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第1篇

[关键词] 喷雾干燥条件；吸湿性；含水量；吸湿率-时间曲线；吸湿速度

骨痹颗粒复方是由桑寄生、骨碎补、千年健、牛膝、鸡血藤、油松节、土鳖虫等组成的纯中药制剂，临床上用来治疗老年性关节炎具有很好的效果。喷雾干燥是骨痹颗粒制备工艺的重要工序。中药粉体的吸湿性一直是喷雾干燥领域研究的重点，但其研究内容多为考察不同制剂辅料[1]，以及粉体表面改性技术对中药粉体吸湿性的影响[2]。本文以骨痹颗粒复方为实验体系，通过考察不同工艺条件下喷雾干燥样品含水量与吸湿性能，建立吸湿过程动力学模型，结合扫描电镜技术，分析相关吸湿机制，为中药喷雾干燥工艺优化研究提供一种新的方法。

1 材料

BUCHI B-290小型喷雾干燥机（瑞士布奇公司）；S4800扫描电镜（日本日立公司） ；Waters2695高效液相色谱仪，Waters2998光电二极管阵列检测器（美国沃特世公司）；RE52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SK8200H超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；754型紫外分光光度仪（上海光谱仪器有限公司）；赛多利斯MA30快速红外水分测定仪（德国赛多利斯有限公司）；GQ105管式离心机（上海市离心机械研究所）；岛津AUW120D电子天平（日本岛津公司）。

川续断（产地东北，批号111026）；怀牛膝（产地贵州，批号111026）；骨碎补（产地贵州，批号111026）；千年健（产地广东，批号111026）；鸡血藤（产地广西，批号111026）；土鳖虫（产地安徽，批号111026）；桑寄生（产地广西，批号111026）；油松节（产地安徽，批号111026）均购自亳州市中药材饮片厂，经本校吴启南教授鉴定，均符合2010年版《中国药典》（二部）要求。

2 方法

2.1 骨痹颗粒水提液的制备

按如下处方：川续断（25 g）、怀牛膝（15 g）、骨碎补（15 g）、千年健（15 g）、鸡血藤（25 g）、土鳖虫（10 g）、桑寄生（25 g）、油松节（15 g）称取总处方量145 g水煎煮2次，每次10倍量水。水提液经过4层纱布过滤得滤过液，旋转蒸发浓缩到相对密度为1.05 g・mL-1备用。

2.2 喷雾干燥工艺考察因素及其水平的确定

中药提取液的喷雾干燥工艺研究，一般以进出、口温度，空气流量，雾化压力，送料速度，送料密度及喷雾辅料为考察因素[3-6]。根据预实验并结合有关文献，本实验中选择进口温度（A）、送料密度（B）、送料速度（C）、空气流量（D）4个因素进行考察。为了确定各因素水平的考察范围，进行了如下单因素实验。

2.2.1 进口温度对喷雾干燥的影响 控制送料密度为1.01 g・mL-1，送料速度为15 mL・min-1，空气流量40 m3・h-1，选取进口温度分别为110，120，150，180，200 ℃，分析进口温度对喷雾干燥过程的影响。实验发现进口温度为110 ℃与200 ℃时均出现了黏壁现象。为了使客观存在的差异明显，在考察温度的影响时选择了120，180 ℃这2个水平。

2.2.2 送料密度对喷雾干燥的影响 控制进口温度为150 ℃，送料速度为15 mL・min-1，空气流量为40 m3・h-1，选取送料密度分别为1.01，1.03，1.05，1.10 g・mL-1，分析送料密度对喷雾干燥过程的影响。结果显示，送料密度为1.10 g・mL-1时物料过浓，在喷雾干燥过程中会发生喷头堵塞的情况。与上同理，送料密度选择了1.01，1.05 g・mL-1这2个水平。

2.2.3 送料速度对喷雾干燥的影响 控制进口温度为150 ℃，空气流量为40 m3・h-1，送料密度为1.01 g・mL-1，选取送料速度分别为5，10，15，20，30 mL・min-1分析送料速度对喷雾干燥过程的影响。实验发现送料速度为30 mL・min-1时，出口温度为48 ℃，粉末黏附在喷雾干燥室内壁上；而送料速度为5 mL・min-1时虽然干燥完全，但是喷干效率较低。送料速度选择了10，20 mL・min-1这2个水平。

2.2.4 空气流量对喷雾干燥的影响 控制进口温度为150 ℃，送料密度为40 m3・h-1，送料速度为15 mL・min-1，选取空气流量分别为20，30，40，50，60 m3・h-1分析空气流量对对喷雾干燥过程的影响，实验发现空气流量为20 m3・h-1时物料完全粘附在内壁。而在其他条件下均正常，但空气流量在60 m3・h-1时喷干用氮气使用过快，使空气流量无法始终保持在高流量，会出现无法准确控制条件的情况。于是空气流量选择了30，50 m3・h-1这2个水平。

综上所述，选择进口温度（120，180 ℃）；进样密度（1.01，1.05 g・mL-1）；送料速度（10，20 mL・min-1）；空气流量（30，50 m3・h-1）进行以下实验。

