化学灭活方法范文

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第1篇

[关键词] 病毒灭活血浆；新鲜冰冻血浆；血浆置换；效果

[中图分类号] R457.1+4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）05（b）-0062-02

亚甲蓝光化学（MB）法灭活血浆中的病毒是一种最安全、有效的适合于临床用单袋血浆病毒灭活的方法，其灭活效果已被大量实验证实[1-2]，输注病毒灭活血浆成为当前国内外预防输注血浆制品传播传染病的有效措施，MB法病毒灭活血浆技术，已被推广应用于全国部分血站。对于MB法病毒灭活血浆后，对于血浆内有效成分的影响国内各家血站报道不一，但是都一致显示MB法病毒灭活后的血浆有效成分有所改变[3-4]。但是这些或多或少的改变是否影响临床应用效果，尤其是在血浆置换中大量应用血浆时是否有影响，国内目前尚无报道。笔者对此情况进行了研究，具体如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

2012年1～6月随机采用库存新鲜冰冻血浆。无偿献血者的血液（400 mL/袋），于采集后6 h内分离制备的新鲜血浆（5000 g/min，10 min，4℃），按照操作规程制备成新鲜冰冻血浆（200 mL/袋）。在净化间将血浆与一次性病毒灭活输血过滤器相连。向血浆中加入亚甲蓝，混匀后使亚甲蓝的浓度为1 μg/mL，并在31800LX强度的光照下4℃摇动照射30 min，然后把经光照后的血浆通过一次性血浆灭活血袋的滤器滤除亚甲蓝，制备成病毒灭活血浆。

同期选择在洛阳市所进行的血浆置换患者26例，其中重症肝病患者19例，有机磷农药中毒7例，患者年龄在15～50岁，中位年龄31岁，其中，男性17例，女性9例，以上病例在血浆置换中12例置换液采用新鲜冰冻血浆，采用病毒灭活血浆14例。

1.2 方法

光照病毒灭活：（1）采用中保康医疗器具有限公司生产的ZBK-YBM-01型医用血桨病毒灭活柜，操作按说明书；（2）采用上海输血技术有限公司生产的HDME-1医用血浆病毒灭活柜，操作按说明书。

血浆置换法：采用美国血液技术公司生产的MCS+型血细胞分离机，选择血浆置换程序及TPE规程卡、980E耗材，置换液采用新鲜冰冻血浆或病毒灭活血浆。

主要仪器：SORVAL 3BP离心机（美国Thermo 公司），ZBK-YBM-01型医用血浆病毒灭活柜及耗材（淄博中保康医疗器具有限公司），MCS+型血细胞分离机及耗材（美国血液技术公司生产），奥林巴斯全自动生化分析仪。

1.3 观察指标

血浆凝血因子活性侧定：应用国际通用的一期法检测血浆。血浆清蛋白测定： 用双缩脉法检测血浆总蛋白。

1.4 统计分析

应用SPSS 12.0分析软件，分析应用新鲜冰冻血浆和病毒灭活血浆血浆置换两组间的凝血时间、血浆蛋白比较采用t检验。

2 结果

2.1 不同血浆置换前后患者凝血因子比较

应用新鲜冰冻血浆、病毒灭活血浆进行血浆置换治疗后，凝血因子结果见表1。结果显示应用病毒灭活血浆组治疗后患者PT、APTT与治疗前比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 不同血浆置换前后患者血浆蛋白比较

