固定资产原始价值的始点，报废是固定资产原始价值的终点。在寿命期中，固定资产每年在提取折旧后，其金额必要产生一个无形贬值量。这个贬值量的变化过程可用公式表示如下：

式中：Z代表固定资产原值；Z’代表货币贬值的损失量；Y代表年折旧额；L代表物价上涨率；l，2…n代表时序；n代表固定资产使用年限。

在通货膨胀条件下，为了避免固定资产贬值的损失，在核算折；日时，应当把贬值（Z’）加到折旧额中，进入产品成本，待产品出售后，收回折旧以满足更新固定资产的需要。

（二）核算折旧的公式设想。

上面从递减折旧的观点，考察固定资产逐年递减的贬值量的变化规律的，但为了正确计算年折旧额，可以从另外一个角度观察这个问题，即一方面以整个固定资产原值为基数，随着时间的推移，由于通货膨胀，货币贬值，可把逐年贬值量加到固定资产原值中去，使固定资产从其生命的始点到生命的终点，仍能保值。另一方面每年提取的折旧额，从第～年末开始，直至折旧终止为止亦逐年加进一个贬值额，并假定固定资产在报废时无残值，则可建立如下公式：

把上述方程作为如下整理，则：

整理后简得：

现仍以本文前面购买10辆汽车为例：

Z=100万元，n=10年

则该批汽车的年折旧额为：

计算结果，每年提取13．8909万元，在10年物价总水平上升87．186%的条件下，在10年后仍然能够购买载重量为4吨的10辆载重汽车。然而按传统的方法计算折旧，即100万元10年=10万元，在通货膨胀条件下，所计算的折旧总额，是无法按照原有固定资产使用价值规模更新全部固定资产，即无法保证固定资产保值的。

三、核算折旧额的几个具体问题

通过实例证明，笔者认为上面所设计并经过推导，论证所建立的在通货膨胀条件下，计算折旧额的公式是科学的，但在应用公式时，仍有下列问题需做进一步的研究。

（一）价格指数的选择。

通货膨胀，物价上涨，这是一个普遍的问题。但在现实经济生活中，由于各种商品在国计民生中的作用不同，因而其物价上涨幅度是不相同的。因此，在我国实际工作中编制有各种性质的价格指数。那么在计算固定资产折旧额时，应当采用哪种价格指数为宜呢？笔者认为，应当采用国家统计局编制的固定资产投资价格指数。这一指数综合反映我国固定资产投资价格的变动程度，而且与折旧额的联系最为密切。

（二）固定资产贬值率总额。

固定资产折旧的计算是一个十分重要经济问题，它关系到正确评价企业经济效益与国家财政收入等问题。因此国家财政部门应当根据固定资产投资价格总指数与分类指数，考虑到未来一段时期内经济发展的趋势，对价格变动作出预测，并以定额参数的形式公布，供各企业计算折旧时采用。当然我们不否认制定定额参数即货币贬值的定额参数是十分复杂的工作。但为了保证这项工作的准确性与科学性，可以在预测的基础上经有关专家讨论，尔后经有关权威机构批准，再行公布采用。

（三）定额贬值率与实际贬值率的问题。

货币定额贬值率与实际贬值率是要发生离差的，因此，根据定额货币贬值率计算的折旧额和实际货币贬值率计算的数值之间，必须要产生一个差数，为此需要调整。一般来讲，在年度执行过程中，可按货币定额贬值率计算，待年终决算时，再根据实际货币贬值率进行调整，其公式如下：

YI=Y[l＋（L1－L）]

式中：YI代表调整后的折旧额；Y代表按货币定额或预计贬值率折旧额；LI代表实际货币贬值率；L代表定额货币贬值率。

设Y=13．8909万元；L1＝0．07；L＝0．0647

第4篇

论文关键词：EM原露在信鸽饲养中的应用

 

“EM”是“有益微生物群”的英文缩写，是日本琉球大学比嘉照夫教授等研究出来的新型复合微生物菌剂，它由光和细菌、乳酸菌、酵母菌等10个属、80多种微生物复合培养而成。国内已有很多厂家生产此类产品。微生物不仅含有较高的优良蛋白质、氨基酸，还有丰富的维生素以及大量的类胡萝卜素、抗病毒物质、生长促进因子和提高群体免疫能力的活性物质，作为添加剂加入饲料中饲喂能促进生长，提高抗病能力。用EM液养禽有提高饲料转化率、促进禽类生长、防治消化道疾病、使饲料脱毒、改善环境卫生、提高繁殖率和幼雏成活率等作用。

一、EM原露的主要成分

1、光合菌群（好气性和嫌气性）。如光合细菌和蓝藻类。具有光合作用和固氮作用。属于独立营养微生物 ，能自我增殖。菌体本身含60%以上的蛋白质 ，且富含多种维生素，还含有辅酶Q10、抗病毒物质和促生长因子；它以土壤接受的光和热为能源，将土壤中的硫氢和碳氢化合物中的氢分离出来，变有害物质为无害物质，并以植物根部的分泌物、土壤中的有机物、有害气体（硫化氢等）及二氧化碳、氮等为基质，合成糖类、氨基酸类、维生素类、氮素化合物、抗病毒物质和生理活性物质等，是肥沃土壤和促进动植物生长的重要力量。

光合菌群的代谢物质可以被植物直接吸收，还可以成为其它微生物繁殖的养分。光合细菌如果增殖，其它的有益微生物也会增殖。例如：VA菌根菌以光合菌分泌的氨基酸为食饵 ，它既能溶解不溶性磷，又能与固氮菌共生，使其固氮能力成倍提高。

2、乳酸菌群（嫌气性）。以嗜酸乳杆菌为主导。它靠摄取光合细菌、酵母菌产生的糖类形成乳酸。乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动和有机物的急剧腐败分解。乳酸菌能够分解在常态下不易分解的木质素和纤维素，并消除未分解有机物产生的种种弊端;合成各种氨基酸，维生素、产生消化酶、促进新陈代谢生物论文，还有融化不溶性无机磷的能力。

乳酸菌还能够抑制连作障碍产生的致病菌增殖。致病菌活跃，有害线虫会急剧增加，植物就会衰弱，乳酸菌抑制了致病菌，有害线虫便会逐渐消失论文的格式。

3、酵母菌群（好气性）。它利用植物根部产生的分泌物、光合菌合成的氨基酸、糖类及其它有机物质产生发酵力，合成促进根系生长及细胞分裂的活性化物质。酵母菌在EM原露中对于促进其它有效微生物（如乳酸菌、放线菌）增殖所需要的基质（食物）提供重要的给养保障。此外，酵母菌产生的单细胞蛋白是动物不可缺少的养分。

4、革兰氏阳性放线菌群（好气性）。它从光合细菌中获取氨基酸、氮素等作为基质，产生出各种抗生物质、维生素及酶，可以直接抑制病原菌。它提前获取有害霉菌和细菌增殖所需要的基质，从而抑制它们的增殖，并创造出其它有益微生物增殖的生存环境。放线菌和光合细菌混合后的净菌作用比放线菌单兵作战的杀伤力要大得多。它对难分解的物质，如木质素、纤维素、甲壳素等具有降解作用，并容易被动植物吸收，增强动植物对各种病害的抵抗力和免疫力。放线菌也会促进固氮菌和VA菌根菌增殖。

5、发酵系的丝状菌群（嫌气性）。以发酵酒精时使用的曲霉菌属为主体，它能和其他微生物共存，尤其对土壤中酯的生成有良好效果。因为酒精生成力强，能防止蛆和其他害虫的发生，并可以消除恶臭。

二、EM原露在信鸽所以中作用

EM原露具有改良土壤、增强光合作用、改善水质、除臭粪、促生长、抗病、改善信鸽品质、抑菌等功效。用EM原露饲养信鸽，有几大好处：

1、提高成活率

⑴使有益菌群迅速在肠道内占据优势，调节肠道内微生态平衡。

⑵对肠道无任何刺激，保护肠道内黏膜。

⑶有效预防雏鸡白痢、大肠杆菌等疾病的发生。

⑷保肝护肾，调节机体内分泌，提高免疫力。

⑷有效促进信鸽生长发育。

通过饲喂EM原露，可大大提高信鸽成活率，提高5~10%。

2、提高免疫力

用EM原露长期饲喂信鸽，可以有效的刺激胸腺、脾脏和法氏囊的发育，提高信鸽的免疫功能，同时能明显增强淋巴细胞的活性，明显增强机体的细胞免疫和体液免疫，从而大大降低疾病防治费用，提高信鸽和肉鸽饲养的综合效益。

3、提高饲料转化率

用EM原露制料长期饲喂，克激活与蛋白质和碳水化合物代谢有关的酶，从而提高它们的效率。使鸽饲料的消化率明显的提高，有助于消化过程。同时能提高鸽子对钙、磷等多种微量元素的吸收利用率。

4、有效减少发病率

用EM原露制作料饲喂信鸽，可以有效的阻止沙门氏菌、大肠杆菌、霉菌、球虫等致病微生物和寄生虫的生长和繁殖，促进有益菌的生长，长期维护肠道微生物菌群的平衡，有效减少发病机率。

5、促进生长，提高品质

通过饲喂EM原露制作料，可明显的促进鸽子的生长发育，提高平均重量，可大幅的提高信鸽的品质。

6、改善饲养环境

用EM原露制作料饲喂信鸽，还可以改善鸽舍环境的功能，使鸽舍内二氧化碳、氨气等有害气体显著减少生物论文，减少量为85%以上。鸽粪臭味明显下降。

综上所述，通过饲喂EM原露制作料，可以大幅提高鸽子成活率，降低信鸽养殖综合成本 20%左右。

三、EM原露在信鸽饲养中的具体应用

EM原露用于信鸽最简单的使用办法，就是按一定比例兑水后直接给鸽子饮用。具体作法是：用1份（毫升）EM原露，1份（克）红糖，加水至一定比例即可。其中红糖是作为一种营养物质，它能保持EM原露中菌群的活力，实际使用中也用过葡萄糖和蜂蜜代替。

1、用于鸽棚及环境消毒

用EM原露，红糖、加250~500倍水配成稀释液喷洒鸽舍及周围环境。开始每星期1次，逐渐减少到15天1次。实际运用中只要把鸽子每天喝剩下的EM稀释液用来消毒鸽舍即可。鸽子饮用EM原露和鸽舍喷洒EM原露一段时间后，鸽舍中的臭味会大大降低，连蚊蝇也会减少很多，这是由于EM原露中的微生物能把促成恶臭的物质：氨、硫化氢、甲基硫醇等当做食物吃掉（分解掉）这无疑给城市阳台的养鸽者带来福音。再不要因为鸽舍产生臭味及引来的蚊蝇与邻居们发生纠纷，城市文明养鸽将落在实处。

2、用于日常保养及防病

用EM原露，红糖，加水配成稀释液给鸽子全天饮用即可，EM原露的用量为每羽信鸽每天0.25~0.5毫升，加水量为100~200倍，以每天刚好饮完为宜论文的格式。原则是冬天增加浓度，夏季减少浓度。其特点是能明显改善整个鸽群体质，对养功差的鸽舍效果尤其明显，鸽群抗病能力增强基本上不民生恶性传染病，消化能力强，粪便形状好，家飞时间延长，飞径半径大，训放整体归巢率高，对照使用注射用氨基酸的鸽群，效果毫不逊色，且成本降低十几倍。

3、防治信鸽体内外寄生虫

其特点是内服不产生毒付作用，非常安全，同时又起到对鸽子身体的保健作用。因此，在比赛期间也能应急使用。外用洗澡也很有特点，有不少鸽友喜欢用高锰酸钾（PP粉）溶于水中给鸽子洗澡，虽然也能起到驱虫，消毒作用，但高锰酸钾是一种强氧化剂，在杀菌的同时也会加速信鸽羽毛的老化，使其失去光泽而干枯。而EM原露中微生物的特点是能产生抗氧化作用的物质，使用它给鸽子洗澡，既能驱虫消毒，又能对鸽子的羽毛起到非常好的护理作用。

EM原露可配制成防虫液，用来驱除鸽子体内外寄生虫。 鸽子体内驱虫时用EM防虫液加500倍水饮用1天生物论文，1星期后再饮用1天即可。驱除体外寄生虫可用EM防虫液加1000 倍水给鸽子洗澡，每星期1次，实际应用中用EM原露直接放在水中给鸽子洗澡，也有驱虫效果，并能使鸽子羽毛油滑光亮。

