化学灭活方法范文

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第1篇

[关键词] 病毒灭活血浆；新鲜冰冻血浆；血浆置换；效果

[中图分类号] R457.1+4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）05（b）-0062-02

亚甲蓝光化学（MB）法灭活血浆中的病毒是一种最安全、有效的适合于临床用单袋血浆病毒灭活的方法，其灭活效果已被大量实验证实[1-2]，输注病毒灭活血浆成为当前国内外预防输注血浆制品传播传染病的有效措施，MB法病毒灭活血浆技术，已被推广应用于全国部分血站。对于MB法病毒灭活血浆后，对于血浆内有效成分的影响国内各家血站报道不一，但是都一致显示MB法病毒灭活后的血浆有效成分有所改变[3-4]。但是这些或多或少的改变是否影响临床应用效果，尤其是在血浆置换中大量应用血浆时是否有影响，国内目前尚无报道。笔者对此情况进行了研究，具体如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

2012年1～6月随机采用库存新鲜冰冻血浆。无偿献血者的血液（400 mL/袋），于采集后6 h内分离制备的新鲜血浆（5000 g/min，10 min，4℃），按照操作规程制备成新鲜冰冻血浆（200 mL/袋）。在净化间将血浆与一次性病毒灭活输血过滤器相连。向血浆中加入亚甲蓝，混匀后使亚甲蓝的浓度为1 μg/mL，并在31800LX强度的光照下4℃摇动照射30 min，然后把经光照后的血浆通过一次性血浆灭活血袋的滤器滤除亚甲蓝，制备成病毒灭活血浆。

同期选择在洛阳市所进行的血浆置换患者26例，其中重症肝病患者19例，有机磷农药中毒7例，患者年龄在15～50岁，中位年龄31岁，其中，男性17例，女性9例，以上病例在血浆置换中12例置换液采用新鲜冰冻血浆，采用病毒灭活血浆14例。

1.2 方法

光照病毒灭活：（1）采用中保康医疗器具有限公司生产的ZBK-YBM-01型医用血桨病毒灭活柜，操作按说明书；（2）采用上海输血技术有限公司生产的HDME-1医用血浆病毒灭活柜，操作按说明书。

血浆置换法：采用美国血液技术公司生产的MCS+型血细胞分离机，选择血浆置换程序及TPE规程卡、980E耗材，置换液采用新鲜冰冻血浆或病毒灭活血浆。

主要仪器：SORVAL 3BP离心机（美国Thermo 公司），ZBK-YBM-01型医用血浆病毒灭活柜及耗材（淄博中保康医疗器具有限公司），MCS+型血细胞分离机及耗材（美国血液技术公司生产），奥林巴斯全自动生化分析仪。

1.3 观察指标

血浆凝血因子活性侧定：应用国际通用的一期法检测血浆。血浆清蛋白测定： 用双缩脉法检测血浆总蛋白。

1.4 统计分析

应用SPSS 12.0分析软件，分析应用新鲜冰冻血浆和病毒灭活血浆血浆置换两组间的凝血时间、血浆蛋白比较采用t检验。

2 结果

2.1 不同血浆置换前后患者凝血因子比较

应用新鲜冰冻血浆、病毒灭活血浆进行血浆置换治疗后，凝血因子结果见表1。结果显示应用病毒灭活血浆组治疗后患者PT、APTT与治疗前比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 不同血浆置换前后患者血浆蛋白比较

应用新鲜冰冻血浆、病毒灭活血浆血浆置换治疗后，血浆蛋白结果表2。结果显示两组治疗前后清蛋白检测差异无统计学意（P > 0.05）。

3 讨论

血浆是可发生经输血传播疾病的主要血液成分之一，近几年的用量持续增加，因此在保证血浆临床输用安全的同时，提高血浆质量和应用效果是非常重要的。病毒灭活作为一种降低输血风险的新技术，除应能有效地灭活血液成分中可能存在的病毒外，更重要的是对血液成分的功能应无显著性影响，保证血液成分的足够疗效。MB光化学法是近年发展起来的新技术[5-6]。光化学法灭活病毒的机制主要是依靠光敏剂在光照射下，产生自由基（一类机制）或单线态氧（二类机制）氧化损伤病毒的分子结构，从而杀灭病毒，由于目前全国各地血站供临床使用的血浆均为单人份血浆，其可能内含的脂质包膜病毒，对人体健康有危害，为了克服此危害，必须对脂质包膜病毒灭活。大量实验数据证明，用亚甲蓝光化学处理血浆可完全灭活血浆内所含的VSV和Sindbis病毒（这2种病毒是国内外公认的血液制品病毒灭活有效性的指示病毒，其中VSV是HIV的模型病毒，Sindbis是HCV的模型病毒，均为RNA脂质包膜病毒），病毒滴度明显下降。同时保证血浆主要凝血因子（Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ）的回收率>80%，白、球蛋白的回收率>90%。血浆蛋白的免疫原性无变化，总蛋白损失轻微[7]。

血浆置换因患者病情需几乎置换出患者体内原有血浆，本研究旨在研究大量应用病毒灭活冰冻血浆后患者体内的凝血状态以及血清蛋白的变化。研究结果表明，大量的新鲜冰冻血浆应用后患者体内的凝血状态以及血清蛋白均无明显变化，但是病毒灭活冰冻血浆应用后，患者体内凝PT、APTT均有所延长，但是延长均在正常范围内，说明病毒灭活冰冻血浆应用量较大时可以影响患者体内凝血。凝血因子绝大多数在肝脏合成，肝实质损伤可导致凝血因子的合成减少，表现为凝血酶原（PT）延长，患者有出血倾向。因此肝病患者在血浆置换过程中，推荐使用新鲜冰冻血浆（FFP）做置换液，临床效果更佳。笔者在多例临床血浆置换术应用当中，根据不同患者、不同病情使用不同血浆（新鲜冰冻血浆、病毒灭活血浆），均获得良好疗效。

有研究表明虽然过滤前后FⅧ和FⅨ因子活性几乎无改变，但是对因子影响最大的是灭活过程[8]。经过MB光化学法对血浆进行病毒灭活处理后，血浆中的FⅨ因子灭活前后变化不大，FⅧ因子水平下降，但活性水平仍大于75%，仍在国家质量标准允许范围内，虽然对因子有一定的损伤作用，但结合其灭活性能，MB光化学病毒灭活工艺对单人份血浆的病毒灭活还是一种比较有效的方法，其对临床输血安全性具有重要意义。临床在应用病毒灭活血浆时，可以适当增加用量，保证治疗效果，如将原来10～15 mL/kg的应用剂量增加25%用量，提高至13～19 mL/kg[2]。

要从根本上控制和杜绝血源性的传染病，除加强筛查以外，还必须对血液进行灭活病毒处理，才能达到输血安全的目的。血液成分的病毒灭活是实现安全输血的唯一途径。尤其在进行血浆置换术中，大量应用血浆制品时，病毒灭活血浆安全性仍较高。

[参考文献]

[1] 王文逸. 利用鸭乙型肝炎病毒感染模型评价血液成分中病毒的灭活效果[J]. 微生物与感染，2006，1（2）：21-24.

[2] 李燕. 维生素C对病毒灭活中血浆蛋白活性的保护效应[J]. 中国实验血液学杂志，2006，14（2）：394-396.

[3] 王飞. 亚甲蓝光化学法血浆病毒灭活前后血浆成分的变化[J]. 临床学与检验，2010，4（12）：97-99.

[4] 陈志，陈江，逯心敏，等. 重型肝炎患者血浆置换治疗前后凝血功能变化的研究[J]. 国际检验医学杂志，2011，9（22）：88-89.

[5] 袁翠云，张长青，任继秀. 血浆置换加血液滤过治疗慢性重型肝炎疗效观察[J]. 医药论坛杂志，2011，9（9）：165-168.

[6] 周福元，杨淑玲，陈金军，等. 血浆置换治疗肝功能衰竭临床研究[J].临床合理用药杂志，2011，14（11）：289-291.

[7] 潘志敏，刘光俊，王兴，等. 胸腺肽α1配合血浆置换治疗慢性乙型重型肝炎的效果观察[J]. 实用肝脏病杂志，2011，4（10）：18-20.