2.3 喷雾干燥实验设计

以上述因素水平设计平行比较实验，控制除考察因素以外的条件保持一致，考察不同喷雾干燥因素对粉体含水量与平衡吸湿量的影响。

2.4 粉体含水量与吸湿性的测定

2.4.1 含水量测定 样品在喷雾干燥完成后，立即采用赛多利斯MA30快速红外水分测定仪测定水分含量。

2.4.2 粉体的吸湿性测定 中药粉体的吸湿性能往往采用平衡吸湿量表征，但平衡吸湿量所代表的是物料达到吸湿平衡时的含水量[7]。有些物料虽然平衡吸湿量很大，吸湿过程却很缓慢；而有些物料在一定短时间内吸湿量猛增，之后却增长缓慢。所以平衡吸湿量只能衡量吸湿终点物料的特性，而不能反映物料吸湿过程的速度特征。为表征物料吸湿速率，本研究参考文献[8]，引入吸湿率-时间曲线以及吸湿初速度、吸湿速度、吸湿加速度等参数。以冀能较全面的表征中药喷干粉的吸湿行为。

平衡吸湿量测定方法：取样品约300 mg，精密称量，平摊于称量瓶中，厚度不超过5 mm，开盖置于干燥器中48 h脱湿平衡。精密称重后置于25 ℃，相对湿度75%的恒温恒湿箱中，每隔一定时间测定，计算吸湿增重，一直维持24 h。

喷雾干燥样品吸湿率-时间曲线的绘制：计算吸湿率，以吸湿率为纵坐标，时间为横坐标，绘制吸湿率-时间曲线。吸湿率=（吸湿后样品质量-吸湿前样品质量）/吸湿前样品质量×100%。

吸湿过程动力学分析：粉体吸湿过程数据一般可用多项式方程进行拟合，对喷雾干燥各样品的吸湿曲线数据进行回归拟合，可得到如下吸湿方程[9]。

由方程（1）～（3）求算各样品的吸湿初速度、吸湿平衡时间、吸湿速度与吸湿加速度。

2.5 微粒的形貌观察

取不同条件下制备的喷雾干燥粉末少许，固定于电镜样品台导电胶上喷金，然后在真空条件下进行成像观察。

3 结果与讨论

3.1 吸湿曲线的绘制与吸湿过程速度方程的计算与比较

骨痹颗粒喷雾干燥实验结果见表1。

为了表征不同喷雾干燥条件下粉末的吸湿特征，按照表3的拟合方程以2.4.2项下方法进行了数学计算，得到各组不同条件喷干粉末的吸湿初速度与吸湿平衡时间数据，见表4。按照表3的吸湿速度方程绘制出了吸湿速度变化曲线，见图1。

由表3，4中的数据可知，D2组的吸湿初速度最大，B2组的吸湿初速度最小，D2组的吸湿平衡时间最短，A1组的吸湿平衡时间最长。由表4中可知，吸湿加速度也不像文献[10]报导的维持在一个恒定的值，以A2组为例，由它的一元二次方程可知其吸湿加速度曲线呈“抛物线”型。即吸湿过程不是一个匀减速过程。由图1可知，同一组的喷干粉末吸湿速度变化情况也不一样。此处要说明的是，4组实验中均出现了吸湿速度变为负值的情况，作者推测这种情况基本排除实验误差的情况，原因可能是物料的吸湿性能由化学组成和物理性质共同决定，随着吸湿过程的进行，中药出现液化的情况，颗粒的物理结构渐渐消失，便会释放出一部分水分。由此可见不同喷雾干燥条件下，化学组成相同的喷雾干燥粉体的吸湿过程存在较大差异。中药喷干粉体的吸湿过程相对复杂，里面可能包含着很多相互影响的作用，其中的具体机制待进一步探究。

3.2 粉体微观形貌分析

按2.5项下方法，获取喷雾干燥粉末不同样品微粒的的扫描电镜图见图2。

温度下，均出现了较强程度的黏连，结合前面的含水量测定结果分析，认为过低的的进口温度与过高的进口温度均不利于喷雾干燥的进行，过低的进口温度导致含水量过高，而这诱导了粉末的黏性产生；过高的进口温度使粉末的含水量过低，不仅粉末吸湿活性更强，且粉末易于团聚也会加剧粉末的黏连。不同的进料密度下粉体的粒径出现了明显的差异，送料密度为1.01 g・mL-1，粉体的粒径在1～3 μm；而送料密度为1.05 g・mL-1，大部分粉体粒径都集中在6 μm左右。不同送料速度下的喷干粉体的形态与粒径未见明显差异。不同空气流速的粉体粒径也出现了明显差异，空气流速30 m3・h-1中大颗粒的数量明显多，粒径集中在4～10 μm；而空气流速50 m3・h-1粒径明显偏小，大部分集中在1～2 μm。另外实验也发现，除了120，180 ℃时粉末发生严重黏连之外，其他各组的粉末均呈现出了较优的球状，一般认为球形颗粒具有更好的粉体学性质，这也说明了骨痹颗粒的喷雾干燥温度控制在150 ℃左右较为适宜。