应用新鲜冰冻血浆、病毒灭活血浆血浆置换治疗后，血浆蛋白结果表2。结果显示两组治疗前后清蛋白检测差异无统计学意（P > 0.05）。

3 讨论

血浆是可发生经输血传播疾病的主要血液成分之一，近几年的用量持续增加，因此在保证血浆临床输用安全的同时，提高血浆质量和应用效果是非常重要的。病毒灭活作为一种降低输血风险的新技术，除应能有效地灭活血液成分中可能存在的病毒外，更重要的是对血液成分的功能应无显著性影响，保证血液成分的足够疗效。MB光化学法是近年发展起来的新技术[5-6]。光化学法灭活病毒的机制主要是依靠光敏剂在光照射下，产生自由基（一类机制）或单线态氧（二类机制）氧化损伤病毒的分子结构，从而杀灭病毒，由于目前全国各地血站供临床使用的血浆均为单人份血浆，其可能内含的脂质包膜病毒，对人体健康有危害，为了克服此危害，必须对脂质包膜病毒灭活。大量实验数据证明，用亚甲蓝光化学处理血浆可完全灭活血浆内所含的VSV和Sindbis病毒（这2种病毒是国内外公认的血液制品病毒灭活有效性的指示病毒，其中VSV是HIV的模型病毒，Sindbis是HCV的模型病毒，均为RNA脂质包膜病毒），病毒滴度明显下降。同时保证血浆主要凝血因子（Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ）的回收率>80%，白、球蛋白的回收率>90%。血浆蛋白的免疫原性无变化，总蛋白损失轻微[7]。

血浆置换因患者病情需几乎置换出患者体内原有血浆，本研究旨在研究大量应用病毒灭活冰冻血浆后患者体内的凝血状态以及血清蛋白的变化。研究结果表明，大量的新鲜冰冻血浆应用后患者体内的凝血状态以及血清蛋白均无明显变化，但是病毒灭活冰冻血浆应用后，患者体内凝PT、APTT均有所延长，但是延长均在正常范围内，说明病毒灭活冰冻血浆应用量较大时可以影响患者体内凝血。凝血因子绝大多数在肝脏合成，肝实质损伤可导致凝血因子的合成减少，表现为凝血酶原（PT）延长，患者有出血倾向。因此肝病患者在血浆置换过程中，推荐使用新鲜冰冻血浆（FFP）做置换液，临床效果更佳。笔者在多例临床血浆置换术应用当中，根据不同患者、不同病情使用不同血浆（新鲜冰冻血浆、病毒灭活血浆），均获得良好疗效。

有研究表明虽然过滤前后FⅧ和FⅨ因子活性几乎无改变，但是对因子影响最大的是灭活过程[8]。经过MB光化学法对血浆进行病毒灭活处理后，血浆中的FⅨ因子灭活前后变化不大，FⅧ因子水平下降，但活性水平仍大于75%，仍在国家质量标准允许范围内，虽然对因子有一定的损伤作用，但结合其灭活性能，MB光化学病毒灭活工艺对单人份血浆的病毒灭活还是一种比较有效的方法，其对临床输血安全性具有重要意义。临床在应用病毒灭活血浆时，可以适当增加用量，保证治疗效果，如将原来10～15 mL/kg的应用剂量增加25%用量，提高至13～19 mL/kg[2]。

要从根本上控制和杜绝血源性的传染病，除加强筛查以外，还必须对血液进行灭活病毒处理，才能达到输血安全的目的。血液成分的病毒灭活是实现安全输血的唯一途径。尤其在进行血浆置换术中，大量应用血浆制品时，病毒灭活血浆安全性仍较高。

[参考文献]

[1] 王文逸. 利用鸭乙型肝炎病毒感染模型评价血液成分中病毒的灭活效果[J]. 微生物与感染，2006，1（2）：21-24.

[2] 李燕. 维生素C对病毒灭活中血浆蛋白活性的保护效应[J]. 中国实验血液学杂志，2006，14（2）：394-396.

[3] 王飞. 亚甲蓝光化学法血浆病毒灭活前后血浆成分的变化[J]. 临床学与检验，2010，4（12）：97-99.

[4] 陈志，陈江，逯心敏，等. 重型肝炎患者血浆置换治疗前后凝血功能变化的研究[J]. 国际检验医学杂志，2011，9（22）：88-89.