第2篇

【关键词】病毒灭活冰冻血浆;凝血因子;因子活性;血浆蛋白

The discussion of virus inactivated frozen plasma and fresh frozen plasma part of effective ingredients of quality changesPAN Guoxiong,XIE Zhongxing,LI Shuying.Clinical Laboratory,Guangdong Zhaoqing second Poeple’s Hospital,Zhaoqing 526060,China

【Abstract】ObjectiveTo explore virus inactivated frozen plasma and fresh frozen plasma part of effective ingredients of quality changes MethodsTo gather 50 bags fresh plasma, A and B is divided into two groups, detected PT，TT，APTT，Fg，TP,ALB,FⅧ,FⅤ respectivelyResultsThe content of TP, FⅧ, FⅤ and Fg in virus inactivated frozen plasma with a certain degree of reduced, but mostly within 30%, in the acceptable rangeConclusionThe MB virus inactivated plasma did not influence the clinical application, it did More good than harm .

【Key words】Virus inactivated frozen plasma;Clotting factor;Factor activity；Plasma protein

新鲜冰冻血浆内含有各种凝血因子及各种血浆蛋白，由于血浆及其制品的病毒检测方法有一定的局限性及病毒“窗

作者单位：526060广东省肇庆市第二人民医院检验科

口期”的存在，新鲜冰冻血浆和全血一样，具有传播艾滋病、乙型肝炎等输血传播疾病的危险［1］，因此输血的危险性依然存在。为使广大患者能更安全有效地使用血浆，我巿血站对

血浆开展了亚甲蓝(MB)光化学法病毒灭活项目。MB光化学法病毒灭活技术应用于血浆病毒的灭活，其有效性和安全性已被证实，但MB光化学法病毒灭活的过程对新鲜血浆中的凝血因子及血浆蛋白等有效成分的质量会产生怎样的变化，仍有待确认。为此我们通过实验检测血浆中的部分有效成份的变化并作一分析探讨。

1材料与方法

11样本来源随机抽取50份常规血液，按照标准操作规程制备新鲜血浆。每人份一分为二，分两组，A组为不灭活病毒新鲜血浆，立即进行检测。另一组为B组，进行MB光化学法病毒灭活后的新鲜冰冻血浆从采集到制备完毕6 h内进行检测。

12材料一次性无菌试管，德国BE1500自动血凝分析仪，CL800生化分析仪。严格按照仪器与试剂操作说明的要求进行检测。

13资料①PT (凝血酶原时间)用于外源性凝血因子(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅰ)凝血功能的筛查。②APTT(活性部分凝血酶原时间)用于检测内源性凝血因子(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ)凝血功能。③TT(凝血酶时间)，快速评定止血和血栓形成的有效方法。④Fg(纤维蛋白原)。检测PT，TT，APTT，Fg能间接反映血浆中的因子活性水平。

血浆蛋白的测定；①TP(总蛋白)。②ALB(白蛋白)

14方法A组为新鲜冰冻血浆，不灭活直接进行测定，B组为灭活冰冻血浆，先对其进行MB(亚甲蓝)光化学病毒灭活后再测定。在血浆进行病毒灭活后进行热封口时留样检验。

15统计学方法应用SPSS 160作t检验分析。

2结果

21两种血浆实验测定结果(见表1)。

表1两种血浆各指标均值的实验检测结果

名称

(单位)允许正

常范围新鲜冰

冻血浆MB病毒

灭活血浆PT(s)9～14313201520TT(s)8～1513401660APTT(s)21～44538815212Fg(g/L)2～4260151TP(g/L)60～8070026360ALB(g/L)35～5044224011FⅤ(%)70～15098406890FⅧ(%)70～15010820778022各项指标的统计结果比较(见表2，3)。

表2MB灭活血浆各项指标与正常范围比较的可信区间

第3篇

作者：胡嘉淼 单位：暨南大学生物工程学系

菌株前处理将活化的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养至对数生长期，离心收集菌体(4000r/min，10min)，弃上清，悬浮菌体于PBS，使得OD600=0．05(108CFU/ml左右)。不同浓度的亚甲基蓝对PBS和牛奶中大肠杆菌的灭活作用的测定将备制好的含大肠杆菌的菌悬液10μl和含1%脱脂奶粉的牛奶190μl加入96孔板中，每孔共200μl，并在各孔中加入MB，使其终浓度分别为0．5×10－2、0．5×10－1、0．2、0．5、1.0、2.0、5.0和10.0μg/ml，37℃避光孵育30min，放在距离溴钨灯光源20cm处(测得光强度为160mw)照射10min后进行平板计数(L+S+)。同时设置不光照和/或不加MB组作为对照(L-S-;L+S-;L-S+)。不同光照时间对PBS和牛奶中大肠杆菌的灭活作用的测定按照“1．2”方法处理大肠杆菌后，在96孔板中加入10μl菌悬液和190μl含1%脱脂奶粉的牛奶，并在各孔中加入MB，使其终浓度为2μg/ml，37℃避光孵育30min后在距离溴钨灯光源20cm处照射1、5、10、15、20和30min后进行平板计数(L+S+)。同时设置不光照和/或不加MB组作为对照(L-S-;L+S-;L-S+)。不同牛奶浓度对亚甲基蓝/光化学法灭活大肠杆菌效率的影响将含1.0%、2．5%、5.0%和10.0%脱脂奶粉的菌悬液加入96孔板中，每孔200μl(190μl牛奶+10μl菌悬液)，并在各孔中加入MB，使其终浓度分别为1、2、5和10μg/ml，37℃避光孵育30min，放在距离溴钨灯光源20cm处照射10min后进行平板计数(L+S+)。同时设置加MB但不光照的空白组作为对照(L-S+)。细菌菌落平板计数将上述不同处理方式所得的菌悬液均以1∶10梯度稀释后涂板于细菌计数培养基平板上，于37℃生化培养箱中恒温培养，24h后取出进行菌落计数。试验重复3次，取平均值。数据处理结果以均数(x珋)±标准差(s)表示，用GraphPadPrism5所带的统计软件进行统计学处理。差异显著性采用t检验，P＜0．05为显著差异。

亚甲基蓝/光化学法处理前后细菌形态对照相较于未添加光敏剂、未光照的空白对照组(图1－A)，经过2μg/ml的亚甲基蓝，10min的溴钨灯光源照射处理后的牛奶中的大肠杆菌(图1－B)置于37℃生化培养箱中培养24h后，可以看到试验组中菌落很小，透明，呈灰色，边缘整齐，呈滴露状;而空白对照组则菌落较大，菌落不透明，呈乳白色。不同浓度亚甲基蓝对亚甲基蓝/光化学法灭活PBS和牛奶中大肠杆菌效果的影响由图2和图3可知，随着光敏剂MB浓度的增加，亚甲基蓝/光化学法对大肠杆菌的杀伤作用逐渐增强。当MB浓度低至0．5×10－2μg/ml，光照10min即可使PBS中约80%的大肠杆菌失活;当MB浓度达到0．2μg/ml时，几乎可完全使PBS中的大肠杆菌灭活。而在同样光照时间下，要致死牛奶中70%的大肠杆菌，则需MB浓度为0．5×10－1μg/ml;而当MB浓度为5.0μg/ml时，则可使牛奶中大肠杆菌菌落总数降低7个数量级。同时对照组则未显示出明显的杀伤作用。由此可见，亚甲基蓝/光化学法对PBS和牛奶中的大肠杆菌有较好的杀伤作用。2．3不同光照时间对亚甲基蓝/光化学法灭活PBS和牛奶中大肠杆菌效果的影响由图4和图5可知，当MB浓度在2.0μg/ml时，光照时间在一定范围内的延长对大肠杆菌细菌灭活作用的有一定程度的提高。当MB在一定浓度下，光照时间≥10min情况下，亚甲基蓝/光化学法能使PBS中的大肠杆菌菌落总数显著降低6个数量级以上，即杀伤99.999%的大肠杆菌;而在同样的光照时间下，牛奶中大肠杆菌的灭活效果比PBS中的灭活效果稍显逊色，仍能降低4个数量级以上，灭活率达到99．99%，而光照延长至15min以上时，牛奶中大肠杆菌的灭活效果则可同样达到6个数量级2．4不同牛奶浓度对亚甲基蓝/光化学法灭活模拟体系中大肠杆菌效果的影响由图6可知，随着牛奶浓度的升高，亚甲基蓝/光化学法对大肠杆菌的灭活效果逐渐减弱，当经过MB浓度为5μg/ml的光化学法处理10min后，1%牛奶含量的模拟体系中的大肠杆菌降低7．5个数量级，而10%的体系仅降低2个数量级，这可能是由于溶液光通透性的降低影响了亚甲基蓝/光化学法的灭菌效果。