3.3 关于吸湿机制的若干分析

整个吸湿过程的主要影响因素有两大类：一类是制剂原料的物理特性，如制剂原料的孔隙率、含水量，粒径[11]、粒子的表面性质[12]等；另一类则是由制剂原料的化学特性，如化学基团所决定的制剂原料与水分子之间的吸引力。从本文的实验结果来看，喷雾干燥条件的不同，造成了粉体物理性质，如含水量、粒径等的差异，而这些差异也确实带来了粉体吸湿性能上的不同。

吸附理论[13]认为制剂原料吸湿的主要动力是水的扩散，环境中的水分子吸附于制剂原料表面，随着水分子浓度的增大，内外压差促使水分逐步向内部渗透。因而，中药的吸湿行为可以描述为水分子向内部扩散的一个过程，而此过程可以用FICK′s定理来描述[14]。dw/dt=-DA（dc/dx），式中，w为t时浸膏表面含水量，dw/dt为扩散速度，A为扩散面积，dc/dx为浓度梯度，dc代表表面的水分子浓度，dx表示扩散间距。“-”表示扩散方向为浓度梯度的反方向，即扩散物质由高浓度区向低浓度区扩散，D为扩散系数（其受多方面因素影响，如温度）。

由FICK′s定律可知，扩散面积、扩散系数、浓度梯度越大，水分的扩散速度越快，也就是吸湿性越强，反之则越弱。所以吸湿曲线的分析结果可以结合图2和FICK′s定理来得到合理的解释。

图2显示，由于温度较高，A2组粉末的含水量更低，其表面的活性基团具有更强的吸水活力。所以其在短时间内可以吸附大量的水，具有更高的吸湿初速度10.412 0 g・h-1。当表面吸附一定的水后，由于A2组粉末内部的含水量（2.66%）也很低，造成了内外大的浓度梯度，所以吸湿速度也较A1组更快（由图1中A图可以看出）。但随着内部水分的越来越多，内外水分子浓度梯度的减小，其吸湿速度也急剧减缓。而120 ℃粉末由于内外的含水量（6.79%）均要高，所以无论是外部的吸水速度还是水分向粉体内部扩散的速度都要慢，造成了总体吸湿过程的缓慢，吸湿平衡时间也更长为13.55 h。

图2中B2组的粉体粒径要比B1组明显大，可见相同质量的粉体，B1组的比表面积要比B2组大。由FICK′s定律可知，B1组的扩散初速度与扩散速度要比B2组快。所以B1达到吸湿平衡的时间也更短。这与表4和图1中B图的结果相符。在实验中发现随着实验过程的进行，粉体B1出现了部分液化的现象。其原因可能是随着吸水过程快速进行，诱导了粉体之间的黏性增大，导致粉体之间互相粘附，见图3。而此过程带来的影响是扩散表面积减小，扩散速度变慢。与此同时，也伴随着浓度差的影响，即随着水分扩散的进行，粉体内外的水分浓度差快速减小，进而导致扩散速度的进一步变慢。图2中D1、D2也可以通过上述原理来解释，在此不重复说明。

C1，C2图中粉体粒径未见明显差异，可见进样速度不同对粉体粒径的影响不大。由表2知，C1组粉体含水量为3.97%，C2组含水量为4.73%，可见含水量的差异也不大。由表2，3可发现，2组喷干粉末的吸湿拟合曲线很相似，每个时间点的吸湿率也相差较小。C1，C2 2组的上述结果再一次提示了粉体的粒径差异和含水量是影响粉体吸湿性的主要因素。

综上所述，根据实验结果，在本研究的实验体系中，可得较佳工艺条件为进口温度150 ℃，进料密度1.05 g・mL-1，进料速度20 mL・min-1，空气流速30 m3・h-1。在此综合条件下，得到的粉体具有较优的形态特征，并且具有较优的吸湿动力学过程，包括较小的吸湿速度，与较长的吸湿平衡时间。

4 结论

本文以骨痹颗粒水提液为模型体系考察了喷雾干燥条件对粉体的含水量与平衡吸湿量的影响。研究发现，喷雾干燥诸多工艺条件中，送料密度和空气流量对粉体的吸湿性影响较大，这对探索中药物料复杂体系喷雾干燥作用机制，指导实际生产具有参考意义。本研究所采用的研究方法与考察指标，亦可为评价中药物料改性条件提供借鉴。

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[14] 郑俊民.药用高分子材料学[M].北京：中国医药科技出版社，2000：156.