[5] 袁翠云，张长青，任继秀. 血浆置换加血液滤过治疗慢性重型肝炎疗效观察[J]. 医药论坛杂志，2011，9（9）：165-168.

[6] 周福元，杨淑玲，陈金军，等. 血浆置换治疗肝功能衰竭临床研究[J].临床合理用药杂志，2011，14（11）：289-291.

[7] 潘志敏，刘光俊，王兴，等. 胸腺肽α1配合血浆置换治疗慢性乙型重型肝炎的效果观察[J]. 实用肝脏病杂志，2011，4（10）：18-20.

第2篇

【关键词】病毒灭活冰冻血浆;凝血因子;因子活性;血浆蛋白

The discussion of virus inactivated frozen plasma and fresh frozen plasma part of effective ingredients of quality changesPAN Guoxiong,XIE Zhongxing,LI Shuying.Clinical Laboratory,Guangdong Zhaoqing second Poeple’s Hospital,Zhaoqing 526060,China

【Abstract】ObjectiveTo explore virus inactivated frozen plasma and fresh frozen plasma part of effective ingredients of quality changes MethodsTo gather 50 bags fresh plasma, A and B is divided into two groups, detected PT，TT，APTT，Fg，TP,ALB,FⅧ,FⅤ respectivelyResultsThe content of TP, FⅧ, FⅤ and Fg in virus inactivated frozen plasma with a certain degree of reduced, but mostly within 30%, in the acceptable rangeConclusionThe MB virus inactivated plasma did not influence the clinical application, it did More good than harm .

【Key words】Virus inactivated frozen plasma;Clotting factor;Factor activity；Plasma protein

新鲜冰冻血浆内含有各种凝血因子及各种血浆蛋白，由于血浆及其制品的病毒检测方法有一定的局限性及病毒“窗

作者单位：526060广东省肇庆市第二人民医院检验科

口期”的存在，新鲜冰冻血浆和全血一样，具有传播艾滋病、乙型肝炎等输血传播疾病的危险［1］，因此输血的危险性依然存在。为使广大患者能更安全有效地使用血浆，我巿血站对

血浆开展了亚甲蓝(MB)光化学法病毒灭活项目。MB光化学法病毒灭活技术应用于血浆病毒的灭活，其有效性和安全性已被证实，但MB光化学法病毒灭活的过程对新鲜血浆中的凝血因子及血浆蛋白等有效成分的质量会产生怎样的变化，仍有待确认。为此我们通过实验检测血浆中的部分有效成份的变化并作一分析探讨。

1材料与方法

11样本来源随机抽取50份常规血液，按照标准操作规程制备新鲜血浆。每人份一分为二，分两组，A组为不灭活病毒新鲜血浆，立即进行检测。另一组为B组，进行MB光化学法病毒灭活后的新鲜冰冻血浆从采集到制备完毕6 h内进行检测。

12材料一次性无菌试管，德国BE1500自动血凝分析仪，CL800生化分析仪。严格按照仪器与试剂操作说明的要求进行检测。

13资料①PT (凝血酶原时间)用于外源性凝血因子(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅰ)凝血功能的筛查。②APTT(活性部分凝血酶原时间)用于检测内源性凝血因子(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ)凝血功能。③TT(凝血酶时间)，快速评定止血和血栓形成的有效方法。④Fg(纤维蛋白原)。检测PT，TT，APTT，Fg能间接反映血浆中的因子活性水平。

血浆蛋白的测定；①TP(总蛋白)。②ALB(白蛋白)