通过试验可知亚甲基蓝/光化学法作为一种新型灭菌技术对模拟受感染牛奶中的大肠杆菌有明显的杀伤作用，当亚甲基蓝浓度为2.0μg/ml，接受光功密度为200mW/cm2的溴钨灯光照10min能杀死99%以上的大肠杆菌，而对照组未见明显的杀伤作用。并且笔者观察到经过亚甲基蓝/光化学法处理过的大肠杆菌在固体培养基上生长形态也发生了明显的改变，说明亚甲基蓝/光化学法处理可以有效地影响大肠杆菌的正常生长。同时，还发现亚甲基蓝/光化学法对模拟受感染牛奶中大肠杆菌的灭活效果略低于PBS对照组中的大肠杆菌，这可能是与牛奶相比，PBS的光通透性有所降低有直接的关系。这一猜想在后续试验中得到证实:随着牛奶浓度的增高，即溶液的光通透性的不断降低，体系中大肠杆菌的灭活效果随之下降，与前人运用亚甲基蓝/光化学法灭活血浆中病毒［8］，由于全血中红细胞等固体成分较多，导致灭活病毒有所降低的试验结果及推论相符。此外还发现，通过适当延长光照时间，或适量增加光敏剂浓度，仍然可以快速高效地灭活牛奶中的大肠杆菌。该次试验结果表明，亚甲基蓝/光化学法对牛奶等液体中的大肠杆菌的灭活效果显著。目前工业上常使用巴氏杀菌、超高温瞬时灭菌等热力杀菌方法来保障牛奶的质量安全，这些热力杀菌方式虽然能保证牛奶在微生物方面的安全，但能量消耗较大，对牛奶的品质破坏也较大，易造成热敏性营养成分损失、挥发性物质散失、风味变化、水分流失等，并且对于多种致病微生物所产生的致病毒素等危害产物无法有效去除。而由于光敏剂具有选择性地聚集在有害微生物及其生物膜的特性，能够有效灭活牛奶中的有害微生物［11］，因此PDT相对于传统的杀菌方法，将是一种值得开发的，安全、简便、高效，非常有前景的新型非热灭菌方法，具备良好的应用前景。

第4篇

关键词：兽用疫苗 灭活 工艺 设备选型计算

中图分类号：S852 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）04（b）-0225-01

1 灭活苗简述

疫苗：凡是具有良好免疫原性的病原微生物，经繁殖和处理后制成的制品，用以接种动物能产生相应的免疫力者。除一般活菌（毒）疫苗、灭活疫苗外，还包括类毒素、类毒素与菌体混合疫苗、亚单位组份苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、人工合成疫苗、抗独特型抗体疫苗等。

灭活疫苗：用物理方法或化学方法将其灭活后制成的疫苗。

2 各种动物疫苗工艺流程示例

（1）灭活苗生产工艺过程简述

灭活鸡胚苗：采用国内成熟的鸡胚培养病毒的技术。将种毒接种于9～11日龄非免疫鸡胚，接种后的鸡胚放在孵化箱中继续孵化，弃去接种后24 h内死亡的鸡胚，培养好的鸡胚取出，放在2～8 ℃冷库中冷藏，之后收获鸡胚尿囊液等。收获的鸡胚尿囊液等加入甲醛等灭活剂灭活，灭活后的鸡胚尿囊液等置2～8 ℃冷库冷藏备用。

（2）灭活细胞苗：将配制好的细胞培养液加入转瓶，将转瓶置于温室中培养，待转瓶内长成单层细胞后，将毒种接种入转瓶中，之后在温室中继续培养，收获病毒原液。收获的病毒原液加入甲醛等灭活剂灭活，灭活后的病毒原液置2～8 ℃冷库冷藏备用。

（3）灭活细菌苗：采用发酵罐发酵培养细菌和固体培养细菌两种技术。将菌种接种于培养液中，经发酵罐培养或接种在琼脂平板上培养，收获菌液（苔）。收获的细菌加入甲醛等灭活剂灭活，灭活后的菌液置2～8 ℃冷库或储液罐中冷藏备用。

（4）乳化配灭活苗：在乳化罐中加入佐剂，灭菌冷却后，按配比加入从冷库中取出的抗原液，经乳化后分装入疫苗瓶，分装后的产品待检验合格后，包装入库。

3 灭活疫苗工艺设备计算示例

灭活疫苗车间的计算

A.前孵化箱计算

根据生产大纲，若年产鸡胚灭活疫苗10000万mL，疫苗水相与油相的配比为25%：75%，折合水相（病毒原液）2500万mL。

每枚非免疫鸡胚可生产病毒原液10 mL，鸡胚前孵化成功率为90%，后孵化成功率为90%，疫苗分装成品率为90%，则年需鸡胚量为：

2500万mL/年÷10mL/胚÷90%÷90%÷90%≈342.9万胚/年

鸡胚前孵化10天计，每年生产日数为300天，则全年可孵化30批。

每批需孵化鸡胚

342.9万胚/年÷30批/年≈11.4万胚/批

前孵化采用6台19200蛋位的孵化箱可满足生产的需要。

B.后孵化箱计算

本项目鸡胚接毒后采用孵化箱继续孵化，年孵化量为

2500万mL/年÷10mL/胚÷90%÷90%≈308.6万胚/年

鸡胚后孵化时间以3天计，每年生产日数为300天，则全年可孵化100批。

每批需孵化鸡胚

308.6万胚/年÷100批/年≈3.09万胚/批

本项目配置3台19200蛋位的孵化箱作为后孵化箱，可以满足生产的需要。

C.转瓶机计算

年产细胞灭活苗2000万ml，

灭活苗水相（病毒原液）：油相=25%：75%

则年需病毒原液

2000万ml/年×25%=500万ml/年

采用容积为3000ml的转瓶，转瓶的装量为转瓶容积的10%，即300ml/转瓶，细胞培养的成功率为90%，病毒培养的收获率为90%，疫苗分装成品率为90%。

全年需培养细胞：

500万mL/年÷90%÷90%÷90%≈685.9万mL/年

细胞培养的时间为4天，全年生产日数为300天每批需培养细胞：

685.9万mL/年÷75批/年÷300mL/转瓶≈305转瓶/批

需配置3000mL、40瓶位转瓶机

305转瓶/批÷40瓶/台≈8台

全年需培养病毒：

500万mL/年÷90%÷90%≈617.3万mL/年

病毒培养时间为2天，全年生产日数为300天，每批需培养病毒：

617.3万mL/年÷150批/年÷300mL/转瓶≈137转瓶/批

需配置3000mL、40瓶位转瓶机

137转瓶/批÷40瓶/台≈4台

D.发酵罐计算

根据生产大纲，年产细菌灭活疫苗650万mL，灭活苗水相（细菌原液）：油相=25%：75%

则年需细菌原液

650万mL/年×25%=162.5万mL/年

年工作日按300天计，细菌液每5天可培养一批，全年可培养60批，每批需培养细菌原液（细菌培养的成功率为90%，细菌液的收获率为90%，疫苗分装成品率为90%。）

162.5万mL/年÷60批/年÷90%÷ 90%÷90%≈3.7万mL/批

细菌发酵罐装量为罐容积的70%，则发酵罐的容积为：

3.7万mL÷70%≈5.3万mL=53L

故配置100L发酵罐一套，可满足生产的要求，并预留一定的生产能力以满足扩产的需要。

E.乳化分装工序设备计算

根据生产大纲，灭活疫苗年产量为12650万mL，共分为120批进行配苗乳化，则每批需配苗

12650万mL/年÷120批/年≈100万mL/批

配置一套1500L的乳化设备（含油佐剂制备罐1台，乳化罐1台，储液罐1台，高压匀浆泵1台），可满足生产的需要。

液体灌装机：

每批疫苗需分装的瓶数为

100万mL/批÷100mL/瓶=10000瓶/批（以100mL/瓶计）

选用2台ZD-Ⅱ型全自动液体灌装机，该机灌装速度为60瓶/min，每小时可灌装3600瓶，2 h可完成全部灌装量，满足生产的需要。

轧盖机、贴签机、热风循环烘箱、脉动真空蒸汽灭菌器、细胞瓶洗瓶机等设备按生产能力配套设置。

参考文献

[1] 中国兽药典委员会.中国兽药典[M].中国农业出版社，2010.