Research about effect of spray drying conditions on hygroscopicity of spray

dry powder of Gubi compound′s water extract and its mechanism

ZONG Jie1，2，SHAO Qi2，ZHANG Hong-qing2，PAN Yong-lan1，2，ZHU Hua-xu1，2*，GUO Li-wei1，2*

（1. College of Pharmacy，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；

2. Key Laboratory of Chinese Herbal Compound Separation，Nanjing 210023，China）

[Abstract] Objective： To investigate moisture content and hygroscopicity of spray dry powder of Gubi compound′s water extract obtained at different spray drying conditions and laying a foundation for spray drying process of chinese herbal compound preparation.Method： In the paper，on the basis of single-factor experiments，the author choose inlet temperature，liquid density，feed rate，air flow rate as investigated factors.Result： The experimental absorption rate-time curve and scanning electron microscopy results showed that under different spray drying conditions the spray-dried powders have different morphology and different adsorption process. Conclusion： At different spray-dried conditions，the morphology and water content of the powder is different，these differences lead to differences in the adsorption process，at the appropriate inlet temperature and feed rate with a higher sample density and lower air flow rate，in the experimental system the optimum conditions is inlet temperature of 150 ℃，feed density of 1.05 g・mL-1，feed rate of 20 mL・min-1，air flow rate of 30 m3・h-1.

第2篇

【摘要】

目的 观察放射对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)体外成骨潜能及体内骨髓造血干细胞(hematologic stem cells， HSCs)龛位的影响。方法 分离、培养正常及接受4Gy放射后不同时间点小鼠BMMSCs，用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)染色法和实时定量RTPCR检测成骨分化相关基因，鉴定BMMSCs体外成骨分化潜能的改变，并通过骨组织形态学和免疫组织化学的方法检测放射后小鼠体内成骨细胞及纺锤形的、表达神经钙黏附分子的成骨细胞(spindleshaped Ncadherinexpressing osteoblasts， SNOs)数量的变化。结果 全身照射(total body irradiation， TBI)后早期小鼠BMMSCs的成骨潜能增强，但随后迅速降低；TBI后28d小鼠骨髓中成骨细胞和SNOs的数量均显著减少。结论 4Gy放射损伤后远期小鼠BMMSCs的成骨潜能显著降低，体内HSCs龛位也明显缩小。

【关键词】 目的 观察放射对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)体外成骨潜能及体内骨髓造血干细胞(hematologic stem cells， HSCs)龛位的影响。方法 分离、培养正常及接受4Gy放射后不同时间点小鼠BMMSCs，用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)染色法和实时定量RTPCR检测成骨分化相关基因，鉴定BMMSCs体外成骨分化潜能的改变，并通过骨组织形态学和免疫组织化学的方法检测放射后小鼠体内成骨细胞及纺锤形的、表达神经钙黏附分子的成骨细胞(spindleshaped Ncad

ABSTRACT: Objective To investigate the effects of irradiation on the osteogenesis potential of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) and the niche of hematopoietic stem cells (HSCs) in vivo. Methods At the different time points after 4Gy irradiation， BMMSCs were isolated from male C57BL/6 mice and cultured. Their osteogenesis potentials in vitro were evaluated by alkaline phosphatase staining and osteogenesisrelated gene expression was examined by realtime RTPCR. Bone histomorphometric analysis and immunohistochemical staining of the spindleshaped Ncadherinexpressing osteoblasts (SNOs) were performed to detect the changes in HSCs niche in vivo. Results Significant impairment of osteogenic differentiation of BMMSCs up to 28 days after irradiation was observed preceded by transitory enhancement at the early time after irradiation. Meanwhile， the number of osteoblasts as well as SNOs in vivo decreased greatly. Conclusion Irradiation resulted in damage in osteogenesis potential of BMMSCs accompanied by noticeable shrinking of HSCs niche in vivo.

KEY WORDS: irradiation; bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs); osteogenesis potential; hematopoietic stem cells (HSCs) niche

骨髓是对放射较为敏感的组织器官，放射后造血系统的损伤不仅包括早期的急性骨髓造血功能抑制，还包括晚期残存的造血功能障碍。造血干细胞(hematopoietic stem cells， HSCs)凋亡、自我更新能力减低及HSCs池缩小以及HSCs衰老[13]被认为是放射后造血系统短期和长期损伤的主要原因。然而HSCs在体内的存在并不是孤立的，其生物学行为与功能受其所在微环境或龛位(niche)的调控。骨和骨髓在解剖上的毗邻使其在功能上也相互依赖，成为一个功能单位[4]，骨发育或骨重塑异常的突变小鼠同时也存在造血生成异常，提示成骨细胞和/或破骨细胞参与了骨髓HSCs微环境或龛位的形成和功能维持[57]。目前认为成骨细胞或其中的一个亚群，即纺锤形的、表达神经钙黏附分子的成骨细胞(spindleshaped Ncadherinexpressing osteoblasts， SNOs)作为HSCs龛位的骨龛(osteoblastic or endosteal niche)中的关键细胞成分，限定造血龛位的大小和/或活性[5，78]。虽然以往关于大剂量化疗和/或放疗对骨髓基质微环境的影响有一些报道，但有关放射对HSCs龛位的影响尚未见报道。本研究着眼于成骨细胞的祖细胞——BMMSCs在放射损伤后成骨潜能的变化来探讨放射损伤对HSCs龛位的影响，旨在进一步阐明放射损伤后长期造血功能损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及辐射损伤模型制备