4、用于治疗鸽病

其特点是简便实用，无论是什么病，不需要做治疗前的医学检验，不用担心会用错药，EM原露对鸽子的消化系统疾病，呼吸系统疾病和一些疑难难症都能治疗，特别是对令鸽友最头痛的多病菌复合有一举多得的效果，同时EM原露治病没有其它化学药剂在治病的过程中产生的毒付作用，抗药性及二次感染等等一系列后顾之忧。而且用EM原露治好的鸽子身体素质恢复极快，这是由于在鸽病治好的同时，鸽子消化系统也已调整到位，这时给鸽子进行营养补充会得到良好的吸收，使鸽子体质迅速恢复。

⑴如果是全棚发生传染性疾病，（如沙门氏菌，新城疫球虫病等）可用EM原露，红糖，（这时不能使用蜂蜜）加水50倍配成稀释液全天饮用，观察鸽子精神状态及烘便，以此判断使用效果，一般3~7天即可完全控制病情，如用后2~3天内无明显效果，可以加大浓度。病情控制后，要继续按治疗浓度饲喂两天，以便巩固治疗效果，然后恢复日常保养浓度。

⑵对病情比较严重或个别发生病情的鸽子，可用EM原露红糖加水10倍配成稀释液，用注射器灌服，每次10毫升每日2~3次，对病情特别严重的鸽子我们的做法是直接灌服EM原露，每次3~5毫升。

⑶对念珠菌，毛滴虫，霉菌感染的信鸽，一般口腔中生有黄白色沉积物，这时要先将沉积物去掉，然后在口腔内滴几滴EM原露，并内服治疗浓度的EM原露，一般2~3天以够治好。

⑷EM原露还可用于防治信鸽饲料的黄曲霉菌中毒，治疗各种原因引起的外伤，眼部啄伤，伤口发炎等具有止血预防感染消炎生物论文，快速愈合创口的神奇效果。

5、用于信鸽赛前赛后的调整和老幼鸽的保健

由于EM原露中的微生物能分泌出有机酸、多糖类、多种维生素、抗生素、各种生化酶、氨基酸和氧等有益物质，既可调正各器官的功能延缓细胞衰老，激活T细胞，分解亚硝基化合物及其它有机化合物，又可增加营养，促进对其它营养物质的吸收，从而改善鸽子体内的微生态平衡，使鸽子保持健康的体质。因此EM原露可用于鸽子的育种，种鸽（特别指高龄鸽）配对前15天，每天灌服10毫升，幼鸽出营后7天至出棚，每天灌服3~5毫升，赛鸽参赛前7天开始每天服10毫升，信鸽比赛归巢后立即灌服20毫升，（此时配羊稀释液时可用蜂蜜代替红糖），之后连服3天，然后转为日常保健浓度饲喂。

注意：在上述调整中，如信鸽出现体重过重，可适当增加信鸽日常训练的运动量，减少饲料中油脂性饲料的比例，其它添加剂均可不用或少量使用，比赛期间可适当给赛鸽增加营养，可选择多种维生素和中草药制剂。

第5篇

关键词：  苍术挥发油 增殖作用 成骨样细胞UMR－106 MTT 法

   

苍术（Rhizoma atratylodes）为菊科植物南苍术Atractylodes lancea ( Thunb.) DC.或北苍术Atractylodes chinensis Koidz.等的干燥根茎。苍术性辛、苦、温，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目作用。主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿痹痛、风寒、感冒等［1］。

    

苍术在中医临床中使用十分广泛。已有研究发现苍术挥发油增加去卵巢雌性大鼠的骨钙含量（闫雪生《苍术油软胶囊的研制》。山东中医药大学硕士学位论文，2002），但对苍术挥发油是否影响成骨细胞的增殖，尚未见报道。本实验研究苍术挥发油对成骨细胞UMR-106的增殖作用。

1  材料与方法

1.1  材料

苍术药材购自上海德康药业有限公司,经中国第二军医大学药学院生药教研室黄宝康副教授鉴定为苍术Atractylodes lancea (Thunb.) DC.的干燥根茎。

1.2  试剂

DMEM 培养基(Cibco)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四唑氢溴酸盐MTT(Sigma)；胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料研究所)；胰蛋白酶(Cibco)；其它试剂均为国产分析纯。

1.3  方法

1.3.1  挥发油样品的制备水蒸气蒸馏法：将药材样品粉碎过40目筛，精确称取200 g的苍术，加水浸泡1 h，然后用挥发油提取器按常规水蒸气蒸馏，提取直至挥发油的量不再增加，蒸馏液用正己烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤，微热蒸去溶剂得挥发油样品，挥发油样品为淡黄色透明油状物，具有刺激性气味。取50 mg挥发油样品溶于1 ml二甲基亚砜中，用灭菌过的0.2 mm 滤器( Gelmann Sciences) 除菌,并于4℃保存，备用。临用时用DMEM培养液稀释至所需浓度。

1.3.2  成骨样细胞UMR－106的培养［3］UMR－106 (大鼠成骨肉瘤细胞系) 细胞株获赠于江苏镇江医学院病原生物教研室,源于美国麻省医学院。将UMR-106细胞培养于10％胎牛血清（100KU/L青霉素，100 mg/ml链霉素）的无菌DMEM培养基中，置37℃,5%CO2培养箱中进行培养。取生长状态良好的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，加含胎牛血清的培养基制成细胞悬浮液，调整细胞浓度为5×106个/ml接种于100 ml培养瓶中，二氧化碳培养箱中孵育，2～3 d换液1次。

1.3.3  MTT 法测定细胞的增殖［2］取对数生长期细胞消化计数后,用含血清的DMEM 细胞培养液将细胞浓度稀释至1×105个/ml ,铺入96孔细胞培养板中(100 μl/孔)培养24 h后加入含不同浓度挥发油(每个浓度6孔)的无血清DMEM培养。结束培养4 h前弃去培养液,每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml,用PBS配制)继续孵育4 h,有蓝紫色沉淀生成,每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO) ,振荡10 min待沉淀完全溶解,用酶标仪以550 nm 为测定波长、650 nm为参比波长测定吸光值,以不加中药的细胞孔测得的吸光值为空白,用t检验进行各加药组与空白组之间均值的比较。细胞增殖率的计算如下：

    

增殖率（%）= Ai实验组- Ao对照组Ao对照组×100%

    

Ai：不同条件下的吸光值；Ao：空白组的吸光值

2  结果

2.1  MTT 法测定细胞增殖与吸光度的关系将UMR-106细胞分别以6个不同浓度(1×105～1.2×106个)铺入96 孔板,培养8 h贴壁后,用上述方法测定每孔吸光度(Y),与细胞数目(X)作线性回归,得标准曲线方程：Y=0.054+0.092 6×10-6X(r=0.986 0,n=6),两者具有良好的线性关系。见图1。

2.2  挥发油对细胞增殖的作用用1，0.1，0.01，0.001 mg/ml 4种浓度的挥发油作用于细胞24 h，在λ＝550 nm测定其吸光值。结果见表1 。表1  不同挥发油浓度对UMR-106的增殖作用(略)

苍术挥发油浓度0.001 mg/ml时培养24 h，可明显促进细胞的增殖,细胞的增殖率为10.44%。在低的浓度下对细胞增殖有轻微的抑制作用,表明挥发油短期内使用低浓度较好。

    

为了观察挥发油促细胞增殖的最适宜的作用时间,用浓度为0.001 mg/ml的苍术挥发油作用于细胞分别为24，48，72 h , 在λ＝550 nm测定其吸光值。结果见表2。表2  不同作用时间对细胞增殖的影响(略)

由表2可见，当挥发油在浓度为0.001 mg/ml作用24 h时能明显刺激UMR-106增殖，在近48 h时增殖率为20.96％， 达到最强,72 h 时细胞数目又下降。

3  讨论

    

苍术挥发油在0.001 mg/ml浓度下作用24，48 h，均对UMR-106增殖有明显的促进作用。UMR-106大鼠成骨肉瘤细胞系从形态和性质上都保留了成骨细胞独有的特征, 并且具有稳定、均一、纯度高等优点。 因此,UMR-106 细胞作为一种国际公认的成骨细胞系可以用来代替成骨细胞［3］。在骨形成最初阶段的成骨细胞增殖期, 成骨细胞数量增多, 形成多层细胞并合成、分泌I型胶原以便最终矿化形成骨结节。成骨样细胞的增殖与细胞培养液中药物的成分有关, 与成骨样细胞UMR-106共同体外培养的方法可能作为对骨形成有促进作用的活性化合物的筛选模型, 经过进一步的动物体内实验从这些活性药物中追踪对骨形成有促进作用的活性成分。因此，以成骨样细胞UMR-106 的增殖为活性指标,观察了苍术挥发油对该细胞系增殖的作用。由于采用的是苍术挥发油和细胞共同体外培养的方法,推测苍术挥发油中含有直接刺激成骨样细胞增殖的成分,为苍术治疗骨质疏松症提供初步筛选，具体机制有待进一步研究。

【参考文献】

第6篇

1.1 人肺癌细胞系

人非小细胞肺癌NC-H446细胞株由中国医科大学细胞室提供，我院实验中心细胞室保存。

1.3 主要仪器

美国SHELLAB2300型CO2细胞培养箱；日本Nikon倒置相差显微镜；美国Sfat自动酶标分析仪；美国FACScan流式细胞仪等。

1.4 实验方法

1.4.1 肺康饮含药血清的制备

1.4.3 细胞培养

1.4.4 肺康饮含药血清对NC-H446细胞增殖的影响

抑制率（%）=（1- OD实验组/ OD对照组）×100%

1.4.5 肺康饮含药血清诱导肺癌细胞凋亡表达的测定

1.5 统计学方法

采用多因素方差分析法检测组间差异的显著性。所有统计学检验均应用SPSS11.5统计软件进行。

2 结果

2.1 肺康饮含药血清对NC-H446细胞增殖的影响

2.2 肺康饮含药血清对NC-H446细胞凋亡的影响

3 讨论

细胞凋亡是指在正常生理情况下，为了整个生物体的更大利益，受伤或衰老的细胞通过1种程序性细胞死亡方式牺牲自己的过程。凋亡作为细胞死亡的1种重要形式，对维持机体正常发展和保证体内平衡有着重要调节作用。细胞凋亡紊乱、细胞周期异常导致肿瘤无限制增殖是肿瘤发生的重要原因之1［3］。

第7篇

1PCNA的特点

PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白。在细胞核内存在可溶性与不溶性两种PCNA，可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达，其量在DNA合成过程中不发生明显变化，易被去污剂提取、甲醇破坏；不溶性PCNA较稳定，不易被去污剂洗脱、甲醇破坏，这种PCNA在G0～G1期细胞中无明显表达，G1晚期，其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标[1,2,4]。

2肿瘤中PCNA的研究

肿瘤细胞具有旺盛的增殖活性，而PCNA可作为评价细胞增殖状态的指标。因此，国内外在许多肿瘤中进行了PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展[5,6]、分级[1,7～10]、分期[1,10]、放疗敏感性[11,12]、预后[1,7,8,10,13～20]、复发和转移[1,21]、死亡原因[20]、肿瘤标志物[18,22]等各个方面的相关性，得出了许多结论，但在某些方面因作者和所研究肿瘤的不同，还存在一些争议，即使尚没有争议的结论，也是从一种或几种肿瘤中得出的，这些结论是否适用于所有肿瘤，仍有待进一步研究。

3肺癌中PCNA的研究

PCNA在肺癌中的研究也较多，许多作者致力于这方面的探讨，期望找到有意义、有价值的结果，但到现在为止，PCNA在肺癌中研究所得出的一些结果也同样存在争论[23]。

3.1PCNA与肺癌发生发展的关系

夏书月等[6]在研究肺鳞癌的发生、发展过程中，发现PCNA的表达有逐渐增高，阳性细胞数逐渐增多的趋势。在轻、中、重度不典型增生、原位癌及浸润癌中，PCNA标记指数分别为12.5±8.7、43.3±14.9、68.1±9.1、74.6±8.2、65.4±23.6，与正常和轻、中度不典型增生的上皮相比，浸润癌、原位癌和重度不典型增生的上皮细胞PCNA标记指数明显升高，PCNA阳性细胞数也明显增多。认为PCNA表达为细胞异常增殖的标志，可作为肺鳞癌早期诊断的参考指标。但这仅是在肺鳞癌中的初步探索，且病例数较少，能否作为肺鳞癌早期诊断参考指标，还需进一步验证。