第5篇

【关键词】： 人细小病毒B19；血液制品；感染率；紫外灭活

New progress in study of inactivation of human parvovirus B19 in blood products YANG Bojia1， ZHANG Xianpeng1，PAN Xiuyin2， NIE Xingjiao2， CHEN Sai， ZHANG Li， LU Jianming. 1.Department of Transfusion， Zhijiang People’s Hospital， Yichang， Hubei 443200， China； 2.Yichang Blood Center； 3.Department of Transfusion， The Central Hospital of Yichang； 4.Xingshan Substation， Yichang Blood Center； 5. Department of Transfusion， Renhe Hospital Affiliated to China Three Gorges University

Abstract： The high infection rate of human parvovirus B19 （HPVB19） in blood donors resulted in the high pollution rate of the HPVB19 in blood products. The current methods of virus inactivation in processing technique on blood products （such as methylene blue chemical method） could not inactivate HPVB19 effectively. There was a risk of blood transmission of the HPVB19， so it was most urgent to eliminate and inactivate the HPVB19 in blood products. A new method of shortwave ultraviolet had good effect on HPVB19 inactivation， and the protein recovery was high， so it showed a good future of research and application.

Key words： HPVB19； Blood products； Infection rate； UV inactivation

【中图分类号】R331.1

【文献标识码】A

【文章编号】2095-6851（2014）04-0623-01

血液制品不可替代的疗效和安全性关系着人民的生命健康血液制品的病毒安全性控制是血液制品（血浆蛋白衍生物）的安全与质量控制的关键，世界各国药品监管机构都非常关注这一问题。可经血/血液制品传播的病毒有甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、人免疫缺陷病毒（HIV）、人类细小病毒（B19） ，巨细胞病毒（CMV）以及人类朊病毒[1]。现阶段，国内外普遍采用原料血浆病原体筛查、原料血浆检疫期管理和血浆蛋白分离过程中增加病毒灭活/去除工艺等不同手段，进行病毒安全性控制，以最大限度降低血液制品病原体污染的风险。另外各种病原体核酸扩增检测技术从生产源头起作用，以灵敏度高和特异性强的特点成为迄今为止最灵敏的病毒检测方法，已经广泛用于原料血浆的病原体早期筛查。该方法显著降低了HIV、HCV和HBV的血清学检测的窗口期，HIV可以减少10-11天、HCV可以减少57-59天、HBV可以减少30天，从而显著降低经血液传播的病毒污染血液制品的风险[2]。

1 人细小病毒B19

人细小病毒B19（human parvovirus B19，简称B19），最早由Cossart于1975年在筛选献血员乙型肝炎抗原时发现，是已知唯一对人类致病的细小病毒[3]，病毒无包膜、耐热，直径小（18～20 nm），基因组为线性单链DNA分子，约5.5kb，分子量约为50～80KD，对称二十面体[4]。

1.1 人细小病毒的流行情况

普通人群中流行情况：人细小病毒B19感染非常普遍，全年均可发生，但主要发生在晚冬和早春季节，该病毒可通过呼吸道传播，病毒血症时血液中B19 DNA可到达1012拷贝/ml[5]。大约40%～60%的成年人都曾感染过B19病毒，体内出现IgG抗体，且IgG抗体阳性率随年龄增长而增长，5岁以下儿童及20岁以上成人其阳性率分别为2%和49%，在70岁左右的人群中，80%以上的血清标本中存在抗B19 IgG抗体[6]。在国内没有相关的流行数据报道。

献血员中流行情况：在无偿献血者中病毒血症的出现频率约1/260～1/40000，年龄段集中在35～45岁之间。其中阳性捐献者病毒血症时病毒载量为2.3×104到6.9×1011拷贝/ml（约合7.1×104到2.1×1012IU/ml），在急性期过后的几个月，少数甚至几年后仍有低水平的B19 DNA被PCR检测到[1]。女性抗体阳性率高于男性[7]。且献血员人细小病毒感染率和孕妇感染率比较差异不显著[8]。

1.2 B19病毒感染主要会对以下三类人群造成严重危害：孕妇，免疫力低下/缺陷的人及儿童。在孕妇病原体感染因素方面，人细小病毒B19是除巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、弓形虫感染之外造成孕妇自然流产的重要病原体之一，反复自然流产孕妇和正常孕妇的流产组织可检测到B19 DNA。B19病毒感染还可以引起儿童的第五病，成人的风湿性关节炎，溶血贫血患者的再生障碍危象和免疫抑制患者的红细胞再生障碍等疾病[9～12]。

1.3 B19病毒对血液制品的威胁

尽管人们认为B19存活感染期短，高滴度的病毒血症只持续7到10天，然而一个感染者体内的低水平病毒量（常在10，000～100，000拷贝/ml） 可持续数月直到病毒被全清除。并且由于B19病毒直径小、耐热、对人群的易感性及目前灭活/去除血液制品中病毒的S/D法、过滤法和热处理法均不能有效的灭活/去除该病毒[13～16】，使得大多经过分离处理的血浆和终产品仍遭受污染，并常含有较高的病毒载量，使B19病毒成为血液制品的主要污染病毒之一。B19病毒DNA污染凝血因子Ⅷ、凝血酶原复合物、因子Ⅶ等血浆制品的比例分别达到86.18%、88.14%和66.11%[17]。长期接受凝血因子类产品（产品中病毒含量大于108 geq/ml时产生抗体，小于103.5 geq/ml不产生抗体）治疗的患者体内抗B19抗体显著升高[18]。大约60%的血浆池包含102到108genome copy equivalents（1gce相当于1.02+0.13 IU，international units）[19]。经S/D处理的血浆仍有23%含有B19 DNA且滴度高达106-108 geq/ ml，而混合血浆中IgG滴度约为44 IU/mL不足以中和抗原[17]。目前美国食品药品监督管理局已规定对血浆库进行B19病毒DNA检测，对于B19病毒DNA浓度超过104拷贝/ml的血浆库将废弃不予使用，如果高病毒载量的捐赠者血浆在混浆前没有被及时去除的话，将会有5%到15%的血浆池不能使用，造成严重损失[20]。

2 B19病毒不同基因型检测

目前把B19病毒分为三种基因型，基因Ⅰ型，A6和Lali（基因Ⅱ型）和最先在法国分离出的V9（基因Ⅲ型），其中基因Ⅱ型10.8%的编码蛋白序列与Ⅰ型不同[21]。在Ⅷ因子产品中，81%的感染型是基因Ⅰ型，14%的感染型是基因Ⅱ型，病毒载量分别达到107和105 geq/ml。不同基因型感染后，症状与宿主先天或后天的体质有关，与基因型无明显的相关性，但在检测方面略有不同，目前已有两种定性实时荧光PCR试剂盒在欧洲商业化用于血浆检测，Roche LC虽然灵敏度高，但不能检测出第Ⅱ基因型病毒，而ArtusB19 PCR试剂盒可检测出第Ⅱ基因型和代表Ⅲ基因型的质粒D91.1，总体来说B19病毒变异并不多，需扩大8倍才能看出来，可被认为是一个少量变异的家族[22]。

3 血制品中B19病毒的去除/灭活

血液制品的病毒灭活方法主要有物理法和化学法。物理法中常用的热处理法有湿热法（巴斯德法）、干热法（60℃ 72 h，80℃ 72h）、蒸汽加热法（将湿润的冻干产品暴露于60℃、1119mPa的热蒸汽中进行病毒灭活10h）、纳米膜过滤等方法。化学法中较常用的有低pH法、有机溶剂/表面活性剂法（S/D法）等。

3.1 传统病毒灭活工艺：在生产白蛋白的过程中，B19病毒对液体加热敏感，但在生产静注免疫球蛋白时，B19病毒在60%蔗糖浓度下，液体灭活60℃1小时，并不敏感[23]；干热处理能有效灭活HIV和肝炎病毒，但病毒灭活效果受制品水份残留量、配方（如：蛋白质、糖、盐、氨基酸含量）以及冰冻和冻干时间的影响，同时湿度也会影响B19病毒对干热的敏感性，低湿度会加强病毒的抵抗力[19]，一般情况下，干热处理1，2和3小时后，病毒感染性分别下降1.5，2.8，3.8log，但在有蔗糖存在下，B19病毒就不能被很好的灭活，如凝血因子制备工艺研究中采用80℃、72h加热，该法能十分有效地灭活HIV和肝炎病毒，但对B19病毒无效；蒸汽加热法、S/D、低pH法对无脂包膜病毒灭活效果也不如对脂包膜病毒灭活效果好，使B19病毒成为血制品的主要污染病毒。

3.2 新的病毒灭活工艺

3.2.1 纳米膜过滤：纳米膜过滤法，与S/D法或低PH法相结合可灭活部分对热稳定的无包膜病毒。Yokoyama等[24]报道B19病毒在0.3M甘氨酸存在，pH6.2的情况下可形成聚合体，被35nm滤膜除去7.5log，而在其他氨基酸，乙酸铵或PBS中去除很少，由此推测B19的去除并不是依靠形成抗原-抗体复合物，而是甘氨酸使病毒聚合，尺寸变大，进而通过35nm的滤膜被去除。但研究发现此法应用于工业生产时膜孔径大小的稳定性不好，且高分子及高粘度制品不适合用纳米膜过滤法[2]。