5周龄雄性C57BL/6小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，实验动物随机分为正常对照组和全身照射组，后者经137Cs射线进行一次性全身照射4.0Gy，吸收剂量率为2.4Gy/min。每批动物分别在照射后的0、1、3、7、14、28d取材，所得到的BMMSCs分别命名为D0、D1、D3、D7、D14和D28。

1.2 主要试剂和仪器

Flk1抗体(美国Santa Cruz 公司)；CD34、CD45、CD31、GlyA、vWF、CD11a、CD11b抗体(晶美生物工程有限公司)；Realtime PCR试剂盒(德国QIAGEN公司)；Realtime PCR仪(ABI PRISM7500，美国Applied Biosystems公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(中国医学科学院血液病研究所科技公司)；兔多克隆抗NCadherin抗体(英国Abcam公司)；即用型过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(Zymed公司)；PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.3 小鼠BMMSCs的分离和培养

无菌状态下取雄性C57 BL/6小鼠股骨和胫骨，冲出骨髓，经4号针头反复冲洗，制成单细胞悬液。用FicollPaque(1.077g/mL)分离出骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells， BMMNCs)，用MACS CD45、GlyA和CD34磁珠去除造血细胞，以107个/mL密度接种在25cm2的培养瓶内。培养液成分为400mL/L MCDB、550mL/L DF12、40mL/L胎牛血清、100u/mL青霉素和1000u/mL链霉素，置于37℃、50mL/L CO2培养箱培养。24h后去掉悬浮细胞，细胞融合达70%时，用1.25g/L胰酶消化并以1∶2比例传代。这些细胞的免疫表型为CD34、CD45、CD31、vWF、GlyA、CD11a、CD11b阴性，Flk1阳性(资料未显示)。

1.4 成骨的定向诱导分化

以2×104/cm2的密度将小鼠BMMSCs接种于含有成骨诱导培养体系(100mL/L胎牛血清、1.0×10-8mol/L地塞米松、2.0×10-4mol/L抗坏血酸、7.0×10-3mol/L β磷酸甘油的IMDM培养液)的T25cm2培养瓶或35cm2的培养皿中，置于37℃ 50mL/L CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养，每天观察1次，每3d半量换液1次。

1.5 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)染色

正常及全身照射(total body irradiation， TBI)后1、3、7、14、28d的小鼠BMMSCs体外成骨诱导分化1周时倾出培养皿中的培养液，PBS洗细胞2次；加固定液2mL，室温固定1min，流水漂洗2min；加作用液2mL，置湿盒内于37℃孵育2h，流水冲洗2min；加染色液2mL，复染5min，流水冲洗2min；甘油封固，倒置显微镜下观察，胞质出现蓝紫色沉淀的为阳性细胞。

1.6 荧光实时定量RTPCR(real time RTPCR)

正常及照射后1、3、7、14、28d的小鼠BMMSCs体外分别成骨诱导1周或3周后，用Gibco公司的Trizol regeant提取其总RNA，参照说明书逆转录后的cDNA产物，以βactin为管家基因，应用嵌入荧光染料SYBR Green I进行荧光定量PCR扩增，检测成骨分化相关基因核心结合因子(corebinding factor 1， Cbfa1)、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen， ColⅠ)和骨钙蛋白(osteocalcin， OC)的表达变化。25μL扩增体系中含ROX 0.5μL，2×Premix 12.5μL，上游和下游引物各1μL，模板cDNA 1μL，DEPC水7μL。所用引物及退火温度见表1。表1 用于实时定量RTPCR的成骨分化相关基因引物序列（略）

1.7 骨组织标本的制备及苏木素

伊红染色(HE染色) 在放射后不同时间点处死模型和正常小鼠，取出股骨，剔除骨表面附着的软组织，按常规的方法制备5μm的脱钙石蜡切片，进行HE染色，并参照ZHANG等[8]的方法，计数每张切片中皮质骨和小梁骨表面成骨细胞数。

1.8 NCadherin阳性细胞的免疫组织化学检测

上述脱钙的石蜡包埋的骨组织切片常规脱蜡至水，按照试剂盒说明书，采用SP法进行NCadherin的免疫组织化学染色，微波煮沸抗原修复。兔多克隆抗NCadherin抗体的浓度为1∶200稀释。显色采用DAB法并经苏木素复染，参照ZHANG等[8]的方法，计数每张切片的SNOs。每次都做不加一抗的阴性对照片。

1.9 统计学分析

实验数据采用均数±标准差表示，应用SPSS12.0软件进行统计学处理，多个样本均数的比较采用方差分析，两两比较采用StudentNewmanKeuls法(SNK法)，以α＝0.05为显著性检验水准。

2 结果

2.1 放射损伤后小鼠BMMSCs成骨潜能的改变

接受4Gy放射后小鼠BMMSCs体外均能向成骨细胞分化，但其分化潜能却存在着较大差异。放射前后不同时间点BMMSCs在成骨诱导培养基中诱导1周后，细胞变大，扁平(图1)，进行ALP染色，发现ALP阳性细胞的数量在放射后第3天BMMSCs的成骨分化体系中明显增多，聚集成片，且着色较深(图1C)，而在放射后第7天BMMSCs的成骨分化体系中明显下降(图1D～图1F)，至放射后28d时仍未见明显恢复(图1F)。