3.2PCNA与肺癌分型的关系

有作者[15,24]认为PCNA在不同类型肺癌中表达不同，鳞癌PCNA标记指数平均约为52％，腺癌为49％，大细胞肺癌为76％，小细胞肺癌为63％。何杰等[25]的结果为：肺鳞癌标记指数为0.51±0.23，腺癌为0.69±0.34。在同一类型不同亚型之间也表达不同。王恩华等[13]在86例肺腺癌中对各亚型进行分析：PCNA在细支气管肺泡癌中表达约为0.22±0.17，腺泡状腺癌中约为0.36±0.12，大细胞癌中约为0.67±0.10。但也有作者认为PCNA的表达仅能反映细胞的增殖状态，与组织学类型无关。Castellano[26]、Fontanini[14]、Fujii[27]等支持这种观点。

3.3PCNA与肺癌分化程度的关系

有研究表明：PCNA表达随肺癌分化程度的增高而减少。王恩华[13]在肺腺癌的研究中发现：高分化组最低，PCNA标记指数约为0.19±0.10，中分化组稍高，约为0.35±0.10，低分化组最高，约为0.55±0.17；何杰等[25]分别分析了肺鳞癌、肺腺癌中PCNA的表达，发现PCNA标记指数与肿瘤分级呈正相关，Zhao等[28]在73例肺癌中得出了同样结论。可见肺癌中PCNA的表达可反映肺癌细胞分化的好坏，预示肿瘤恶性度的高低。这与在许多种其他肿瘤中的研究发现基本一致。

3.4PCNA与肺癌分期的关系

大多数研究表明：PCNA表达与肺癌分期相关，分期愈晚，PCNA表达愈高。Ishida等[29]在211例非小细胞肺癌中统计出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb期各期PCNA表达平均值分别为30％、24％、40％、50％，有逐渐增高的趋势，但Ⅰ、Ⅱ期差别不大。王恩华等[13]的研究也认为，肺癌中PCNA的表达与N分期及M分期相关，随着分期的增加，PCNA表达增加。但也有作者持相反意见，Fontanini等[14]在周围型非小细胞肺癌的研究中发现，PCNA的表达与分期无关，他们的结果为：T1期PCNA表达值平均约为18％，T2期约为10％。是否是由于在早期（Ⅰ、Ⅱ）肺癌中PCNA表达受宿主免疫系统抑制，变化不明显，而晚期肺癌因免疫抑制减弱，表达明显增加，还有待继续探讨。

3.5PCNA与肺癌血管受侵的关系

Fontanini等[14]在40例周围型，淋巴结阴性的非小细胞肺癌(NSCLC)中发现：PCNA的表达与血管受侵明显相关，有血管受侵组的PCNA表达明显高于无血管受侵组，平均值分别为40％和10％。Fujii等[27]也发现PCNA表达与肺癌血管受侵明显相关。这可能与PCNA高表达者分化差，恶性度高，容易侵蚀血管有关。

3.6PCNA与肺癌预后的关系

部分作者认为：PCNA表达愈低，其生存时间愈长，预后愈好。王恩华等[13]分析了86例手术切除的肺腺癌病例，发现术后存活3年以内组与5年以上组之间，PCNA表达值有显著差异，其标记指数分别为0.42±0.20和0.22±0.15;Ishida等[29]在Ⅰ期NSCLC中也发现，5年生存组中，PCNA(＋)组生存率明显低于PCNA(－)组；Fujii等[26]的研究结果也支持这种观点。但有相当多的作者认为单凭PCNA不能评价NSCLC的预后，Matturri[30]、Monraval[31]、Castellano[26]、Ebina[32]等各自分别研究了PCNA的表达与术后NSCLC生存时间的关系，没找到明确的相关性。考虑这是由于肺癌的预后是由多种因素：如病理类型、病理分期、分化、治疗情况、合并症、年龄、身体状况、PCNA的表达等综合决定的，单凭PCNA这一种因素，难以预测肺癌的预后。

3.7PCNA与肺癌复发的关系

Ogawa等[33]在35例术后复发的Ⅰ期NSCLC中发现，PCNA(＋)组复发时间明显短于PCNA(－)组，中位无瘤生存时间分别为2.5年和4年，认为PCNA可预测Ⅰ期NSCLC术后复发时间的长短。但所研究病例太少，范围狭窄，结果有待进一步证实。

3.8PCNA与肺癌其它标志物的相关性

Fontanini等[14]在周围型肺癌中发现PCNA表达在DNA异倍体中明显高于DNA整倍体，并与异倍体DNAS期分数明显相关，PCNA表达高的分裂指数高于PCNA表达低的。还有研究[13,15,24,28,29,34]表明肺癌中PCNA的表达与细胞构成、DNA指数、AgNORs计数、Ki67等相关。这些多为首次报道，不知结果能否重复，若结论能确证，则无论在临床上，还是基础研究中，PCNA的应用和研究将会更为广泛。

从上可见，肺癌中PCNA的研究已深入到了肺癌的各个方面，但在许多方面所得结果还不统一，造成这种结果不一致的原因很多，初步分析包括以下诸多因素：1)肿瘤本身的因素：肿瘤与肿瘤之间及同一肿瘤不同部位之间，细胞增殖都存在很大的差异[26,36,37]，致使PCNA表达不均。2)取材的影响：由于肿瘤内部不同部位之间PCNA表达不均，取材时可能取到高表达区，也可能取到中表达区或低表达区，以致计数结果不能代表整个肿瘤情况。3)制片过程中的影响因素：组织固定时福尔马林的浓度，固定时间的长短，烤片时温度高低及烤片时间等对PCNA的抗原性都有影响。固定液浓度过高，固定时间过长，烤片温度过高，烤片时间过长均会降低PCNA的抗原性乃致使抗原性消失[1,2]。4)免疫组化染色过程中的影响因素：免疫组化染色过程中所用抗体不同，所得PCNA结果不同；微波炉加热能恢复PCNA的抗原性，增强切片的免疫组化染色效果[37]，使用微波炉处理切片，能增加检测的数值；另外抗体的滴度，内源性过氧化物酶封闭情况，DAB显色时间长短，苏木素衬染的背景深浅等均会影响染片的效果，产生假阴性或假阳性，使检测结果发生变化。5)结果判断的影响：由于每个人所定的阴阳性染色标准不同，选取视野不同，计数细胞总数不同，也造成了一定的人为偏差。

由于实验中存在以上诸多影响因素，不同作者在肺癌中所研究出的结果或在不同肿瘤中所研究出的结果，都难以对照相比，因此PCNA的免疫组化研究有必要采用统一的标准，减少实验误差和人为偏差，使彼此的结果具有可比性。

总之，无论在整个肿瘤方面，还是单在肺癌这一方面，PCNA的研究都是较多的，得出了许多有临床应用价值的结果，但由于肿瘤本身的变异性及人们研究方法的差异，致使所得结果存在一些争议，这有待进一步验证，以便能达到一致的结论，应用于临床，指导临床实践。

作者单位：刘跃平综述汪楣沈瑜殷蔚伯中国医学科学院肿瘤医院放疗科北京市100021

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28ZhaoT,ZhangYL,LiCD.Acomparisonofproliferatingcellnuclearantigenimmunostaining,nucleolarorganizerregionstaininginlungcancer.ChungHuachiehHoHoHuHsiTsaChih,1993;16(6):342～4

29IshidaT,KanekoS,AkazawaKetal.Proliferatingcellnuclearantigenexpressionandargyrophilicnucleolarorganizerregionsasfactorsinfluencingprognosisofsurgicallytreatedlungcancerpatients.Cancerres,1993;53(20):5000～3

30MatturriL,LavezziAM,GrignaniF,etal.Theprognosticvalueofcellproliferationinnon－smallcelllungcancerassessedwithtritiatedthymidineandanti－PCNAantibodies.EurJCancer,1994;30A(9):1397～8

31AlemanyMonravalP,CebolladaM,VillalbaS,etal.Studyoftheexpressionofproliferatingcellnuclearantigenandp185innon－smallcelllungcarcinoma.archBronconeumol,1996;32(4):165～9

33EbinaM,SteinbergSM,MulshineJL,etal.Relationshipofp53overexpressionandup－regulationofproliferatingcellnuclearantigenwiththeclinicalcourseofnon－smallcelllungcancer.CancerRes,1994;54(9):2496～503

34OgawaJ,TsurumiT,YamadaS,etal.BloodvesselinvasionandexpressionofsialylLewisxandproliferatingcellnuclearantigeninstageInon－smallcelllungcancer.Relationtopostoperativerecurrence.Cancer,1994;73(4):1177～83

35FontaniniG,PingitoreR,BiginiD,etal.Growthfractioninnon－smallcelllungcancerestimatedbyproliferatingcellnuclearantigenandcomparisonwithKi－67labelingandDNAflowcytometrydata.AmJPathol,1992;141(6):1285～90

36CareyFA,FabbroniG,LambD.Expressionofproliferatingcellnuclearantigeninlungcancer:asystematicstudyandcorrelationwithDNAploidy.histopathology,1992;20(6):499～503

第8篇

格列美脲是在临床广泛应用的第3代磺脲类降糖药，它不仅能作用于胰岛β细胞，也能作用于机体的其他细胞[8-10]，产生一系列的类胰岛素信号样作用[9-10]，并且能够上调大鼠脂肪细胞和骨骼肌细胞GLUT-1、4的表达[8-10]。但其对成骨细胞的作用及成骨细胞葡萄糖摄取的影响还不清楚。本研究采用原代培养的大鼠下颌骨成骨细胞，观察格列美脲对高糖环境下大鼠下颌骨成骨细胞葡萄糖摄取及GLUT-1、3表达的影响，为糖尿病种植牙患者降糖药物的选择提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

4～8周龄SD大鼠（军事医学科学院动物中心提供），L-DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国），胰蛋白酶（Amresco 公司，美国），格列美脲标准品、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl te-trazolium，MTT）（Sigma公司，美国），兔抗大鼠GLUT-1抗体（sc7903）（Santa Cruz公司，美国），兔抗大鼠GLUT-3抗体（ab41525）（Abcam公司，美国），氟-18标记的脱氧葡萄糖（18F-deoxyglucose，18F-FDG）（中国总医院PET中心）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠下颌骨成骨细胞的分离培养及鉴定 取4～6周龄的成年SD大鼠，颈拉断处死后，在75%乙醇中浸泡5 min，无菌取出带有肌肉和筋膜的下颌骨，置于75%乙醇中洗5～10 s后，在5.25%NaClO中浸泡1 min，用PBS冲洗3次，完全剥离肌肉和筋膜，拔除牙齿，将下颌骨用咬骨钳剪碎成2 mm×2 mm的骨片后，PBS缓冲液反复冲洗至骨碎块呈白色，将其置入小培养瓶中，再加0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型胶原酶的混合液[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]（1∶1），在水浴振荡器中37 ℃、140 r·min-1消化8 min。消化6次后终止，收集第2～5次消化液，经200目不锈钢筛网过滤并离心，去除上清后用含20%胎牛血清的L-DMEM重悬细胞，接种于培养瓶中在37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下于恒温孵箱中静置培养40 min，差速贴壁，纯化成骨细胞。经酶消化后的组织块，再次剪碎至1 mm×1 mm，铺于培养瓶中倒置培养，4 h后翻瓶，待细胞长满传代。取状态良好的第3代细胞用于实验。采用ALP染色、细胞矿化结节染色、细胞Ⅰ型胶原（collagenⅠ，Col Ⅰ）免疫组化染色和骨钙素（osteocalcin，OCN）免疫荧光染色法对细胞进行成骨细胞鉴定。

1.2.2 实验分组 将成骨细胞以每毫升1×105个接种于35 mm平皿中（n=6），每孔加液量为2 mL，细胞生长至融合后，无血清培养基孵育24 h，分别予以5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖处理细胞，持续24 h，加入10 ?mol·L-1 格列美脲干预120 min，然后进行葡萄糖摄取实验。实验分组：5.5 mmol·L-1组（生理浓度葡萄糖，对照组）、5.5 mmol·L-1+格列美脲组、16.5 mmol·L-1组（高浓度葡萄糖）、16.5 mmol·L-1+格列美脲组。