3.2.2 光化学法：近年来光化学灭活法成为对病毒灭活的研究热点[25]，在需灭活的血液制品中加入化学光敏剂，光敏剂与病毒DNA相结合，在一定的光辐射剂量下，对病毒灭活达到很好的效果。然而病毒灭活后光敏剂的去除及光敏剂的潜在致畸作用仍是困扰人们的问题。目前亚甲基蓝光化学法灭活单份新鲜冰冻血浆已进入实际应用阶段[26]，但此法对无包膜病毒效果不好。

3.2.3 短波紫外线灭活：紫外线杀菌作用显著，可使DNA、RNA的碱基生成二聚体或加成物而抑制病毒复制，病毒下降滴度与光辐射强度及暴露时间有关。通常，紫外线可分为3个波段： A波段320～380nm（UVA），B波段290～320nm（UVB），C波段190～290nm（UVC），其中短波紫外线UVC对病毒灭活效果最好[27]。以前紫外灭活普遍被认为对血浆蛋白损伤较大而一度被搁置。最近不断有研究发现，在很好的掌握辐射剂量和暴露时间时，短波紫外线对病毒，尤其是无包膜病毒可达到很好的灭活效果，在不加光保护剂的情况下对血浆蛋白损伤也不大。J.Wang等[28]报道了一种新的紫外灭活仪在短时间内就能有效灭活病毒，尤其是无脂包膜病毒，同时对血浆蛋白不会造成损伤。这种紫外灭活仪设计的围绕灯管的螺旋形结构使血浆料液在压力泵的推动下形成涡流[29]，进而使每一部分液体分送速率相同，所受辐射均匀，从而达到短的暴露时间，在不需添加任何光保护剂的情况下，无包膜病毒B19灭活大于4log值，制品蛋白检测不到损伤，蛋白回收率高。本实验室研究发现，应用该紫外灭活仪对加入无包膜病毒的静注免疫球蛋白、凝血VIII因子和凝血酶原复合物进行90J/m2，135 J/m2，200 J/m2等剂量下的灭活辐射处理，病毒滴度下降达4log值以上，且处理后的血液制品蛋白质量符合药典要求。

4 结语

人细小病毒B19具有普遍易感性，对免疫力较低的患者具有潜在的致病威胁，献血员含病毒的单个单位血浆有使整个血浆池污染的潜在危险。中和性抗B19抗体可阻止病毒与细胞的结合，但是否具有对B19病毒感染的保护作用尚不清楚，需要进一步研究。科技进步与发展使生物医学领域日新月异，对血液中已知和未知病毒的检测与灭活/去除工艺研究也不断深入，以期更大程度上保证患者健康。目前国内对献血员人细小病毒检测并没有纳入法定检测项目，使血制品存在安全隐患。基于此，开发研制出一种新的病毒灭活工艺迫在眉睫，在众多灭活病毒机制中，短波紫外线对无包膜病毒的灭活优势凸显出来，有很好的应用前景，越来越引起人们的重视，也为我们提供了新的思路和方法。

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第6篇

[关键词]　亚甲蓝；病毒灭活；冷沉淀；可行性

[中图分类号]　R457 [文献标识码]　B [文章编号]　1673-9701（2012）36-0101-02

冷沉淀因富含凝血因子Ⅷ（FⅧ）、纤维蛋白原（Fbg）、瑞斯托霉素因子（vWF）、纤维蛋白稳定因子（FⅩⅢ）、纤维结合蛋白（Fn）等有效成分，被广泛用于出血性疾病的治疗。但因冷沉淀易造成输血传染性疾病的发生，在所有血液制品中，输注冷沉淀传染病毒的风险高于血浆及红细胞和血小板[1]。因此，冷沉淀的输注安全与输注有效性缺一不可，采取有效措施两者兼顾尤为重要。本课题通过比较同源新鲜冰冻血浆在灭活前后制备冷沉淀的质量评价分析血浆灭活后制备冷沉淀的可行性，现报道如下。

1　材料与方法

1.1　设备与试剂

日本CA530血凝仪；试剂包括乏FⅧ批号：546545、APTT批号：547118、CaCl2批号：549448；正常参比血浆批号：503222A；Fbg批号：40938、FN批号：201205；FⅩⅢ批号：201205；vWF批号：201205；威高WG-LRH-I型低温融化箱；日立大容量离心机；亚特斯全自动酶免仪；上海医用病毒灭活柜及配套病毒灭活袋。

1.2　方法

1.2.1　原料血浆的制备 采用Q-400血袋采集CPDA-1　抗凝血液400　mL，尽快分离新鲜血浆。随机抽取新鲜血浆20袋，每袋均分为100　mL×2，分别作为新鲜冰冻血浆组（甲组）和病毒灭活新鲜冰冻血浆组（乙组）。甲组快速置于-50℃速冻机中速冻，-30℃冰柜保存备用；乙组用MB/光化学法进行病毒灭活后，采用与甲组相同的方式速冻并保存备用。所有操作在采血后6　h内完成。

1.2.2　冷沉淀的制备 将上述两组冰冻后血浆在完全相同的条件下制备甲、乙两组冷沉淀，快速置于-50℃速冻机中速冻，-30℃冰柜保存备用。

1.2.3　留样与检测 将上述两组冷沉淀取出，37　℃融化并称重，混匀后留样5　mL，分别检测FⅧ、Fbg、vWF、FⅩⅢ、Fn的含量。

1.3　统计学处理

应用SPSS11.5统计软件对数据进行统计处理，采用t检验对两样本均数进行比较，P

2　结果

病毒灭活新鲜冰冻血浆制备的冷沉淀，FⅧ、Fbg含量均有所降低，差异有统计学意义（P　＜　0.05），其中FⅧ留存率为（62.5±8.8）%，Fbg留存率（62.0±11.7）%，而vWF、FⅩⅢ、Fn与同源新鲜冰冻血浆制备的冷沉淀比较，差异无统计学意义（P　＞　0.05）。见表1。

3　讨论

目前，国内采供血机构普遍采用亚甲蓝对血浆进行病毒灭活，已取得了良好的效果，灭活后血浆既保证了输血的安全性，有效性又在可控范围当中，但对血浆衍生产品冷沉淀的病毒灭活仍处于探索阶段。

从本课题可以看出，新鲜冰冻血浆经亚甲蓝灭活后制备的冷沉淀，　血浆FⅧ和Fbg含量均有所降低，分析其原因，FⅧ属不稳定凝血因子，由于病毒灭活过程在2～10℃环境进行，灭活时间为30　min，延迟了血浆速冻的时间，导致其活性降低；Fbg属稳定的凝血因子，时间延迟对其影响较FⅧ小，但用输血过滤器吸附过滤亚甲蓝过程中，会吸附一部分，导致其含量降低[3]。因此，用病毒灭活新鲜冰冻血浆制备冷沉淀，会影响冷沉淀输注的有效性。

2012年7月1日实施的《全血及成分血质量要求（GB18469-2012）》对病毒灭活新鲜冰冻血浆制定了相关标准，采用亚甲蓝病毒方法灭活的新鲜冰冻血浆要求FⅧ≥0.5　IU/mL，较未灭活的新鲜冰冻血浆减少了0.2　IU/mL，降低了约30%，与文献报道大致相同[4]，对病毒灭活新鲜冰冻血浆制备冷沉淀则未做出相关规定。本次试验结论显示，病毒灭活新鲜冰冻血浆制备冷沉淀，FⅧ和Fbg下降幅度均值为38%，20袋灭活冷沉淀中有5袋未达到现有未灭活冷沉淀凝血因子标准（来源于200　mL全血：≥40　IU）[5]，灭活后纤维蛋白原则有18袋未达到标准（来源于200　mL全血：≥75　mg　）。

综上所述，从降低输血传播病毒风险的角度，应该对冷沉淀进行病毒灭活，但从产品质量方面考虑，使用病毒灭活新鲜冰冻血浆制备冷沉淀，则需要制定新的质量标准，降低FⅧ、Fbg含量。同时为最大限度提高凝血因子留存率，血站应对冷沉淀的制备环节严格控制，如选用CPDA配方抗凝剂，缩短采血、制备、保存时间，加强冷链管理均有利于提高冷沉淀产品质量。医院应根据病人需要掌握冷沉淀融化的温度、时间，融化后最短时间输注，均可减少凝血因子损失，还可根据病人情况适当加大用量以保证疗效。