2.2 放射损伤后小鼠BMMSCs成骨分化相关基因表达变化

成骨细胞分化过程伴随着一些成骨分化相关基因的表达。体外成骨诱导1周后，与成骨分化相关的Cbfa1、ColⅠ和OC在放射损伤后第3天BMMSCs中表达最高，第28天表达最低。在成骨体系中培养3周，TBI后3d BMMNCs Cbfa1的表达仍然最高，但ColⅠ和OC的表达最低；不同的是ColⅠ和OC的表达在TBI后28d达高峰，TBI后3d最低(图2)。提示虽然放射损伤后早期小鼠BMMSCs的成骨分化潜能明显增强，但最终其成骨分化的能力显著降低，在放射后28d未见恢复的倾向。

2.3 放射损伤后体内骨组织形态学和成骨细胞的改变

正常小鼠股骨近端干骺端骨小梁丰富，骨小梁排列以纵向为主，之间互相连接，形态结构完整(图3A、图3F)。而放射损伤后，股骨近端干骺端骨小梁排列逐渐稀疏，间隙增宽，形态结构性差，皮质骨变薄。部分骨小梁断裂及部分区域骨小梁消失出现于放射后第7天(图3C、图3H)，以第28天时表现最为显著(图3E、图3J)。

正常小鼠成骨细胞紧密地排列于骨小梁和皮质骨表面(图3A、图3F)，而放射后骨小梁和皮质骨表面成骨细胞逐渐减少直至消失(图3B～图3E、图3G～图3J)。计数正常和放射后第28天时每张HE染色切片的成骨细胞数量可见TBI后28d时小鼠体内成骨细胞的数量显著减少(图5A)。

2.4 放射损伤后HSCs龛位的改变

近来认为成骨细胞的一个亚群，即SNOs是HSCs龛位中骨龛的关键细胞成分[5，78]。正常小鼠骨髓中骨小梁表面含有较多的NCadherin+细胞，包括SNOs和NCadherin+、卵园形的成骨细胞(图4A)。而放射后28d，皮质骨及骨小梁表面成骨细胞数量显著减少(图3B～图3E、图3G～图3J)，仅在骨骺和皮质骨交界处骨小梁相对较丰富的地方可见到少量的SNOs(图4B)，其数量较正常减少近70%(图5B)。

3 讨 论

随着对BMMSCs生物学特性和HSCs龛位研究的深入，BMMSCs在造血功能的起始和维持中的作用逐渐被认识。BMMSCs能生成绝大多数的骨髓基质细胞，构建HSCs赖以生存的微环境[910]，并且它还是成骨细胞的来源，而后者则被认为是HSCs龛位中的关键细胞成分，参与对HSCs的调控[5，78]。已有研究证实BMMSCs不仅为一些疾病的治疗带来了新的希望[11]，其生物学特性的改变还参与了一些疾病的发生和发展[1213]。本研究发现放射损伤晚期BMMSCs成骨潜能明显降低，同时体内成骨细胞数量明显减少，HSCs龛位显著缩小。

体外诱导成骨分化1周时，放射损伤后晚期(28d)BMMSCs的成骨分化体系中ALP阳性细胞数量明显减少，其成骨分化相关基因的表达均显著低于正常。ColⅠ是成骨分化过程的早期标志之一，在钙质沉积将结束时表达降低，而OC在成骨分化的终末阶段即分化至骨细胞和骨衬细胞时则不表达。本实验显示体外诱导分化3周即成骨细胞分化以成熟基质矿化为特征时，TBI后28d BMMSCs成骨分化相关基因ColⅠ和OC高表达，提示分化的成骨细胞仍然处于一个早期的不成熟阶段，说明放射损伤后BMMSCs的成骨分化潜能明显减弱。而在放射后早期(3d)，BMMSCs的成骨潜能有明显增强，这可能是因为机体受到放射损伤后，BMMSCs通过成骨能力的增强来尽力维持体内骨髓微环境的稳定，但是这种代偿功能是有限的。

近年关于HSCs龛位的研究取得了突破进展。在一些特殊的转基因小鼠模型中，成骨细胞数量的增加或减少直接与HSCs数量增加或减少相关[5，78]，说明成骨细胞是HSCs龛位的重要组成部分，参与限定HSCs龛位的大小和/或活性。ZHANG等[8]证实HSCs通过同型的NCadherin分子和成骨细胞接触，进而提出了骨内膜表面的专职SNOs是HSCs龛位的必需成分。NCadherin同时表达于SNOs和HSCs，这种同型的NCadherin分子间的相互作用可能在HSCs锚定(anchor)于骨龛中起重要作用。βcatenin是HSCs自我更新的关键调控因子[14]，而在许多类型的细胞中，NCadherin和βcatenin构成了一个功能性的信号通路复合体，因而在HSCs龛位中，NCadherin介导的成骨细胞和HSCs的黏附可能通过βcatenin与WntLEF1Notch 1信号通路相连，维持HSCs的自我更新能力，防止其分化。本实验结果显示放射损伤后除了骨髓内骨组织形态学发生显著变化外，放射后第28天，成骨细胞也显著减少，而SNOs仅见于骨骺和皮质骨交界处骨小梁相对较丰富的地方，其数量也减少近70%，提示TBI后骨髓HSCs的骨龛也显著缩小。