1.2.3 葡萄糖摄取的测定 培养结束后，弃去培养基，用温PBS清洗3遍，每孔加入1 mL含7.5 μCi·mL-1 18F-FDG的PBS，37 ℃孵育30 min，用预冷的PBS冲洗6遍，加入1 mL PBS刮取细胞，收集细胞悬液，用共形γ计数器测定总放射性计数。用总放射性计数与蛋白质浓度的比值，反应细胞葡萄糖摄取能力。

1.2.4 GLUT-1和GLUT-3免疫细胞化学染色 将第4代成骨细胞接种在盖玻片上，培养7 d后用95%乙醇固定，PBS洗涤，加兔抗大鼠GLUT-1、3（1︰100），保湿，4 ℃过夜；PBS洗涤，加生物素化羊抗兔二抗，PBS洗涤；DAB显色，苏木素复染，封片。

1.2.5 Western blot检测GLUT-1、3的表达 将成骨细胞以每毫升1×105个接种于25 cm2培养瓶中，细胞生长至融合后，无血清培养基孵育24 h，分别予以5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖处理细胞，持续24 h，然后加入10 ?mol·L-1格列美脲干预120 min，实验分组同葡萄糖摄取测定实验，Western blot实验用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sul-fate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶，300 mA恒流电转移80 min，加兔抗大鼠GLUT-1（1︰2 000稀释）、GLUT-3 抗体（1︰1 000稀释）37 ℃孵育4 h，洗膜后，经辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1︰4 000稀释）孵育50 min，化学发光法显示抗原抗体复合物，X线片显影并定影，采用Labworks4.5成像分析仪系统测定所有杂交信号条带密度，用蛋白目的条带水平与β-actin的比值表示。以上实验至少重复3次。

1.3 统计[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，对各组结果进行方差分析和t检验，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 原代细胞及传代细胞的形态学观察

在倒置显微镜下，组织块上酶消化下的细胞经差速贴壁后，24 h培养可贴壁，细胞呈三角形、纺锤形和多角形等多种形态（图1A）。连续组织块法分离成骨细胞培养第5天可见成骨细胞自骨碎片移出，向周围呈无序生长（图1B），传代细胞在4 h内贴壁，展开的细胞呈长梭形、鳞片形、多边形，细胞核呈圆形或椭圆形，轮廓清晰，可见1～3个核仁。细胞长满瓶底时，多呈梭形或立方形，排列紧密，生长突相互连接（图1C）。随着培养时间的延长，成骨细胞可呈重叠生长。

2.2 成骨细胞的鉴定

光镜下，ALP 染色可见细胞质内有红棕色颗粒或块状颗粒（图2A）；ColⅠ表达均呈阳性，蛋白染色主要位于细胞质，表达量丰富（图2B）；长期培养，细胞复层生长逐渐形成小结，随着胶原 堆积和钙盐沉积，最后形成不透光的矿化结节，经茜素红染色呈红色块状沉淀（图2C）；OCN免疫荧光染色结果显示，细胞呈阳性反应，细胞质OCN染成绿色（图2D）。

2.3 格列美脲对成骨细胞葡萄糖摄取的影响

在5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖作用下，成骨细胞的葡萄糖摄取量分别为1.00±0.06、0.88±0.04。与

5.5 mmol·L-1葡萄糖相比，16.5 mmol·L-1葡萄糖浓度下成骨细胞的糖摄取能力降低了11.67%（P<0.05）。加入格列美脲后，在5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖作用下，成骨细胞的葡萄糖摄取量分别为1.35±0.05、1.10±0.06。格列美脲能够明显提高5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖浓度下成骨细胞的糖摄取能力，分别提高了34.68%和25.17%（P<0.05）。

2.4 GLUT-1和GLUT-3的免疫化学染色

免疫化学染色结果显示GLUT-1、3在不同浓度葡萄糖培养下的成骨细胞中表达均呈阳性，蛋白主要位于细胞质，表达量丰富（图3、4）。

2.5 格列美脲对成骨细胞GLUT-1和GLUT-3的影响

与5.5 mmol·L-1葡萄糖相比，16.5 mmol·L-1葡萄糖增加了成骨细胞GLUT-1蛋白的表达（P<0.05）。格列美脲能明显提高5.5和16.5 mmol·L-1葡萄糖浓度下GLUT-1蛋白的表达（P<0.05）（图5）。

3 讨论

在要求种植牙的患者中，糖尿病患者占有一定的比例。随着糖尿病的发病率逐渐增加，这部分患者的比例也在增加。在糖尿病患者中，异常的高糖状态可以引起骨量减少或者骨质疏松，是种植牙失败的一个重要原因[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net][11]。在这一病理过程中，成骨细胞扮演重要的角色。高糖环境除了影响细胞的增殖分化，也影响葡萄糖摄取过程。对于胰岛细胞[1]、血管平滑肌细胞[2]、绒毛膜细胞[3]、肾小管细胞[4]，高糖环境均可降低了细胞的糖摄取能力。笔者观察了120 min时成骨细胞糖摄取的变化，发现高糖环境下成骨细胞的糖摄取要显著低于低糖环境。

葡萄糖是维持细胞能量代谢和生命活动的重要原料，葡萄糖是一种极性分子，不能以自由扩散的方式通过细胞膜脂双层结构的疏水区，除了小肠和肾小管可以通过主动运输方式吸收葡萄糖外，其他组织的细胞都必须通过细胞膜上的GLUT来摄入葡萄糖。GLUT是一类镶嵌在细胞膜上转运的载体蛋白质，它广泛分布于体内各组织。根据转运葡萄糖的方式分为两类，一类是钠依赖的葡萄糖转运蛋白（sodium rely on glucose transporters，SGLT），以主动方式逆浓度梯度转运葡萄糖；另一类为易化扩散的GLUT，以易化扩散的方式顺浓度梯度转运葡萄糖，其转运过程不消耗能量。易化扩散的GLUT是由至少13种膜蛋白组成的一个蛋白质家族。研究发现，成骨细胞样UMR-106细胞系[12]和关节软骨细胞[13]中表达GLUT-1、3，本研究证实大鼠成骨细胞也表达GLUT-1、3。

GLUT-1是已知分布最广的转运体，其高效表达于人类红细胞、脑、眼、周围神经及胎盘等组织中，维持基础状态下组织的葡萄糖摄入。GLUT-3和GLUT-1一样在很多细胞中都有表达，但以脑组织中分布最多。GLUT-3也是具有高亲和力的高效转运蛋白，Km值极低，对于不能储存糖原却又对葡萄糖有很高需要量的组织来说，GLUT-3便成为理想的葡萄糖运载体[14]。

研究[15-16]发现高糖环境可以影响GLUT-1的表达，但结论不统一。据报道高糖可以促进肾小球系膜细胞和视网膜内皮细胞GLUT-1的表达，却降低绒毛膜细胞和肾小管细胞GLUT-l的表达[3-4]。研究[17]发现，高糖环境提高了成骨细胞GLUT-1蛋白的表达。笔者的研究结果也证实高糖环境上调成骨细胞GLUT-1蛋白的表达。有研究[18]表明细胞外糖浓度升高导致渗透压的改变，引起系膜细胞的GLUT-1表达的升高。因此，葡萄糖浓度的改变，导致渗透压改变是成骨细胞GLUT-1表达升高的重要原因。笔者也发现在高糖环境中，成骨细胞GLUT-3的表达是轻微下调的，这与其他研究[18]结果一致，即高糖环境导致视网膜内皮细胞GLUT-3的下降。GLUT-3是高效转运蛋白，它的转运效率是GLUT-1的3倍，本实验中总的糖摄取是下降的，原因可能是高糖环境下GLUT-3的轻微下调，就能影响成骨细胞糖摄取的改变。

胰岛素能促进UMR-106细胞和关节软骨细胞GLUT-1、3的表达，也能促进成骨样细胞的糖摄取增加[12-13]。而格列美脲不仅能作用于胰岛β细胞，也能作用于机体的其他细胞[8-10]，产生一系列的类胰岛素信号样作用[9-10]。它能够上调大鼠的脂肪细胞和骨骼肌细胞GLUT-1、4的表达[9-10]。本研究结果证实格列美脲在2种糖浓度下提高了成骨细胞糖摄取，并且上调了GLUT-1、3的蛋白表达。结果提示格列美脲在成骨细胞也可[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]能发挥类胰岛素样所用。格列美脲对成骨细胞GLUT-1、3蛋白的促进作用受到了16.5 mmol·L-1葡萄糖浓度的抑制，这说明高糖环境降低了格列美脲促进成骨细胞GLUT-1、3蛋白表达的敏感性。笔者前期研究已经证实格列美脲能够促进大鼠下颌骨成骨细胞的增殖分化和矿化[19]，葡萄糖作为维持细胞能量代谢和生命活动的重要原料，推测格列美脲对糖摄取的影响可能发挥了相关的作用，其相关性还待进一步研究。

[参考文献]

[1] Unger RH. Diabetic hyperglycemia： link to impaired glu-cose transport in pancreatic beta cells[J]. Science， 1991， 251

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[3] Hahn T， Barth S， Weiss U， et al. Sustained hyperglycemia in vitro down-regulates the GLUT1 glucose transport system of cultured human term placental trophoblast： a mechanism to protect fetal development[J]. FASEB J， 1998， 12（12）：

1221-1231.

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[6] Qutob S， Dixon SJ， Wilson JX. Insulin stimulates vitamin C recycling and ascorbate accumulation in osteoblastic cells

第9篇

【摘要】

目的研究苍术挥发油对成骨样细胞UMR-106的增殖作用。方法苍术挥发油和UMR106 成骨样细胞体外共同培养，用MTT 法检测细胞增殖。结果挥发油在0.001 mg/ml 培养48h具有最强的促进细胞增殖作用。结论苍术挥发油中可能含有促进成骨细胞增殖的活性成分。

【关键词】 苍术挥发油 增殖作用 成骨样细胞UMR－106 MTT 法

Abstract：ObjectiveTo research the proliferative effects of essential oil in Atractylodes lancea on osteoblast - UMR-106 cells .MethodsOsteoblasts－UMR-106 cells were cultured with essential oil of Atractylodes in vitro，and MTT method was used to detect the cell proliferation. ResultsEssential oil of Atractylodes lancea at a concentration of 0.001 mg/ml， within 48 h ，strongly stimulated the proliferation of UMR-106 cells.ConclusionEssential oil of Atractylodes lancea probably has some chemical compositions which can stimulate the proliferation of UMR-106 cells.