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第7篇

【关键词】 改良疣体包埋术；疣体灭活剂；扁平疣；临床疗效

扁平疣是临床上常见且难治愈的皮肤病之一， 目前临床治疗扁平疣的方法很多， 如：口服乌罗托品、氧化镁， 聚肌胞肌内注射， 局部1%喷昔洛韦霜外用， 激光、冷冻治疗等， 但疗效均不十分显著[1， 2]。本科2012年10月～2013年10月应用改良自身疣体皮下埋植结合自制疣体灭活剂肌内注射治疗难治性扁平疣53例取得很好疗效。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院2012年10月～2013年10月收治的103例难治性扁平疣患者， 年龄18～60岁， 病程1～10年， 皮疹分布以面部、颈部、四肢为主。经过口服、肌内注射抗病毒药物治疗、口服中药治疗效果不佳， 治疗时间≥6个月。将患者随机分为对照组（50例）与治疗组（53例）。治疗组年龄20～60岁， 平均年龄（35.00±8.22）岁；对照组年龄20～60岁， 平均年龄（35.02±8.32）岁；两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 治疗方法

1. 2. 1 两组相同的治疗方法 改良型疣体包埋术， 具体操作方法如下：取生长部位相对隐蔽的疣体2个， 消毒、铺巾， 用手术刀沿疣体取至基底层， 取新鲜疣体后压迫止血， 修剪疣体表面角质层， 将疣体剪成直径约0.4 mm碎片， 选取患者前臂中段伸侧， 消毒， 由自制针式推进器（由9号注射器针头和针芯组成， 针芯为针灸针0.6 mm型毫针剪去尖端、磨平， 长度与9号注射器针头长度相同， 其外径与9号注射器针管内径相仿）。取无菌9号注射器针头1枚， 眼科镊夹取疣体颗粒从针管尖端塞入约填入半针管， 接口端置入针芯半截。转入前臂上1/3屈侧区， 消毒， 针头斜面向上和皮肤呈30～40°， 左手捏起患者皮肤， 右手持已填充疣体颗粒的针头从捏住皮肤一侧进针， 深度约0.5～1.0 cm， 左手松开， 轻拨动针头尾部推进疣体颗粒， 边固定针芯边退针， 术毕， 创可贴覆盖创口[3， 4]。

1. 2. 2 两组不同的治疗方法 治疗组采用改良疣体包埋术联合疣体灭活剂肌内注射治疗。术后1周肌内注射疣体灭活剂。疣体灭活剂具体制作方法如下：取另一个切除下来的疣体， 给予生理盐水清洗、紫外线消杀、95%酒精固定， 次日液氮冷冻灭活疣体， 疣体研磨后， 再次给予紫外线消杀， 培养基接种排除杂菌生长， 2 ml生理盐水稀释， 疣体灭活剂制作完成， 存于4℃冰箱冷藏备用[5， 6]。于前臂三角肌肌内注射1 ml。术后2周同上法再次肌内注射剩余1 ml疣体灭活剂。1个疗程结束， 3个月观察疗效并随访。对照组采用改良疣体包埋术结合隔日肌内注射注射用胸腺五肽针（深圳翰宇药业股份有限公司生产， 10 mg/支） 10 mg/次， 2个月为1个疗程。

1. 3 疗效判定标准 痊愈：皮损全部消退， 随访期间无复发；显效：皮损消退≥70%或疣体明显萎缩；进步：皮损消退≥40%；无效：皮损消退

1. 4 统计学方法 采用SPSS14.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P

2 结果

治疗组的痊愈率和有效率优于对照组（P

3 讨论

扁平疣其发病跟患者的细胞免疫关系密切， 改良型疣体包埋术是一种微创形式的刺激机体产生主动免疫的方法[7]。包埋的疣体相当于微毒株的自体生物制剂[8-10]。疣体灭活剂是将该自体微毒株给予化学灭活， 但仍保留其免疫原性。因其是自身疣体包埋更易刺激机体而获得强而持久的免疫力。注射用胸腺五肽， 是临床常用的免疫调节剂， 可调节和增强人体细胞免疫功能， 临床治疗扁平疣取得很好疗效。治疗组的有效率为96.23%明显高于对照组的82.00%（P

综上所述， 疣体包埋术联合疣体灭活剂治疗较疣体包埋术联合注射用胸腺五肽针对难治性扁平疣有较高的痊愈率和有效率， 值得临床推广。

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[8] 黄晓波， 宫淑敏， 李牧， 等.祛疣颗粒联合阿维A治疗扁平疣疗效观察.中国皮肤性病学杂志， 2008， 22（7）：447-448.

[9] 李贤光， 付兰， 徐强平， 等.自体疣种植术联合聚肌胞注射液治疗扁平疣疗效观察.皮肤病与性病， 2011， 33（2）：116-118.

第8篇

【中图分类号】 R457.1【文献标识码】 B【文章编号】 1007-8517(2009)24-0071-01

输血安全是广大医患关注问题之一,由于无菌采血技术的及血液病原体检测技术的不断提高,非溶血性输血反应 ( febrile nonhemolytic transfusion reactions, FNHTR)以及TA- GVHD的发生率明显下降。但是,由细菌和病毒污染血液制品所造成的输血事故仍然时有发生,一旦发生输血后感染,后果极为严重,所以输血安全与相关病毒的研究成为近些年来的研究热点。

1 SEN病毒与输血安全

Martina[1]的研究小组1999年发现了一种新型病毒,他们认为这种病毒极有可能引起急性和慢性肝炎,并可能是8 0%的输血相关的N ANE型肝炎的主要致病因子。初步研究表明SENV为一单链环DNA病毒,无包膜。目前已发现SENV有8个不同的基因型。病毒基因组全长依不同的病毒株而异,约3.2～ 3.8 k b。P r i mi的研究表明[2] SENV的感染率在献血者中为13%,在接受过输血的人群中超过7 0%。 SENV-D和SENV-H在供血者中感染率,而在与输血相关NANE肝炎患者中感染率超过50%,这表明SENV-D和SENV-H可能与输血相关的NANE肝炎的发生有关。 SENV通过非肠道途径传播,主要是通过输血及血液制品的输注进行传播。

2 辐照技术在输血安全中的应用

辐照血既能有效杀灭血液制品中的细菌、病毒和细胞因子,又能保留红细胞、蛋白等有效成分,不破坏蛋白成分的活性,为临床输血提供安全保障的关键。大量实验证实γ射线可干扰细菌的 DNA复制,导致细菌死亡。同时,γ射线辐照对病毒具有良好的杀灭作用。因引γ射线辐照是灭活血液制品中细菌和病毒污染的快捷的方法之一。有研究者[3]观察了不同辐照剂量对冻干血浆中包膜和无包膜指示病毒的灭活作用。结果显示,Coy射线灭活冻干血浆中病毒的效果随辐照剂量增加而增强。照射后的血浆清蛋白等成分含量略有下降,凝血因子活性减少了3 0%～4 0%。各指示病毒对γ射线敏感性不同。辐照在细胞因子灭活中具有重要作用。国内外研究表明,TA-GVHD与NHFTR等输血相关性反应或疾病的发生与输注血液制品中白细胞所分泌的某些细胞因子含量有关。在血浆和血液细胞成分的上清液中存在着大量的细胞因子,主要包括IL -6和 TNF -α等。国内前期研究表明,通过透射电镜观察到经一定剂量60Coy射线照射血液制品中白细胞尤其是淋巴细胞凋亡明显增加。李志强等[4]的研究表明,经30 Gy 60Coy射线辐照经去白细胞过滤血血浆 I L -2、 I L - 6、I NF-γ与TNF -α含量变化不是很显著,而未经 C o y射线照射或去白细胞过滤血 (对照组 )血浆 I L - 2、I L- 6、INF -γ与 TNF-α含量明显升高。因此,他们认为经 3 0 Gy60Coy射线辐照血液制品输注具有预防TA- GVHD的作用。适当剂量γ射线能有效灭活产生上述细胞因子的细胞,同时又不损伤血细胞功能,血液也不因此获得放射性。也就是说,应用适当剂量的γ射线照射红细胞制品具有杀菌和灭活淋巴细胞的双重作用,为临床输血提供了安全保障。