HSCs和其龛位是一个功能整体，任何一方的改变均会导致造血系统功能损伤。虽然以往认为HSCs本身自我更新能力减低、HSCs池的缩小以及HSCs细胞衰老[14]是放射损伤后远期造血功能损伤的机制，然而本实验结果提示放射损伤后BMMSCs成骨潜能的改变及其所导致的HSCs龛位的显著缩小可能也是导致放射后远期造血功能障碍的潜在机制之一。

参考文献

[1]DOMEN J， GANDY KL， WEISSMAN IL. Systemic overexpression of BCL2 in the hematopoietic system protects transgenic mice from the consequences of lethal irradiation [J]. Blood， 1998， 91(7):22722282.

[2]MENG A， WANG Y， BROWN SA， et al. Ionizing radiation and busulfan inhibit murine bone marrow cell hematopoietic function via apoptosisdependent and independent mechanisms [J]. Exp Hematol， 2003， 31(12):13481356.

[3]WANG Y， SCHULTE BA， LARUE AC， et al. Total body irradiation selectively induces murine hematopoietic stem cell senescence [J]. Blood， 2006， 107(1):358366.

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[5]CALVI LM， ADAMS GB， WEIBRECHT KW， et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche [J]. Nature， 2003， 425(6960):841846.

[6]LOTINUN S， EVANS GL， TURNER RT， et al. Deletion of membranebound steel factor results in osteopenia in mice [J]. J Bone Miner Res， 2005， 20(4):644652.

[7]VISNJIC D， KALAJZIC Z， ROWE DW， et al. Hematopoiesis is severely altered in mice with an induced osteoblast deficiency [J]. Blood， 2004， 103(9):32583264.

[8]ZHANG J， NIU C， YE L， et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size [J]. Nature， 2003， 425(6960):836841.

[9]WANG X， HISHA H， TAKETANI S， et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from mouse fetal bone marrow [J]. Stem Cells， 2006， 24(3):482493.

[10]MUGURUMA Y， YAHATA T， MIYATAKE H， et al. Reconstitution of the functional human hematopoietic microenvironment derived from human mesenchymal stem cells in the murine bone marrow compartment [J]. Blood， 2006， 107(5):18781887.

[11]张银刚，郭雄，李天清，等. 髓核内注射骨髓间充质干细胞对椎间盘基质的影响 [J]. 西安交通大学学报(医学版)， 2007， 28(6):675679.

[12]FANG B， ZHENG C， LIAO L， et al. Identification of human chronic myelogenous leukemia progenitor cells with hemangioblastic characteristics [J]. Blood， 2005， 105(7):27332740.

第3篇

你可曾有过这样的减肥经历:无论当初的决心多么坚决,最终还是会屈服于美食的诱惑?据英国媒体报道,牛津大学和英国医学研究理事会的最新研究证实,一种与肥胖有关的基因能通过促进食欲使我们发胖。换言之,正是因为人体内携带这种“贪吃基因”,使得人们的节食努力往往以失败告终。

这种名为FTO的等位基因最早发现于2007年,它定位在人体第16号染色体上,有分别来自父母的各一个副本。调查显示,多达14%的英国人两个FTO基因副本均出现变异。跟没有变异副本的人相比,他们的肥胖风险增加了70%,罹患糖尿病的风险增加了50%。有49%的英国人携带一个FTO基因变异副本,他们患肥胖的可能性跟正常人相比要多30%,而患糖尿病的可能性则多了25%。科研人员认为,FTO是一种与肥胖有关的最普遍的基因。

据英国医学会研究理事罗杰・考克斯介绍,这一研究使人们重新认识到,仅仅锻炼或节食来对付肥胖并不奏效。科研人员目前正致力于研究如何通过药物或者其它方法“关闭”这种基因,从而在根本上解决减肥反弹问题。

手机影响心理健康

“喂,喂,你说什么?信号不好,听不见!”类似的场景无论在电视上还是生活中都很常见。研究发现,手机对现代人的影响超过钱包,手机丢了,大多数人不到一小时就会发现,而钱包丢了,可能一两天才会发现。日前,某杂志撰文指出,手机不仅拿在手里,也可能“长”在心里,对心理健康造成不良影响。不少人老是听到手机在响,掏出手机看,却并没有来电或短信。这是一种“手机幻听症”,在高级白领、媒体人员以及销售业务人员中很常见。长时间的幻听,会使人过度紧张,产生烦躁、焦虑等情绪。因此,症状较轻者,不妨养成睡觉前关机的习惯,用健康的方式使用手机,更好地缓解压力。情况严重者,则应该考虑去寻求心理医生的帮助。