14方法A组为新鲜冰冻血浆，不灭活直接进行测定，B组为灭活冰冻血浆，先对其进行MB(亚甲蓝)光化学病毒灭活后再测定。在血浆进行病毒灭活后进行热封口时留样检验。

15统计学方法应用SPSS 160作t检验分析。

2结果

21两种血浆实验测定结果(见表1)。

表1两种血浆各指标均值的实验检测结果

名称

(单位)允许正

常范围新鲜冰

冻血浆MB病毒

灭活血浆PT(s)9～14313201520TT(s)8～1513401660APTT(s)21～44538815212Fg(g/L)2～4260151TP(g/L)60～8070026360ALB(g/L)35～5044224011FⅤ(%)70～15098406890FⅧ(%)70～15010820778022各项指标的统计结果比较(见表2，3)。

表2MB灭活血浆各项指标与正常范围比较的可信区间

第3篇

作者：胡嘉淼 单位：暨南大学生物工程学系

菌株前处理将活化的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养至对数生长期，离心收集菌体(4000r/min，10min)，弃上清，悬浮菌体于PBS，使得OD600=0．05(108CFU/ml左右)。不同浓度的亚甲基蓝对PBS和牛奶中大肠杆菌的灭活作用的测定将备制好的含大肠杆菌的菌悬液10μl和含1%脱脂奶粉的牛奶190μl加入96孔板中，每孔共200μl，并在各孔中加入MB，使其终浓度分别为0．5×10－2、0．5×10－1、0．2、0．5、1.0、2.0、5.0和10.0μg/ml，37℃避光孵育30min，放在距离溴钨灯光源20cm处(测得光强度为160mw)照射10min后进行平板计数(L+S+)。同时设置不光照和/或不加MB组作为对照(L-S-;L+S-;L-S+)。不同光照时间对PBS和牛奶中大肠杆菌的灭活作用的测定按照“1．2”方法处理大肠杆菌后，在96孔板中加入10μl菌悬液和190μl含1%脱脂奶粉的牛奶，并在各孔中加入MB，使其终浓度为2μg/ml，37℃避光孵育30min后在距离溴钨灯光源20cm处照射1、5、10、15、20和30min后进行平板计数(L+S+)。同时设置不光照和/或不加MB组作为对照(L-S-;L+S-;L-S+)。不同牛奶浓度对亚甲基蓝/光化学法灭活大肠杆菌效率的影响将含1.0%、2．5%、5.0%和10.0%脱脂奶粉的菌悬液加入96孔板中，每孔200μl(190μl牛奶+10μl菌悬液)，并在各孔中加入MB，使其终浓度分别为1、2、5和10μg/ml，37℃避光孵育30min，放在距离溴钨灯光源20cm处照射10min后进行平板计数(L+S+)。同时设置加MB但不光照的空白组作为对照(L-S+)。细菌菌落平板计数将上述不同处理方式所得的菌悬液均以1∶10梯度稀释后涂板于细菌计数培养基平板上，于37℃生化培养箱中恒温培养，24h后取出进行菌落计数。试验重复3次，取平均值。数据处理结果以均数(x珋)±标准差(s)表示，用GraphPadPrism5所带的统计软件进行统计学处理。差异显著性采用t检验，P＜0．05为显著差异。