3 血浆中病毒的灭活

目前,对人血浆中病毒的灭活方法主要有两种:一种是S/D法( solve n t/detergen t )和 MB法。S /D法即血浆用有机溶剂/去污剂灭活、血浆中病毒的方法。以后研究证明,不同的SD配方灭活不同种类制品中的不同种类脂包膜病毒。我国自1995年开展血液制品病毒灭活工作以来有数十个企业应用S/D法灭活血浆制品中的病毒。 MB法处理血浆的优点可避免血浆大混合有增加传播病毒和其他病原体的不利影响外,另一个优点是 Aznar等,进行了凝血因子的测定表明, MB法可避免 SD法处理的缺失。此外 MB法处理工艺相对简单,且残留亚甲蓝不必去除。MB法不足之处为:一是只能灭活脂包膜病毒等,而对非脂包膜病毒无效:二是单一袋中的各种凝血因子含量不同,各种凝血因子含量和总蛋白含量非标准化,所以临床使用无准确参考剂量,不方便。

4 血细胞的灭活

血液中的血细胞病毒灭活一直处于探索之中。目前此领域的研究大多集中在光化学方面。M B法用于红细胞制品灭活时对红细胞有损伤,可导致红细胞溶血率、离子通透性和免疫球蛋白结合的增加等。为了克服M B法的不足,Wagner[5]等筛选了一系列吩噻嗪类复合物后,发现1,9 -二甲基亚甲基蓝( DMMB )比美兰多了两个环形的甲基基团,从而疏水性增强更易于插入细胞膜内。可穿透病毒衣壳尤其是与鸟嘌呤结合,在光照下可激发产生单线态氧,将鸟嘌呤氧化成8-羟基鸟嘌呤,从而导致病毒基因的破坏。

参考文献

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[2] 黎儒青,蒋天伦,肖瑞卿,等.不同剂量γ射线对红细胞制品中细胞因子含量的影响[ J ].第三军医大学学报,2006,28( 24):24 -59.

第9篇

1 新鲜冰冻血浆(FFP)的组成

新鲜冰冻血浆在血站经抗凝采血，取新鲜血于6~8 h内在4℃离心将血浆分出，并迅速在-50℃以下冰冻成块即制成。在-20℃以下可保存一年，一年后成为普通血浆。每一升新鲜冰冻血浆中除血小板外，含有血浆蛋白60~80 g，纤维蛋白原20~40 g其他凝血因子0．7~1．0 IU/ml。

血浆蛋白分类复杂，生物学行为各异，在生物化学研究中，曾经用盐析法将血浆蛋白分为白蛋白、球蛋白与纤维蛋白原三类。用电泳法又将血浆蛋白分为白蛋白,α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、纤维蛋白原、γ-球蛋白6个区带。用其他免疫还可以将血浆蛋白做更进一步的区分，这说明血浆蛋白包括了很多分子大小和结构不相同的蛋白质，各种血浆蛋白具有不同的生理功能，这些功能是构成血浆综合功能的重要组成方面。

2 新鲜冰冻血浆的生理功能

2．1 运输功能 蛋白质巨大的表面上分布有众多的亲酯性结合位点，它可以与酯溶性物质结合，使之可溶于水，便于运输，血浆蛋白还可以与血液中分子较小物质(如激素、各种正离子)可逆性结合，即可防止它们从肾脏流失，又由于结合状态与游离状态的物质处于动态平衡之中，可使处于游离状态的这些物质在血中的浓度保持相对稳定。

2．2 缓冲功能 血浆白蛋白和其的钠盐可组成缓冲对，和其他无机盐缓冲对一起，缓冲血浆中可能发生的酸碱变化，保持血浆PH值的稳定。

2．3 形成胶体渗透城市，调节血管内外水分的分布。

2．4 参与机体的免疫功能 在实现免疫功能中有重要作用的免疫抗体、补体系统等，都是有血浆蛋白构成的。

2．5 参与凝血与抗凝血功能 绝大多数的血浆凝血因子、生理抗凝血物质及促进血液纤维溶解的物质都是血浆蛋白。

3 新鲜冰冻血浆的临床运用

3．1 新鲜冰冻血浆临床使用的适应证 近年来欧美发达国家都修订和出版了有关FFP临床使用的指南和手册，明确FFP的临床适应证，以规范FFP的临床使用。FFP的临床适应证主要有下列几种类型：①没有浓缩的血液制品可用的，单一凝血因子缺乏患者的出血治疗，如凝血因子V缺乏患者的出血治疗；②同时有多种凝血因子缺乏，伴有严重出血的患者，如肝脏疾病患者和接受大剂量输血患者的出血治疗；③弥散性血管内凝血(DIC)患者伴有严重出血的治疗；④用于血栓性血小板减少性紫癜(TTP)患者的血浆交换治疗；⑤双香豆素抗凝治疗过量的纠正治疗。由此可知，FFP的临床适应证是很有限的，不适当地使用FFP，甚至滥用FFP，不仅无益于患者，反而使患者面临输血传染病和输血反应的严重风险。

3．2 输注新鲜冰冻血浆传染疾病的风险及病原体去除和灭活处理 对FFP采用病原体去除和灭活处理，对进一步减少输注FFP传染病毒和其他病原体的残余风险具有重要意义。

3．2．1 FFP的有机溶剂/表面活性剂(S/D)法病毒灭活处理 灭活病毒的S/D法处理技术，最初被用于血液制品，特别是凝血因子产品的病毒灭活处理。该方法能有效灭活各种脂包膜病毒，如HIV、HCV和HBV，对非脂包膜病毒无杀灭作用。但由于在大混合制备过程中对特异性抗体的稀释作用，可减少输注FFP的不良反应和输血相关急性肺损伤(TRALI)的发生。因此不仅被FDA批准在美国推广使用，在欧洲也得以广泛临床应用。

3．2．2 FFP的亚甲基蓝(MB)光化学法病毒灭活处理 病毒的MB光化学法处理技术，1991年开始被用于FFP的病毒灭活处理，用最终浓度l m mol/L的亚甲基蓝，可见光照射60 min，可有效灭活病毒。为了达到相同的临床治疗效果，在使用MB病毒灭活血浆时，需要使用比未处理FFP更高的剂量。这也是FFP临床使用量增加的原因之一。

4 剂量与用法

一般认为，若输入FFP的剂量为10~20 ml/kg体质量，则多数凝血因子水平将上升25%~50%。由于的多数凝血因子在比较低的水平就能止血，故应用FFP的剂量不必太大，以免发生循环超负荷的危险。通常FFP的首次剂量为10-15 ml/kg，维持剂量为5~10 ml/kg。FFP应用时在37℃水浴融化，不断轻轻地摇动血袋，直到血浆完全融化为止。融化后在24 h之内用输血器输注，输注的速度为5~10 ml/min。

5 注意事项

5．1 若输注剂量较小，成人可以不要求同型输注。若输注剂量较大，或对新生儿、早产儿输用时，要求同型相输。

5．2 新鲜冰冻血浆融化时，温度不要超过37℃，以免引起Ⅷ因子活性丧失。如新鲜冰冻血浆经37℃加温后仍不回融，提示纤维蛋白原已转变为纤维蛋白则不能使用。

参考文献

［1］ 魏延民，王憬惺.新鲜冰冻血浆的临床应用及其安全性研究进展.中国输血杂志，2007，14(5)：27-28.

第10篇

关键词 家蚕；病原体；过碳酸钠；消毒；效果

中图分类号 S884.1+1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）02-0240-01

现在蚕业生产上多用醛制剂[1-2]、氯制剂[3-6]对家蚕的病原体进行消毒，醛制剂和氯制剂对环境有影响，需要研究新的消毒剂进行替代以减少对环境的污染。过碳酸钠，又称过氧碳酸钠，分子式为2Na2CO3・3H2O2，是碳酸钠和过氧化氢的加成复合物，过碳酸钠具有无毒、无臭、无污染等优点，遇水释放出H2O2，具有漂白、杀菌等效果[7-10]。本文通过用不同浓度的过碳酸钠水溶液与病原体混合的方法，研究了过碳酸钠对几种家蚕主要病原体的消毒效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试家蚕品种。供试家蚕品种为山东广通蚕种集团有限公司提供的菁松×皓月。蚕卵正常环境下催青孵化，幼虫在温度为24～28 ℃、相对湿度为70%的环境条件下饲喂桑叶。