Key words：Essential oil in Atractylodes lancea; Proliferation effect; UMR-106 cell; MTT method

苍术（Rhizoma atratylodes）为菊科植物南苍术Atractylodes lancea ( Thunb.) DC.或北苍术Atractylodes chinensis Koidz.等的干燥根茎。苍术性辛、苦、温，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目作用。主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿痹痛、风寒、感冒等［1］。

苍术在中医临床中使用十分广泛。已有研究发现苍术挥发油增加去卵巢雌性大鼠的骨钙含量（闫雪生《苍术油软胶囊的研制》。山东中医药大学硕士学位论文，2002），但对苍术挥发油是否影响成骨细胞的增殖，尚未见报道。本实验研究苍术挥发油对成骨细胞UMR-106的增殖作用。

1 材料与方法

1.1 材料

苍术药材购自上海德康药业有限公司，经中国第二军医大学药学院生药教研室黄宝康副教授鉴定为苍术Atractylodes lancea (Thunb.) DC.的干燥根茎。

1.2 试剂

DMEM 培养基(Cibco)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四唑氢溴酸盐MTT(Sigma)；胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料研究所)；胰蛋白酶(Cibco)；其它试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 挥发油样品的制备水蒸气蒸馏法：将药材样品粉碎过40目筛，精确称取200 g的苍术，加水浸泡1 h，然后用挥发油提取器按常规水蒸气蒸馏，提取直至挥发油的量不再增加，蒸馏液用正己烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤，微热蒸去溶剂得挥发油样品，挥发油样品为淡黄色透明油状物，具有刺激性气味。取50 mg挥发油样品溶于1 ml二甲基亚砜中，用灭菌过的0.2 mm 滤器( Gelmann Sciences) 除菌，并于4℃保存，备用。临用时用DMEM培养液稀释至所需浓度。

1.3.2 成骨样细胞UMR－106的培养［3］UMR－106 (大鼠成骨肉瘤细胞系) 细胞株获赠于江苏镇江医学院病原生物教研室，源于美国麻省医学院。将UMR-106细胞培养于10％胎牛血清（100KU/L青霉素，100 mg/ml链霉素）的无菌DMEM培养基中，置37℃，5%CO2培养箱中进行培养。取生长状态良好的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，加含胎牛血清的培养基制成细胞悬浮液，调整细胞浓度为5×106个/ml接种于100 ml培养瓶中，二氧化碳培养箱中孵育，2～3 d换液1次。

1.3.3 MTT 法测定细胞的增殖［2］取对数生长期细胞消化计数后，用含血清的DMEM 细胞培养液将细胞浓度稀释至1×105个/ml ，铺入96孔细胞培养板中(100 μl/孔)培养24 h后加入含不同浓度挥发油(每个浓度6孔)的无血清DMEM培养。结束培养4 h前弃去培养液，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml，用PBS配制)继续孵育4 h，有蓝紫色沉淀生成，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO) ，振荡10 min待沉淀完全溶解，用酶标仪以550 nm 为测定波长、650 nm为参比波长测定吸光值，以不加中药的细胞孔测得的吸光值为空白，用t检验进行各加药组与空白组之间均值的比较。细胞增殖率的计算如下：

增殖率（%）= Ai实验组- Ao对照组Ao对照组×100%

Ai：不同条件下的吸光值；Ao：空白组的吸光值

2 结果

2.1 MTT 法测定细胞增殖与吸光度的关系将UMR-106细胞分别以6个不同浓度(1×105～1.2×106个)铺入96 孔板，培养8 h贴壁后，用上述方法测定每孔吸光度(Y)，与细胞数目(X)作线性回归，得标准曲线方程：Y=0.054+0.092 6×10-6X(r=0.986 0，n=6)，两者具有良好的线性关系。见图1。

2.2 挥发油对细胞增殖的作用用1，0.1，0.01，0.001 mg/ml 4种浓度的挥发油作用于细胞24 h，在λ＝550 nm测定其吸光值。结果见表1 。表1 不同挥发油浓度对UMR-106的增殖作用(略)

苍术挥发油浓度0.001 mg/ml时培养24 h，可明显促进细胞的增殖，细胞的增殖率为10.44%。在低的浓度下对细胞增殖有轻微的抑制作用，表明挥发油短期内使用低浓度较好。

为了观察挥发油促细胞增殖的最适宜的作用时间，用浓度为0.001 mg/ml的苍术挥发油作用于细胞分别为24，48，72 h ， 在λ＝550 nm测定其吸光值。结果见表2。表2 不同作用时间对细胞增殖的影响(略)

由表2可见，当挥发油在浓度为0.001 mg/ml作用24 h时能明显刺激UMR-106增殖，在近48 h时增殖率为20.96％， 达到最强，72 h 时细胞数目又下降。

3 讨论

苍术挥发油在0.001 mg/ml浓度下作用24，48 h，均对UMR-106增殖有明显的促进作用。UMR-106大鼠成骨肉瘤细胞系从形态和性质上都保留了成骨细胞独有的特征， 并且具有稳定、均一、纯度高等优点。 因此，UMR-106 细胞作为一种国际公认的成骨细胞系可以用来代替成骨细胞［3］。在骨形成最初阶段的成骨细胞增殖期， 成骨细胞数量增多， 形成多层细胞并合成、分泌I型胶原以便最终矿化形成骨结节。成骨样细胞的增殖与细胞培养液中药物的成分有关， 与成骨样细胞UMR-106共同体外培养的方法可能作为对骨形成有促进作用的活性化合物的筛选模型， 经过进一步的动物体内实验从这些活性药物中追踪对骨形成有促进作用的活性成分。因此，以成骨样细胞UMR-106 的增殖为活性指标，观察了苍术挥发油对该细胞系增殖的作用。由于采用的是苍术挥发油和细胞共同体外培养的方法，推测苍术挥发油中含有直接刺激成骨样细胞增殖的成分，为苍术治疗骨质疏松症提供初步筛选，具体机制有待进一步研究。

【参考文献】

［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：111.

第10篇

据该论文的作者之一、中科院生物物理研究所研究员李国红介绍，遗传信息DNA是经过凝缩之后聚集在只有几个微米的细胞核里的，其核小体以密集堆积的方式形成了一种直径在30纳米左右的管状螺旋体，即30纳米染色质纤维。目前国际上对30纳米染色质纤维这一超大分子复合体的组装和调控机理还不清楚，对于其精细结构组成也有很大争议，“30多年来，对其结构的研究一直是现代分子生物学领域面临的最大挑战之一”。

李国红与生物物理所研究员朱平经过四五年的密切合作与不懈努力，成功建立了一套染色质体外重建和结构分析平台，利用一种冷冻电镜单颗粒三维重构技术，在国际上率先解析了30纳米染色质的高清晰三维结构，在破解“生命信息”的载体――30纳米染色质的高级结构研究中取得了重大突破。朱平说，这一结构提示了30纳米染色质纤维以4个核小体为结构单元，各单元之间通过相互扭曲折叠形成了一个左手方向的双螺旋高级结构，它还明确了组蛋白H1在30纳米染色质纤维形成过程中的重要作用。

据了解，本研究论文的评审人曾评论说：“30纳米染色质结构是最基本的分子生物学问题之一，困扰了研究人员30余年”，该结果是“目前为止最有挑战性的结构之一”，“在理解染色质如何装配这个问题上迈出了重要的一步”。

第11篇

鼠抗粒细胞集落刺激因子单克隆抗体的研制王翎李修兰(5)

抗重组人肿瘤坏死因子—α单克隆抗体的研制及其初步应用刘雪松金伯泉(8)

分泌抗rHuIL—6McAb杂交瘤细胞系的建立及其应用研究杨琨任启生(12)

载脂蛋白B单克隆抗体透射免疫比浊测定法的探讨赵满仓段雪梅(17)

抗淋球菌PIA单克隆抗体的制备和应用分析陈伟余模松(21)

鼠抗丙型肝炎病毒ns—5区单克隆抗体的研究刘莹李秀华(24)

用碱性磷酸酶免疫斑点试验检测小鼠血清中的HFRS病毒抗体许辉金伯泉(27)

检测HFRS患者血清IgM抗体的快速ELISA捕捉法的建立及其与常规法…王海涛徐志凯(32)

抗人小细胞型肺癌和抗CD3单克隆抗体的异质交联体的制备及其…韩立军王德斌(35)

抗人胎盘酸性铁蛋白McAb的制备及其鉴定朱慧芬游上游(39)

抗HFRSV鼠／人嵌合抗体基因的构建祝道成李以莞(42)

单克隆抗体组建黄曲霉毒素酶免疫检测试剂盒的研究季永镛陆建华(46)

抗TG单克隆抗体的制备及初步鉴定徐荣佳陈晓英(48)

抗人IL—3McAb杂交瘤细胞系的制备与鉴定黄传书陈常庆(50)

适时应用饲养细胞提高杂交瘤细胞克隆形成率的探索王建六李文锦(51)

两种简易高效的单克隆抗体提纯方法曹军平闫桂玲(52)

用体外免疫的人淋巴细胞研制抗HBsAg单克隆抗体孙佩芳桥爪秀一(54)

用BALB／c与ICR杂交子一代小鼠及新产仔母鼠生产单克隆抗体的观察渠川玫田克恭(58)

CEA单克隆抗体在肿瘤诊断和治疗中的应用及进展宁杨(62)

胃癌单克隆抗体的研究和应用吕同德(65)

肿瘤多药耐药分子单克隆抗体的研究现状李明峰(69)

T－B细胞协作研究的重大突破——滤泡辅T细胞的发现，一个新的CD^4＋效应T细胞亚群金伯泉(1)

人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定单克隆抗体通讯 陈航方瑾(6)

重组疫苗E.coliLLO／OVA经TLR4和NOD1受体诱导树突状细胞表达细胞因子徐曼戴明桑米粲(9)

体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立李贺向泽敏吴秀丽王莉卫红飞万敏王丽颖(13)

酪氨酸激酶抑制剂A771726阻断IL-13对成纤维细胞的促胶原合成作用熊丽霞李文林石小玉刘卓琦唐洪林(16)

EB病毒转化B淋巴母细胞在汉滩病毒CTL表位研究中的应用王美亮张全华王九平李永明马樱金伯泉(20)

Rapamycin和cyclosporinA对同种排斥过程中TLR5及Foxp3表达的影响陈富强曲莉莉张超梁婷宋静徐佳侯桂华(23)

IL－11保护中子照射后肠上皮损伤的Jak／STAT信号转导机制研究王瑞娟彭瑞云高亚兵常公民徐新萍付凯飞罗庆良(27)

pSG5／NS5A5BC质粒的构建及在Huh7细胞中的表达王雪萍李富军邓琳长野（藤井）基子北山喜久美堀田博(31)

大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达王欣陈莹陈杰(35)

关于《医学索引》／MEDLINE(8)

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科技动态：一群分泌IL-9-IL-10新的CD4^＋T细胞群马樱金伯泉(86)

紫杉醇和顺铂诱导下的凋亡卵巢癌细胞对树突细胞提呈功能影响冯勤梅吴霞王颖葛海良狄文(38)

免疫干预实验性自身免疫性重症肌无力小鼠的B细胞活化机制王蓉杨欢肖波张丽芳(42)

TWEAK诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成MMP-3的实验研究夏丽萍肖卫国李俊松丁爽鲁静(46)

顺铂联合exosomes抗小鼠肝癌效应的实验研究汪少华沈宜李静向自武范维珂陈黎(49)

Alzheimer患者血清中抗Aβ42自身抗体的纯化及鉴定段金海徐书雯莫建伟向绍通方运勇汪华侨莫思杰(53)

锁阳提取物对衰老模型鼠免疫功能及自由基代谢的影响刘永琦苏韫吴建军张毅魏舒畅聂蕾颜春鲁(55)

抗体工程钙整合素结合蛋白CIB的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位石洁惠玲张煦王晓辉杨金升吕同德赵治华(58)

抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定周群芳鞠吉雨郎景和(62)

人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIaFab抗体的研制及其对血小板聚集功能的影响董宁征崔宇杰阮长耿(65)

兔抗凋亡蛋白酶活化因子－1多克隆抗体的制备、纯化与鉴定张文刘胡志军高琰高志涛王辉(68)

糖皮质激素对哮喘豚鼠模型Eotaxin、CCR3表达的调控吕丽丽朱述阳刘平莉(70)

甲状旁腺素对人肾小管上皮细胞转分化和TGF-β1表达的影响李晓东丁新国李英(73)

黄芩苷对小鼠T淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响李林曾耀英黄秀艳宋兵杨志滕菲姚满林(75)

VCC－1真核表达载体的构建及肝癌细胞SMMC7721稳定转染株的建立及鉴定牟霞陈瑶王穗海黄湘李明(79)

CD1d四聚体检测NKT细胞刘景华窦立萍王莉莉于力(82)

iNKT细胞多样性调节机制及其在疾病中的作用陈钰(84)

人类自然杀伤细胞发育研究进展于建渤刘卫平(87)

内皮细胞相关黏附分子的研究进展张宇桑晨庄逢源(89)

抑制性受体LAIR家族的研究新进展马樱陈丽华金伯泉(92)

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠免疫应答的动态观察周必英陈雅棠李文桂杨梅(99)

四种靶向因子与柯萨奇病毒B3VP1融合基因疫苗免疫效果的比较刘贵霞蓝佳明揣侠高志云金玉怀张永红谢立新(103)

单克隆抗体通讯 SA/mIL15双功能融合蛋白的制备及其生物学鉴定陈艳丽许晓玲唐佳聂小霞宋志纯胡志明高基民(107)

NF-κB抑制剂和IFN-γ对BAFF-R基因启动子活性的影响袁宏香王跃国吴信华倪红兵浦江申娴娟鞠少卿(111)

完全与不完全睡眠剥夺对小鼠免疫功能的影响杨天阳黄燕华蔡昊曼余奇文(115)

ConA对CD4＋CD25＋调节性T细胞早期活化和功能的影响胡义平李晓娟刘叔文(118)