亚甲基蓝/光化学法处理前后细菌形态对照相较于未添加光敏剂、未光照的空白对照组(图1－A)，经过2μg/ml的亚甲基蓝，10min的溴钨灯光源照射处理后的牛奶中的大肠杆菌(图1－B)置于37℃生化培养箱中培养24h后，可以看到试验组中菌落很小，透明，呈灰色，边缘整齐，呈滴露状;而空白对照组则菌落较大，菌落不透明，呈乳白色。不同浓度亚甲基蓝对亚甲基蓝/光化学法灭活PBS和牛奶中大肠杆菌效果的影响由图2和图3可知，随着光敏剂MB浓度的增加，亚甲基蓝/光化学法对大肠杆菌的杀伤作用逐渐增强。当MB浓度低至0．5×10－2μg/ml，光照10min即可使PBS中约80%的大肠杆菌失活;当MB浓度达到0．2μg/ml时，几乎可完全使PBS中的大肠杆菌灭活。而在同样光照时间下，要致死牛奶中70%的大肠杆菌，则需MB浓度为0．5×10－1μg/ml;而当MB浓度为5.0μg/ml时，则可使牛奶中大肠杆菌菌落总数降低7个数量级。同时对照组则未显示出明显的杀伤作用。由此可见，亚甲基蓝/光化学法对PBS和牛奶中的大肠杆菌有较好的杀伤作用。2．3不同光照时间对亚甲基蓝/光化学法灭活PBS和牛奶中大肠杆菌效果的影响由图4和图5可知，当MB浓度在2.0μg/ml时，光照时间在一定范围内的延长对大肠杆菌细菌灭活作用的有一定程度的提高。当MB在一定浓度下，光照时间≥10min情况下，亚甲基蓝/光化学法能使PBS中的大肠杆菌菌落总数显著降低6个数量级以上，即杀伤99.999%的大肠杆菌;而在同样的光照时间下，牛奶中大肠杆菌的灭活效果比PBS中的灭活效果稍显逊色，仍能降低4个数量级以上，灭活率达到99．99%，而光照延长至15min以上时，牛奶中大肠杆菌的灭活效果则可同样达到6个数量级2．4不同牛奶浓度对亚甲基蓝/光化学法灭活模拟体系中大肠杆菌效果的影响由图6可知，随着牛奶浓度的升高，亚甲基蓝/光化学法对大肠杆菌的灭活效果逐渐减弱，当经过MB浓度为5μg/ml的光化学法处理10min后，1%牛奶含量的模拟体系中的大肠杆菌降低7．5个数量级，而10%的体系仅降低2个数量级，这可能是由于溶液光通透性的降低影响了亚甲基蓝/光化学法的灭菌效果。

通过试验可知亚甲基蓝/光化学法作为一种新型灭菌技术对模拟受感染牛奶中的大肠杆菌有明显的杀伤作用，当亚甲基蓝浓度为2.0μg/ml，接受光功密度为200mW/cm2的溴钨灯光照10min能杀死99%以上的大肠杆菌，而对照组未见明显的杀伤作用。并且笔者观察到经过亚甲基蓝/光化学法处理过的大肠杆菌在固体培养基上生长形态也发生了明显的改变，说明亚甲基蓝/光化学法处理可以有效地影响大肠杆菌的正常生长。同时，还发现亚甲基蓝/光化学法对模拟受感染牛奶中大肠杆菌的灭活效果略低于PBS对照组中的大肠杆菌，这可能是与牛奶相比，PBS的光通透性有所降低有直接的关系。这一猜想在后续试验中得到证实:随着牛奶浓度的增高，即溶液的光通透性的不断降低，体系中大肠杆菌的灭活效果随之下降，与前人运用亚甲基蓝/光化学法灭活血浆中病毒［8］，由于全血中红细胞等固体成分较多，导致灭活病毒有所降低的试验结果及推论相符。此外还发现，通过适当延长光照时间，或适量增加光敏剂浓度，仍然可以快速高效地灭活牛奶中的大肠杆菌。该次试验结果表明，亚甲基蓝/光化学法对牛奶等液体中的大肠杆菌的灭活效果显著。目前工业上常使用巴氏杀菌、超高温瞬时灭菌等热力杀菌方法来保障牛奶的质量安全，这些热力杀菌方式虽然能保证牛奶在微生物方面的安全，但能量消耗较大，对牛奶的品质破坏也较大，易造成热敏性营养成分损失、挥发性物质散失、风味变化、水分流失等，并且对于多种致病微生物所产生的致病毒素等危害产物无法有效去除。而由于光敏剂具有选择性地聚集在有害微生物及其生物膜的特性，能够有效灭活牛奶中的有害微生物［11］，因此PDT相对于传统的杀菌方法，将是一种值得开发的，安全、简便、高效，非常有前景的新型非热灭菌方法，具备良好的应用前景。