早睡早起 有助成功戒烟

美国一项最新研究表明,“夜猫子”(喜欢熬夜的人)比“百灵鸟”(喜欢早起的人)更容易吸烟上瘾,而且戒烟难度更大。

研究人员对23000多对双胞胎进行了长达30年的跟踪调查。结果发现,“夜猫子”成为瘾君子的可能性比“百灵鸟”更大,吸烟上瘾后戒烟成功率更低,而且更容易产生尼古丁依赖症。

研究人员表示,一种可能是,由于尼古丁会让吸烟者在夜晚保持清醒状态,因此“夜猫子”更可能用吸烟来提神。另一种可能是,“夜猫子”更可能去酒吧和餐馆等吸烟环境,这也增加了他们吸烟上瘾和戒烟难的可能性。另外,“夜猫子”寻求上瘾行为的可能性更大,理由是其大脑中的多巴胺和类鸦片物质发挥着重要作用。因此,“夜猫子”要想彻底戒烟,最好改变“睡眠模式”,严格早睡早起,这必然会大大提高戒烟成功率。

电脑族常吃黄花菜可预防电脑脸

心理学专家研究发现,经常与电脑打交道的人,由于长时间面对没有生命的电脑屏幕,而与人的交流越来越少,会在不知不觉中生出一张表情淡漠、冷峻的“电脑脸”。

国外儿科医生新近发现,人的笑容与铁质有关联。研究资料显示,凡是面带微笑、眼球灵活、目光炯炯有神的婴儿,其体内的铁贮存多数正常;相反,面孔严肃、呆板,或1小时内仅发笑1～2次的宝宝,血中铁含量可能不足。因此,要把缺少笑容作为体内缺铁的一个早期警报。

人们都知道菠菜富含铁,其实,黄花菜中所含的铁是菠菜的几十倍。古人曾给黄花菜(金针菜)起名叫忘忧、疗愁,这足以说明黄花菜的功效。在我国的徐州,有道传统名菜“软炸黄花菜”,用黄花菜做主料,因外以鸡蛋糊裹炸,食之软嫩而得名,最适合“电脑族”们吃。

秋天出生的孩子更易食物过敏

英国《流行病和公共卫生杂志》刊登的一项最新研究显示,秋天出生的孩子发生食物过敏危险更大。

芬兰奥卢大学研究人员调查了2001年4月至2006年3月出生于芬兰东南部的近6000名儿童。研究发现,在母亲子宫内11周时正值4~5月份的孩子中,食物过敏几率为11%。而母亲怀孕11周时候正好是12月或1月的孩子中,食物过敏发病率只有6%。

研究人员对研究期间花粉水平进行分析发现,4~5月份正是桦树和赤杨花粉的高峰期。早期研究已发现,孕期接触花粉会增加孩子食物过敏危险。研究人员发现, 4~5月份母亲妊娠11周的时候接触花粉最多,孩子发生牛奶和鸡蛋过敏的危险,比母亲妊娠11周时为12月到1月的孩子高3倍。

减慢呼吸有助缓解疼痛

美国一项最新研究发现,减慢呼吸可以在一定程度上帮助人们缓解疼痛感。研究人员分别选取了两组年龄在45岁至65岁之间的女性进行研究,其中一组为受到慢性疼痛困扰的纤维肌痛综合征患者,另一组为健康女性作为对照。

实验过程中,这些女性在呼吸正常和呼吸速度减半状态下,其手掌分别受到适度的热脉冲的冲击。每一次热脉冲之后,研究人员都会记录下她们报告的掌部疼痛感程度以及情绪的变化等参数。结果发现,对于健康女性来说,当减慢呼吸时,她们感觉到的疼痛程度也随之降低。而对于患病一组的女性来说,整体上的作用不很明显,但那些情绪相对乐观的患者,也能借助减慢呼吸缓解其疼痛感。

研究人员说,这一研究结果可以帮助解释为何瑜珈等一些活动通过调整呼吸来放松身心,提升情绪。

烤肉酱汁能减少致癌物质

肉类在烤、煎、炸等高温烹调时,会产生一种叫做杂环胺的物质。这种物质在体内蓄积,可能诱发胃癌、肠癌等多种癌症。

美国堪萨斯州立大学的研究人员将鲜牛肉和用调料腌过的牛肉烧烤后,对比二者的杂环胺含量。发现腌过的肉高温烧烤后,所含杂环胺比未经腌制的低40%以上。经过对多种调料的测试发现,用孜然、咖喱、迷迭香腌过的肉,高温烹调后产生的致癌物最少。这是因为,烤肉酱中所含的淀粉、糖分等成分在受热的时候首先吸收热量,可以保护中间的肉块不会骤然受到高温,从而减少了致癌物质产生的机会。另外,烤肉酱中含有的一些有益成分,也是阻碍致癌物质产生的原因。这些食品配料本身均有一定的抗癌防癌作用,也有益于预防高温加热食物对人体的危害。

因此,建议在烧烤、煎炸肉类前,放些调料腌半小时,不仅味道好,还可减少致癌物产生。

“边吃边K”有伤胃健康