人泡沫病毒介导IL-24对肿瘤细胞的抑制作用陈思翀姚辰陈芳刘万红陶卫萍李文鑫(121)

小鼠STAT4和STAT6基因酵母双杂交表达载体的构建与鉴定张明香符州田代印王莉佳刘恩梅罗征秀戴继宏(125)

MPP＋对原代培养SAMP8小鼠中脑神经元的毒性作用刘静柳建强刘力马琳王彦永马芹颖王铭维(129)

结缔组织生长因子在幼年兔关节软骨全层缺损修复中的表达及意义付建军初同伟周跃刘玉刚(132)

骨髓源性干细胞向慢性马兜铃酸肾病大鼠肾小管上皮细胞分化的研究李维敖然姜红冯江敏(135)

UO-126对HeLa细胞增殖及对FBW7表达的影响孙迪沈宜汪少华向自武谢莹珊姜歆(138)

ASPH在肿瘤细胞和肿瘤组织中的分布及检测宋凯薛小平王伟呼延霆汪桦杨慧谢琼(141)

人源化抗炭疽芽胞杆菌保护性抗原单链抗体的设计和表达李冰张军徐俊杰刘树玲付玲李建民陈薇(145)

PCB77人工抗原的合成及多克隆抗体的制备杜瑞雪范仲学郭笃发李广存蔡利娟(149)

放疗分割剂量对食管癌细胞耐药基因表达的影响张广健高蕊张明鑫金鑫梁鹏王健生(152)

PCNA和Caspase-3在肺癌组织中的表达及意义赵阳李晓军隋昕汤小江秦宏任宏(154)

细胞角蛋白7和19在结肠癌中的表达及意义张欣郑鹏生(157)

多发性骨髓瘤患者外周血CD3ε基因的表达特点林春兰陈少华杨力建周羽竝陈思HttP://李扬秋(159)

伊马替尼对慢性粒细胞白血病患者T细胞免疫功能的影响李振宇徐开林(162)

葡萄糖转运蛋白4活性与钙超载后心肌细胞胰岛素抵抗陈焕文李勇刚石应康(164)

强化阿托伐他汀对老年冠状动脉介入后血清MCP-1、hs-CRP和sFas因子的影响问海燕陈宏斌(167)

电刺激对脑梗死大鼠运动功能及骨形成蛋白表达的影响赵丽妹李晓红王栋(169)

体外不同动态力学应变对人牙周膜成纤维细胞整合素α5、α6及β1的表达影响侯睿陈新民巢永烈李小玉(172)

Toll样受体4和巨噬细胞移动抑制因子对血管内皮细胞生物活性的影响王照娟陈龙华梁婷宋静张超侯桂华(175)

人FcγRⅠ受体胞外区基因的克隆、原核表达及纯化苗现伟刘玺张改平席俊张利娜刘运超游雷鸣(178)

人CD4＋T淋巴细胞活化相关miRNA的筛选及其靶分子鉴定薛茜郭张燕李伟王涛孟艳玲杨安钢(181)

唾液支原体分别经NF-κB依赖性和非依赖性方式诱导HGEC产生IL-1β、IL-8和表达hBD-2王玉爱刘志杰(184)

脑组织切片免疫组化技术中防止脱片制作方法夏明汗潘晓婷(187)

海洛因依赖者外周血T细胞亚群及NK细胞检测分析刘徽婷王嘉军周永芹张伟(188)

ABO血型鉴定不相符的影响因素及其预防方法张勇萍杨世明田榆曹丽妍(190)

HIV-1Tat疫苗基础研究进展庞强廖文婷潘卫(192)

肿瘤疫苗的研究进展罗军强臧林泉(195)

B淋巴细胞与免疫老化陈昌友朱华亭邱玉华(198)

间充质干细胞作为免疫调节剂用于临床肝移植治疗研究进展王嗣予王福生(200)

幽门螺杆菌alpA基因在乳酸菌中的表达及免疫原性分析孙振璐毕研伟白彩明高丹丹李智华戴宗祥李健峰(203)

人PD-1Δex3基因的克隆、表达及其生物学活性的鉴定胡振华陈永井王勤施毕旻白利雄张学光(207)

天麻素对乙醇诱导肝细胞株L02细胞损伤的影响柏志全胡巢凤孙丽萍(211)

酪氨酸磷酸化抑制剂AG490抑制JurkatT细胞增殖毛成全邢飞跃郭中峰方志远(214)

Survivin在小鼠髓源性树突状细胞不同分化阶段中的差异性表达余昆苟欣杨华安周青松仲伟营郑军(217)

葡萄球菌分离株肠毒素sek基因的分布及其蛋白的表达纯化黄金海刘业兵刘莹孙跃辉李琳张丽霞(220)

人EPO基因重组腺病毒载体的构建及表达单克隆抗体通讯 陈邦党马依彤马翔杨毅宁刘芬(223)

葛根素对脂多糖诱导N9小胶质细胞激活的抑制作用白群华李文明刘洪涛陈文娟于超(227)

DO11.10转基因小鼠脊髓损伤后的运动功能恢复王慧郭俊赵宇卞干兰刘芳芳于才勇冯睿(231)

抑制核因子κB与妊娠糖尿病大鼠子宫胰岛素抵抗的关系魏波塔娜李佳张建芳陈必良(235)

哮喘大鼠淋巴液与血液CD4^＋CD25^＋Treg及IL-10、TGF-β水平比较和地塞米松干预的影响赵志旭冯学斌石涛杨成张立霞(238)

人UNC5CL原白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定吕丹钱晓萍田晓军张毓张君(242)

翻译控制肿瘤蛋白TPT1的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用赵一璠李海芳汤石明王萌吴海东刘民李欣(246)

人源抗梭曼过渡态类似物（P6）的抗体筛选王欲晓贾培媛王玉霞乔媛媛杨日芳周丽君(250)

人Fkbp19的多克隆抗体的制备范开吉张彦刘迺发孙强杨晓(253)

抗GBM抗体特异性单链抗体scFv3原核表达载体的构建及表达王雅楠刘章锁邢国兰赵国强肖静王沛(255)

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶单克隆抗体抗原表位的鉴定及应用单锦露戴楠张沁宏李增鹏曹晓静王东(258)

尼美舒利提高γδT细胞杀伤胃癌细胞的机制探讨刘军权陈复兴巩新建李慧忠蔡凯张宝福张颂(261)

URG4在肝癌组织中的表达及其与HBx的关系王燕李增山刘杰谢华红(264)

类风湿性关节炎患者外周血Th17/Treg细胞比率失衡的研究牛倩黄卓春蔡蓓王兰兰冯伟华(267)

IL-17A与自身免疫性疾病发病机制的初步探讨陈小奇徐焱成邓浩华孙家忠代喆(270)

系统性红斑狼疮患者血清中β抑制蛋白质-1水平及其与疾病活动性的关系王敬亚王晓非蒋力张晓莉张晶陈涓涓孙小凤(273)

海洛因依赖者急性戒断前后IL-1β、TNF-α、ACTH及CORT含量变化的研究刘徽婷王嘉军(274)

鼻腔及鼻窦内翻性状瘤预后与临床病理免疫组织化学参数的相关性李延辉(276)

D2蛋白酶双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立苏洁王斌鲁晓晴赵巍闫志勇钱冬萌丁守怡(278)

卵清蛋白雾化吸入诱导肠道菌群失调小鼠肺部过敏反应的发生孙大庆杨锡强刘玮李欣(281)

Hlx修饰的树突状细胞系（DC2.4/mHlx）的建立何志强王胜军薛渊石燕柳迎照仝佳陈建国(285)

锂-匹鲁卡品诱导大鼠癫痫发作后海马齿状回IL-1mRNA表达的变化张世俊李晓伟王莹魏东江文(288)

介导穿孔素短发夹RNA重组腺病毒的构建及其生物学作用赵莉琳刘阳(291)

颈动脉狭窄影响大鼠认知功能及海马神经元凋亡张强寇宏兰晶池英张其梅李耀彩(294)

调节性T细胞foxp3基因表达的表观遗传学调控郭庆明（综述）王青青（审阅）(296)

第12篇

云南省普洱市人民医院血液科，云南普洱 665000

[摘要] 多发性骨髓瘤（MM）属于一种血液系统肿瘤，基因染色体的突变、MM瘤细胞和骨髓微环境的交流等均在其发病过程中发挥着至关重要的作用。近年来，临床治疗MM的热点已经转变为对MM和骨髓微环境关系进行深入的研究，对各条异常活化的信号通路进行有针对性的治疗过程中运用靶向药物。该研究首先概述了骨髓微环境在MM 发病机制中的作用，然后从沙利度胺及其衍生物、蛋白酶体抑制剂、免疫治疗与分子生物学治疗三个方面对骨髓微环境在多发性骨髓瘤靶向治疗近况进行了分析探讨。

关键词 骨髓微环境；多发性骨髓瘤（MM）；发病机制；作用；靶向治疗近况

[中图分类号] R738 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）07（c）－0197-02

[作者简介] 董进梅（1973-），女，彝族，云南普洱人，本科，副主任医师。

骨髓微环境中各种成分能够促进MM瘤细胞的生存、增殖等，其途径是多条信号转导通路的异常活化。目前，临床关注的焦点是对MM在骨髓中的发病机制有一个清晰的认识，促进靶向治疗针对性的显著提升及药物对MM细胞毒性的显著增强，对耐药进行有效的防止，对患者的预后进行切实有效的改善等。该文现就骨髓微环境在多发性骨髓瘤发病机制中的作用及靶向治疗近况作如下综述。

1 骨髓微环境在MM 发病机制中的作用

MM能够促进IL-6的旁分泌，具体机制为通过黏附分子和细胞外基质蛋白，也就是黏附骨髓基质细胞，而IL-6又能够进一步促进MM细胞的增殖及存活，并对其进行有效的维持。Chatterjee等医学学者研究发现，人MM细胞的存活在存在骨髓基质细胞的情况下不会对IL-6 /gp130 / Stat3信号通路进行以来。同时证实，MM的发生和发展有黏附分子异常表达的参与，我们可以从以下两个方面看黏附分子异常表达对MM发病机制的影响：①促进骨髓瘤前提细胞的归巢；②促进破骨细胞激活因子及骨髓瘤细胞生长因子的产生。MM细胞的归巢的介导因素为CD44、ICMA-1、MPC-1 (CD11b)、VLA-4、VLA-5等[1]。MM结合基质蛋白及黏附基质细胞的情况下均会在极大程度上调节MM细胞的生长，具体机制为通过syndecan- 1和N 型胶原、VLA-4和纤连蛋白的作用及VLA-4（位于MM细胞表面）结合VCVM-1（属于基质细胞）。MM细胞的生长和生存可以在syndecan -1黏附机制下得到极大的发展，对基质金属蛋白酶(MMP) -1进行诱导，使其产生，从而为骨的吸收及肿瘤的浸润提供良好的前提条件。P27及其他相关基因表达水平会在MM细胞黏附纤连蛋白的情况下上升，进而对细胞耐药进行介导。IL-6的转录及分泌一方面会在MM黏附基质细胞的作用下发生重大改变，另一方面还会在MM细胞本身分泌VEGF等的作用下发生重大改变，而IL-6的转录和分泌以来基质细胞NF-JB[2]。

2 骨髓微环境在多发性骨髓瘤靶向治疗近况

2.1 沙利度胺及其衍生物

2.1.1 沙利度胺 20世纪50年代，沙利度胺首次进入欧洲市场。沙利度胺属于一种镇静剂，曾经在孕妇妊娠呕吐的治疗中得到了一定的应用，但是由于其会引发严重的并发症，如胎儿畸形等，因此逐渐退出了市场[3]。Singhal等医学学者在1999年对沙利度胺在复发及难治性多发性骨髓瘤中的良好临床疗效进行了首次报道，发现沙利度胺将其抗肿瘤作用发挥出来的具体机制可以从以下几个方面看出：①沙利度胺能够对新生血管生成进行有效的抵抗；②沙利度胺能够对细胞表面粘附因子进行有效的调节，同时对其相互间的作用有着深远的影响；③会对瘤细胞及基质细胞的多种细胞因子分泌造成极大程度的影响，将其生物活性改变；④在T和NK细胞上作用能够促进宿主免疫杀伤骨髓瘤细胞作用的显著增强[4]。

2.1.2 沙利度胺衍生物 在MM的治疗中，沙利度胺衍生物具有令人满意的临床疗效，磷酸二酯酶抑制剂和非磷酸二酯酶抑制剂是其主要的分类，其中磷酸二酯酶抑制剂属于选择性细胞因子抑制剂，能够对肿瘤坏死因子-A（TNF-A）进行有效的抑制，不会激活T细胞；非磷酸二酯酶抑制剂属于免疫调节药物，能够将T细胞显著激活，对IL-2及INF-C进行刺激[5]。免疫调节药物来那度胺是美国Celgene公司研发出来的，对T细胞增殖能力进行激活的能力及对IL-2及INF-C分泌的刺激能力均明显比沙利度胺大。来那度胺还能够将MM细胞的耐药有效克服掉，从而对MM细胞的生长进行有效的抑制。在其作用下，对美法仑及丝裂霉素等和地塞米松耐药的受益患者分别达到了总数的20%~35%和50%[6]。此外，来那度胺还能够促进地塞米松抗MM作用的显著增强。所有这些均告诉我们，在耐药MM的治疗中，来那度胺具有极为广阔的应用前景。

2.2 蛋白酶体抑制剂

硼替佐米属于蛋白酶体抑制剂，是FDA在2003年批准用药，在复发性难治性MM的治疗中具有良好的应用效果，其能够对蛋白酶体26S亚基进行特异性抑制，促进I-JB降解的极大减少，并对NF-JB活性及IL-6触发的MAPK生长信号进行抑制，从而对MM细胞的增生进行有效的抑制，组织MM细胞粘连骨髓基质细胞( BMSC )，对其进行诱导，使其凋亡，对NF-JB激活产生的耐药性进行有效的防止，同时切实有效地保护抗IL-6，对骨髓血管的新生造成阻碍，促进DEX疗效的显著增强[7]。在初发MM的治疗中，单药硼替佐米达到了40%左右的缓解率，而硼替佐米+美法仑+泼尼松(VMP)、硼替佐米+ 沙利度胺+ 地塞米松(VTD)等联合方案则能够达到70%~90%的缓解率[8]。目前，临床相关医学学者正在通过实验对第二代蛋白酶体抑制剂进行研究，预计其对肿瘤细胞的作用将明显比硼替佐米高，而其不良反应则将明显比硼替佐米低。

2.3 免疫治疗与分子生物学治疗

在临床肿瘤的治疗过程中，大量应用细胞因子的治疗方法在重组基因工程技术中运用细胞因子疗法的情况下成为可能，而目前，在MM的治疗中，白介素-2（IL-2）、IFN-C等是具有较为广泛应用的细胞因子。IFN-A属于多功能细胞因子，能够对病毒及肿瘤细胞增殖活性进行有效的抵抗，同时还能够对人体免疫功能进行有效的调节[9]。相关医学研究表明，如果MM患者伴有微小残留病，那么IFN-A将会具有更为有效的治疗效果[10]。近年来，在多发性骨髓瘤的治疗中，IFN-A已经得到了日益广泛的应用，特别是在维持治疗诱导缓解后或自体造血干细胞移植后的MM的治疗中更是具有无比的优越性。IL-2在宿主抗肿瘤免疫的细胞因子中占有极为重要的地位，在极大程度上调节着细胞因子网络，能够对T细胞的增殖和分化进行有效的刺激，对其进行诱导使其产生细胞毒性T细胞，显著增加NK细胞的数目，对B细胞进行刺激使其增殖分化，对T细胞进行有效使其将IFN-A和IFN-C分泌出来，同时使移植物抗肿瘤效应有效产生，将产生LAK细胞激活，在许多体内、体外的肿瘤细胞中溶解，途径为MHC非限制性方式[11-12]。

综上所述，骨髓微环境在多发性骨髓瘤的发病机制中发挥着至关重要的作用，靶向治疗中沙利度胺在补救治疗初发骨髓瘤的过程中具有极为重要的作用，而ATO、VEGF受体抑制剂、法尼基转移酶抑制剂等则在稳定复发或难治MM患者的过程中具有极为重要的作用。目前，对患者进行有效的分类，然后运用有针对性的措施对患者进行治疗仍然是临床需要关注的课题。广大相关医学学者应该更进一步深入细致地研究多发性骨髓瘤靶向治疗等方法，以为减轻患者病痛、提升对患者治疗的有效率及医院的综合效益做出积极的贡献。

参考文献

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[2] 陈丽娟，许家仁，周卫华. 骨髓微环境对多发性骨髓瘤瘤细胞AP-1家族成员基因表达的调节作用[J].中国实验血液学杂志， 2010(1) :103-106.

[3] 何青，汪兴洪. Dapper在多发性骨髓瘤发病机制中的作用[J].医学综述， 2013(9):1589-1591.

[4] 蒙珊，周芙玲，白改改. Dickkopf(DKK1)在多发性骨髓瘤骨病中的作用及其靶向治疗的研究进展[J].肿瘤，2011(3) :273-276.

[5] Chauhan D， Singh A， Brahmandam M， et al. Combination of proteasome inhibitors bortezomib and NPI-0052 trigger invivo synergistic cytotoxicity in multiple myeloma[J].Blood， 2008，111(3) :1654-1664.

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[7] 汪娟，傅琤琤. 多发性骨髓瘤髓外复发研究进展[J].中国实验血液学杂志， 2012(5) :1261-1266.

[8] 王孟昌，张斌. 髓样细胞白血病-1基因在多发性骨髓瘤发病中的分子机制[J].西安交通大学学报:医学版， 2011(4):429-432，448.

[9] 杨烨，顾春艳，陆美龄.等. CAY10404靶向干预Wnt/β-catenin信号通路对多发性骨髓瘤干细胞清除作用的研究[J].药物生物技术， 2013(2):128-132.

[10] Gerlo S，Haegeman G，Vanden Berghe W. Transcriptional regulation of autocrine IL- 6 expression in m ultiple myeloma cells[J].Cell Singnal， 2008，20(8):1489-1496

[11] 徐进. CHOP+CCNU治疗多发性骨髓瘤25例近期疗效观察[J].浙江临床医学，2007(3) :326.

[12] 高宇，周郁鸿，沈一平，等.中西医结合治疗多发性骨髓瘤的临床疗效观察[J].浙江临床医学，2011(12):1340-1342.

（收稿日期：2014-04-29）

论文中医学名词术语的使用

1.冠以外国人名的体征、病名、试验、综合征、方法、手术等，人名可以译成汉语，但人名后不加“氏”字；也可以用外文，但人名后不加“′s”。例如：Babinski征，可以写成巴宾斯基征，不写成Babinski′s征，也不写成巴宾斯基氏征。若为单字名则仍保留“氏”字。例如：福氏杆菌。

2.名词术语一般应用全称，若全称较长且反复使用，可以使用缩略语或简称，但在摘要和正文中第一次出现时，均应分别注明全称和简称。例如：流行性脑脊髓膜炎（流脑），阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstmctive sleep apnea syndrome，OSAS）。西文缩略语不宜拆开转行。不要使用临床口头简称（例如将“人工流产”简称“人流”）。凡已被公知公认的缩略语可以不加注释直接使用。例如：DNA、RNA、HBsAg、HBsAb、PCR、CT、DIC等。

第13篇

糖尿病视网膜的危害情况

随着我国国民经济的发展，生活方式的改变，大家生活好了，可是糖尿病的发病率却在逐年增加。据统计，目前全国糖尿病的患病人数在4000万人以上，这当中约30%左右可能已经有糖尿病视网膜病变，这样，糖尿病视网膜病变的患者应该会有1000万，而这之中视力受到严重威胁的可能要在300万左右。即使在美国这样的发达国家，糖尿病引起的失明每年大概1，2000～2，4000人，可见糖尿病对我国人民视觉的影响有多大。作为眼科医生，我们几乎每天都能见到因为糖尿病而失明的患者，因此，感到肩上的担子是十分沉重的。

糖尿病视网膜病原因

是否发生糖尿病视网膜病变取决于患病时间的长短和血糖、血压、血脂的控制情况以及个体的差异性。一般来说，刚发生糖尿病是不会有糖尿病视网膜病变的，但随发病时间延长，一般7年～8年以后，就慢慢开始出现糖尿病视网膜病变了，随着时间延长病变会越来越加重。当然，如果您的血糖、血压、血脂控制得很好，生活方式很健康，心态也很好，可能病变发生得晚，我们也见过患糖尿病50多年，而眼底竟然没有发生病变的。个体差异也很大，有的个体尽管血糖控制得不错，但发生糖尿病视网膜病变却很厉害。

另外，1型糖尿病发生糖尿病视网膜病变早且严重，2型糖尿病视网膜病变发生视网膜病变要晚一些。

法治疗糖尿病视网膜病变的方法

近年来医药科技进步很快，尤其是抗血管生成药物的出现，使得糖尿病视网膜病变的治疗有了更多的治疗选择。比如，激光联合抗血管生成药物玻璃体腔注射治疗，对控制黄斑水肿会有更好的效果；又如，对已经有新生血管形成的病例，玻璃体腔注射抗血管生成药物，可以帮助新生血管的退缩，尤其新生血管在视神经上无法激光时。

在有些糖尿病视网膜病变晚期，必须手术的病例，也可以先注射药物，然后再手术，可以减少术中出血。

糖尿病引起的青光眼的治疗方式

首先采用先注射抗血管生成药物，将虹膜新生血管退缩，其次再联合眼底激光、或睫状体光凝、或小梁切除术，在最短的时间内把眼压控制下来。这非常关键，如果眼压很高，又迟迟得不到控制，最后视神经萎缩了，就什么都晚了。因此，必须刻不容缓地采取措施，将虹膜新生血管退缩，控制眼压。

糖尿病视网膜病变手术治疗

第14篇

1资料与方法

1．1方法

1．1．1分离培养hBMSCs在志愿者髂前上棘抽取骨髓10mL。采集的骨髓用生理盐水1∶1稀释，密度为1．077g／L的淋巴细胞分离液2000r／min离心15min，收集白膜层，生理盐水漂洗2次。以含10％FBS的L－DMEM作为完全培养液，以一定密度接种于75mL培养瓶中，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱内培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每2～3d换液1次，待细胞达80％融合时，用0．25％胰酶＋0．02％ED－TA消化，以1∶3的比例传代培养。

1．1．2流式检测hBMSCs表型hBMSCs用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化，1000r／min离心5min，生理盐水洗涤，制备成1×106／mL单细胞悬液，分别加入荧光标记的鼠抗人CD34、CD29、CD105抗体，设置空白对照，避光冰育30min，生理盐水洗涤3次后重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1．1．3鉴定hBMSCs多向分化潜能以4×103／cm2密度将第3代hBMSCs接种于6孔板，每孔2mL。（1）成脂诱导及鉴定：细胞达到完全融合后4d，实验组加入脂肪诱导液（H－DMEM，10％FCS，0．5mmol／LIBMX，10μg／mL牛胰岛素，0．2mmol／Lindomethacin，1μmol／L地塞米松）诱导3d，再用脂肪保持液（H－DMEM，10μg／mL牛胰岛素，10％FCS）处理1d，循环3次，再用脂肪保持液处理2d。对照组加入含10％FCS的H－DMEM，每3天换液1次。2周后油红O染色鉴定。（2）成骨诱导及鉴定：细胞达到60％～70％融合后，实验组加入成骨细胞诱导液（OS，含1×10－7mol／L地塞米松，10mmol／L甘油磷酸钠，50g／mL维生素C），对照组加入L－DMEM完全培养液，置培养箱中，每2天换液1次，第21天终止诱导。茜素红S染色鉴定。

1．1．4分组处理hBMSCs采用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化hBMSCs，用不同输注液制备单细胞悬液。根据输注液不同分为生理盐水组（9g／L氯化钠注射液）、糖盐组（50g／L葡萄糖氯化钠注射液）、清蛋白组（含5％人血清蛋白的氯化钠注射液）。分别在4℃和25℃温度条件下置于不同时间点（0．5、1．0、2．0、4．0，6．0h）后进行以下检测。（1）取90μL细胞悬液与10μL胎盘蓝混匀，3min内计数活细胞（未染色）和死细胞（染色），测定细胞存活率。（2）另取1×106／mL细胞行流式细胞术检测细胞表型CD34、CD29、CD105。（3）再将不同分组细胞悬液，1000r／min离心5min，采用含10％FBS的L－DMEM作为完全培养液，以1×103／mL密度接种于96孔板，每组设3个复孔，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养7d。采用CCK－8在酶联免疫检测仪上测定450nm各孔波长吸光度（A）值，以时间为横轴，A值为纵轴绘制生长曲线。

1．2统计学处理采用SPSS17．0进行数据分析，结果用x±s表示。采用t检验进行两组均数间比较，采用单因素方差分析进行多组均数间比较，采用LSD最小显著差数法进行均数间两两比较。P＜0．05表示差别有统计学意义。

2结果

2．1hBMSCs形态观察原代hBMSCs贴壁后，呈圆形，散在分布。3d后完全换液，去除未贴壁细胞，可见少量分散短梭形贴壁细胞。第14天时，贴壁细胞融合成单层，细胞排列有明显方向性，呈漩涡状。见图。

2．2hBMSCs的表型流式检测第3代hBMSCs的表型发现，CD105阳性率98．7％，CD29阳性率97．7％，表达率极高；CD34阳性率为2．9％，表达呈阴性。

2．3hBMSCs分化能力鉴定hBMSCs成脂诱导2周后，光学显微镜下可见大量融合成串珠状的圆形脂滴。油红O染色可见被染成橙红色的脂滴，显示分离的hBMSCs可被诱导向脂肪细胞分化。成骨诱导3周，细胞逐渐融合，失去细胞结构，14d左右出现明显钙结节，茜素红S染色后可见散在大量橘红色钙结节，显示培养的hBMSCs可被诱导向成骨细胞分化。

2．4hBMSCs存活率检测在5个时间点（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）对保存在25℃、4℃的3个实验组的细胞存活率检测，结果见表1～2。结果显示，糖盐组细胞存活率最低，25℃保存4．0h时只有约10％细胞存活；而清蛋白组细胞存活率最高，25℃保存2．0h时清蛋白组细胞存活率仍可达90％，差异有统计学意义（P＜0．05）。25℃和4℃条件下，保存0．5h时，生理盐水组及清蛋白组细胞存活率都超过90％，随着保存时间延长，各组细胞存活率逐渐下降。

2．5不同分组细胞表型检测25℃和4℃条件下，在5个时间点（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）对3个实验组的细胞表型检测，结果见表3～5。结果表明，不同输注液、保存温度及保存时间对细胞表型影响差异无统计学意义（P＞0．05）。

2．6细胞生长曲线测定将不同分组处理后的细胞，采用L－DMEM完全培养液重新接种培养，检测细胞增殖能力，结果见图2（见《国际检验医学杂志》网站“论文附件”）。50g／L葡萄糖氯化钠注射液组保存的细胞增殖能力最差，保存4h后细胞失去贴壁和生长能力（无细胞贴壁无法完成生长曲线）。5％人血清清蛋白氯化钠注射液组细胞增殖能力比9g／L氯化钠注射液组细胞增殖能力强。同一组细胞4℃条件下不同时间点的增殖能力比25℃条件下强。随着保存时间延长，各组细胞增殖能力逐渐下降。

3讨论

hBMSCs是来源于骨髓的间质干细胞，不仅能分化成肝细胞、胆管上皮细胞［4］、血管内皮细胞［5］、不同类型的皮肤细胞［6］、神经样［7］细胞，还具有免疫调节、炎症趋化等特性，使其在肝脏疾病、血管外科、烧伤整形外科及神经损伤等疾病治疗中发挥越来越重要的作用。干细胞注射液从实验室制备到运送至病房回输给患者具有一定时空距离，特别是随着异地移植病例的增多，如何有效地保存干细胞注射液，对于细胞移植的临床应用非常重要。目前相关研究更多集中于将干细胞冷冻于－80℃或液氮等进行长期保存的探讨［8－9］，有关短时保存条件对干细胞生存和生长影响的研究不多。本实验探讨了几种临床常用注射液在不同温度下短时保存干细胞对细胞存活和增殖能力等状况的影响。形态学观察显示，培养的细胞呈均一长梭形，辐射状生长；流式细胞术检测细胞表型显示CD34表达阴性，CD29、CD105表达阳性；成脂诱导后出现大量脂滴，成骨诱导后出现钙结节，表明该细胞确为hBMSCs。

第15篇

近年来，牙周病与心血管疾病的相关性研究已成为热点，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingi-valis，P. gingivalis）是牙周炎重要的致病菌之一。有研究[2]发现，在牙周炎患者中，牙龈卟啉单胞菌可以通过咀嚼、刷牙等途径进入血液循环，并且人动脉粥样斑块组织中可以检测到牙龈卟啉单胞菌的存在。目前牙龈卟[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]啉单胞菌影响AS发生、发展的机制尚未完全阐明，尤其对血管平滑肌的影响尚未见报道。本研究观察牙龈卟啉单胞菌感染VSMC后对其细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表达的影响，多层面探讨牙龈卟啉单胞菌在AS疾病发生、发展中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物中心提供的雄性SD大鼠为研究对象，体重100 g。

1.2 试剂和仪器

P. gingivalis ATCC 33277菌株（上海交通大学医学院附属第九人民医院），RPMI-1640培养液、DMEM、胎牛血清、二甲基亚砜（dimethyl sulfo-xide，DMSO）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），青霉素（石家庄华北制药集团有限责任公司），链霉素（大连美罗药业股份有限公司），脑心浸液（brain heart infusion，BHI）培养基、L-半胱氨酸盐酸盐、氯化血红素、维生素K1、无菌脱纤维羊血（北京陆桥技术有限责任公司），细胞培养箱、超净工作台（NUAIR公司，美国），细菌培养箱（上海叶拓公司），低温高速离心机（Beckman公司，美国），倒置显微镜（Olympus公司，日本），H-300

透射电镜（transmission electron microscope，TEM）（Hitachi公司，日本），电子天平（Sartorius公司，德国）。

1.3 细胞培养

1.3.1 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的原代培养 10%水合氯醛（每100 g体重3 mL）腹腔麻醉SD大鼠后，于无菌条件下，开胸，揭起左侧肺叶，紧靠脊柱的左前方取胸主动脉，长约15 mm，冲洗去除残留的血液，剔除血管外膜，将血管剪开，用刀片轻刮去除血管内膜。将组织剪成0.5～1 mm3的小块，接种于25 cm2培养瓶中，于37 ℃恒温培养箱内（5%CO2，37 ℃，饱和湿度条件）放置3～4 h，使组织块较牢固地黏附于培养瓶壁，加入0.5～1 mL含20%胎牛血清的DMEM培养液，3～5 d更换培养液1次。

1.3.2 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的传代培养 当单层细胞长满培养瓶底的80%时可进行传代，弃去原培养液，加入0.25%胰蛋白酶约1 mL，显微镜下观察。当细胞收缩呈圆形时，立即加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。用吸管反复吹打瓶壁使细胞自瓶壁上脱落，1∶2分装成两瓶。

1.3.3 细胞鉴定以及超微观察 取对数生长期的单层细胞，弃去原培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化，

1 000 r·min-1离心10 min，PBS清洗3次后，弃上清液，加入2%戊二醛固定2 h，1%锇酸固定2 h，丙酮序列脱水，包埋，制备半薄切片（厚度约为0.8 μm），制备超薄切片（厚度约为90 nm），醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色，TEM观察细胞的形态以确定提取培养的细胞为平滑肌细胞。

1.4 细菌培养

将P. gingivalis ATCC 33277菌株接种于BHI培养基上，按比例加入氯化血红素、维生素K1、L-半胱氨酸盐酸盐、无菌脱纤[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]维羊血，37 ℃厌氧培养（10%CO2，10%H2，80%N2）约5 d，悬菌于PBS中，配置菌液至1×1010（660 nm处光密度值达1.0，绘制生长曲线），生化革兰染色形态检查为纯培养物。

1.5 牙龈卟啉单胞菌感染VSMC模型的建立

取对数生长期的单层细胞，弃去原培养液，加入无血清的DMEM维持液，接种P. gingivalis ATCC 33277，使细菌与细胞的感染倍数为100︰1。实验设牙龈卟啉单胞菌感染VSMC 8 h组、16 h组、24 h组，另设空白对照组（细胞中仅加入无血清的DMEM维持液）。实验组内、组间各重复3次。

1.6 逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-po-lymerase chain reaction，RT-PCR）检测ICAM-1mRNA的表达提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。ICAM-1-F为：5’-AGGTATCCATCCATCCCACA-3’，ICAM-1-R为：5’-GCCACAGTTCTCAAAGCACAG-3’，扩增片段长度为240 bp。18s管家基因用作内参，18s-F：5’-GTGGAGCGATTTGTCTGGTT-3’， 18s-R：5’-CGCTGAGCCAGTTCAGTGTA-3’， 扩增片段长度为260 bp。PCR反应体系为25 μL，PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，进行30个循环，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳成像，使用凝胶定量软件quantity one分析电泳条带，计算目的条带的相对浓度。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析，采用方差分析进行组间比较，并进行两两比较，P<

0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VSMC形态学观察

光镜下，贴壁的VSMC多为长梭形或梭形，细胞呈“铺路石”样生长。TEM观察可见，细胞胞浆内富含肌丝，基膜下和胞浆内可见密斑和密体，在近胞膜处可见较多饮泡。牙龈卟啉单胞菌感染VSMC后，TEM观察可见：感染8 h时，仅见牙龈卟啉单胞菌黏附于VSMC表面；感染16、24 h时，牙龈卟啉单胞菌不仅黏附于VSMC表面，而且有部分牙龈卟啉单胞菌侵入VSMC的细胞质中。VSMC细胞膜不连续，肌丝减少，粗面内质网扩张，线粒体嵴呈溶合状态，高尔基体呈扁平囊样肿胀，吞噬体增多，脂滴增多（图1）。

2.2 ICAM-1 mRNA的表达结果

RT-PCR法检测ICAM-1 mRNA表达的变化，结果显示空白对照组未见ICAM-1的表达，牙龈卟啉单胞菌感染8、16、24 h后均可见ICAM-1 mRNA的表达，与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。牙龈卟啉单[专业提供 写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]胞菌感染16、24 h后，ICAM-1 mRNA表达的量几乎相同，差异无统计学意义。感染16、24 h与8 h相比，ICAM-1 mRNA表达的量增加，差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。

3 讨论

牙周炎是一种以菌斑微生物为始动因子的慢性炎症，在牙周微生物中，革兰阴性厌氧短杆菌——牙龈卟啉单胞菌是重要的牙周可疑致病菌。牙龈卟啉单胞菌按黏附力强弱可分为高黏附菌株ATCC 33277和低黏附菌株W83。Nakagawa等[3]研究证明牙龈卟啉单胞菌有多种毒力因子，可通过毒力因子黏附于口腔组织和上皮细胞的表面，从而进一步侵入牙周组织及细胞并进行繁殖。Watanabe等[4]研究发现，无论对于上皮细胞还是成纤维细胞，P. gingivalis ATCC 33277菌株的黏附能力均高于W83菌株。因此，本研究选择高黏附菌株ATCC 33277作为研究对象。

AS是一种由多因素引发的疾病，流行病学调查显示，心血管疾病是全身性感染的先兆[5]。AS一直被认为是血管壁慢性脂质代谢异常和血管舒张功能受损的过程。近年来，一些学者[6]提出AS不单纯是由于脂质沉积所致，而是一种炎症性疾病，局部和远隔部位感染可以促进AS的慢性炎症过程。Inaba等[7]研究得出牙龈卟啉单胞菌与平滑肌细胞的迁移和增殖有关。目前认为，AS的形成是动脉对内膜损伤的反应，血管内膜损伤后，引起血流动力学改变，产生湍流剪切应力，从而导致低密度脂蛋白进入内膜和内膜下，使平滑肌细胞增殖并迁移至内膜，使单核细胞聚集于内膜发展成为泡沫细胞。本实验建立牙龈卟啉单胞菌感染VSMC的体外模型，研究发现：被牙龈卟啉单胞菌感染的VSMC细胞膜不连续，细胞器的形态发生变化，感染16 h时，有牙龈卟啉单胞菌侵入到VSMC的细胞质中，牙龈卟啉单胞菌仍然保持着表面的菌毛和外膜结构。这表明牙龈卟啉单胞菌的侵入有可能导致VSMC凋亡，从而引起AS斑块的形成。