1.1.2 供试药品。供试药品为过碳酸钠，活性氧含量≥13.5%，由国药集团化学试剂有限公司生产，生产批号为20150828。

1.1.3 供试病原。供试病原均由山东省蚕业研究所蚕病研究室保存。家蚕病原白僵菌（Beauveria bassiana）从5龄幼虫接种白僵菌后发病死亡的蚕体中分离所得；黄曲霉（Asper-gillus flavus）从5龄幼虫接种黄曲霉菌后l病死亡的蚕体中分离所得。对家蚕病原白僵菌、黄曲霉2种病原真菌取分生孢子加一定量的吐温-80，使其于灭菌蒸馏水中处于悬浮状态，使用2层纱布进行过滤，稀释至1.0亿个/mL置冰箱中于4 ℃环境温度下保存备用，保存时间为30 d以内。家蚕核型多角体病毒（BmNPV）多角体通过家蚕继代制取，病毒多角体精制后配成0.5亿个/mL的病毒多角体悬液，并置于4 ℃条件下保存备用。

1.2 对核型多角体病毒（BmNPV）的消毒效果试验

将0.5亿个/mL的BmNPV病毒多角体悬液200 μL分别与质量浓度为50.0、25.0、12.5 mg/mL的过碳酸钠药液200 μL混合，30 min后涂于桑叶正反面，给蚁蚕添食24 h，饲养2个龄期后调查灭活率。以自来水替代药液处理为毒对照。

1.3 对白僵菌、曲霉菌的消毒效果试验

将配制的1.0亿个/mL白僵菌、曲霉菌的孢子悬液分别与质量浓度为20.0、10.0、5.0、2.5、1.3 mg/mL的过碳酸钠药液各200 μL等量混合30 min，曲霉菌处理组涂于蚁蚕体表、白僵菌处理组涂于2龄起蚕体表，保湿饲育24 h，2个龄期后进行灭活率调查。以自来水替代过碳酸钠药液处理为毒对照。

2 结果与分析

2.1 对核型多角体病毒（BmNPV）的消毒效果

不同浓度过碳酸钠溶液对核型多角体病毒（BmNPV）的消毒效果见表1。从表中看出，过碳酸钠对多角体病毒的消毒能力较差，当浓度达到25.0 g/L时，对核型多角体病毒（BmNPV）的灭活率只有12.0%，当浓度继续增大到50.0 g/L时，对桑叶造成损害，已无消毒意义。

2.2 对白僵菌、曲霉菌的消毒效果

不同浓度的过碳酸钠溶液对白僵菌、曲霉菌的消毒效果见表2。从表中看出，过碳酸钠对白僵菌的消毒能力随浓度的降低下降明显，而对曲霉菌的消毒能力则下降较慢；当浓度为20.0 g/L时，对白僵菌的消毒效果强于对曲霉菌的消毒效果，对白僵菌的灭活率达到100.0%，对曲霉菌的灭活率为84.8%，当浓度降低到到1.3 g/L时，对白僵菌的灭活率已为0，对曲霉菌的灭活率仍有19.0%。

3 结论

根据试验结果可知，过碳酸钠对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的消毒能力差，对白僵菌、曲霉菌有一定的消毒效果。虽然过碳酸钠有无毒、无臭、无污染，可杀灭大肠杆菌、葡萄球菌、肝炎病毒等常见病菌等优点，但由于对家蚕的几种病原菌消毒效果不理想，所以以过碳酸钠作为单独成分的消毒剂在蚕业生产方面应用效果不佳，需配合其他药剂来使用。

4 参考文献

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第11篇

【摘要】

目的研究大蒜的质量控制方法。方法采用TLC法对大蒜药材进行定性鉴别。结果薄层色谱斑点清晰，阴性无干扰。结论该方法简便可行，可用于大蒜的质量控制。

【关键词】 大蒜； 蒜氨酸； 薄层色谱鉴别

大蒜是百合科Liliaceace葱属植物大蒜Allium sativum L.的鳞茎，在我国有着悠久的使用历史。大蒜的有效成分为含硫的一系列化合物。大蒜的鳞茎中主要的含硫化合物是S-烯丙基半胱氨酸硫氧化合物——蒜氨酸［1，2］。国内外已上市的大蒜制剂近几十种之多，但各种制剂原料的来源有所不同，而导致制剂质量的差异。为从源头控制大蒜药材质量，本文采用TLC法对大蒜进行定性鉴别。

1 材料

陈蒜：陈蒜1号（编号0501），陈蒜2号（编号0502）；鲜蒜：独头蒜（编号0601），山东白皮蒜（编号0602），山东红皮蒜 1（编号0603），山东红皮蒜2（编号0604），喀什沙门乡蒜（编号0605），玛纳斯蒜（编号0606），英吉沙芒辛乡蒜（编号0607），新地蒜（编号0608），老泉子街蒜（编号0609），半截沟蒜（编号0610）。

正丁醇20050420，分析纯，天津市福晨化学试剂厂；正丙醇20050818，分析纯，天津化学试剂三厂；冰醋酸041020，分析纯，西安化学试剂厂；甲醇050719，分析纯，西安化学试剂厂；茚三酮040620，分析纯，上海化学试剂总厂；0.2%茚三酮：称取茚三酮0.1 g，50 ml无水乙醇溶解，即得。

BP211电子天平（德国赛多利斯）；SK2200LH超声波振荡仪（上海科导超声仪器有限公司）西贝乐SQ2119C型多功能食品加工机（上海帅佳电子科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 蒜氨酸对照品溶液的制备 精密称取蒜氨酸对照品0.01 g置于10 ml量瓶中，甲醇-水（1∶1）溶解，定容至刻度(每毫升含蒜氨酸对照品1 mg)。

2.1.2 供试品溶液的制备 采用水煮灭活蒜氨酸酶和甲醇灭活蒜氨酸酶法，制备样品，确定样品的制备方法。

方法1：去皮蒜10 g，甲醇50 ml打碎15 s，转移至250 ml锥形瓶中，加入50 ml水，在超声器中超声15 min，精密吸取10 ml，浓缩至5 ml，备用。

方法2：去皮蒜10 g，水煮10 min， 加水50 ml打碎15 s，转移至250 ml锥形瓶中，加入50 ml水，在超声器中超声15 min，精密吸取10 ml，浓缩至5 ml，备用。

2.1.3 展开系统的选择 薄层板：硅胶G薄板；展开剂：正丁醇-正丙醇-冰醋酸-水（3∶1∶1∶1），正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）；显色剂：0.2%茚三酮，在105℃加热5 min后日光下观察。见图1。

2.1.4 蒜氨酸对照品、大蒜样品点样量的选取 蒜氨酸对照品(1 ml)5，10，3 μl点样，确定点样量。大蒜供试品点样量5，10，2 μl点样，确定点样量。

图1 不同制备方法大蒜供试液的薄层色谱图（略）

2.1.5 蒜氨酸对照品与3批大蒜样品同板对照 蒜氨酸对照品(1 mg/ml)点样5 μl，大蒜样品点样量2 μl对照并验证点样量。

2.1.6 12批大蒜样品的薄层色谱图 蒜氨酸对照品(1 mg/ml)点样量5 μl，大蒜样品点样量2 μl，进行薄层展开，喷显色剂后观察。

2.2 结果

2.2.1 样品溶液制备的确定 通过薄层实验确定水煮灭活蒜氨酸酶和甲醇灭活蒜氨酸酶对大蒜样品溶液的制备差别不大。因此遵从简单、快速的原则，确定大蒜供试液的制备方法为：去皮蒜10 g，甲醇50 ml打碎15 s，转移至250 ml锥形瓶中，加入50 ml水，在超声器中超声15 min，精密吸取10.0 ml，浓缩至5 ml，备用。

2.2.2 点样量的选择点样量的确定：蒜氨酸对照品（1 mg/ml）点样量约为5 μl；大蒜供试液点样量约为2 μl。色谱见图2～3。

图2 蒜氨酸对照品薄层色谱图（略）

2.2.3 蒜氨酸对照品和大蒜供试液对照确定点样量 实验确定蒜氨酸对照品点样量5 μl，大蒜样品点样量2 μl，蒜氨酸对照品与大蒜样品供试液在同一位置显相同颜色的斑点。见图4。

2.2.4 蒜氨酸对照品和大蒜3批样品验证点样量和展开系统实验验证了展开系统：正丁醇-正丙醇-冰醋酸-水（3∶1∶1∶1）、展开系统：正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）都较好，蒜氨酸对照品点样量确定为5 μl，大蒜供试液点样量确定为2 μl。见图5。

图3 大蒜供试液不同点样量薄层色谱图（略）

图4 蒜氨酸对照品和大蒜供试液薄层色谱图（略）

图5 蒜氨酸对照品和3批大蒜供试液薄层色谱图（略）

2.2.5 12批大蒜样品薄层色谱图12批大蒜样品均用展开系统：正丁醇-正丙醇-冰醋酸-水（3∶1∶1∶1）、正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）展开；蒜氨酸对照品点样量5 μl，大蒜12批样品点样量2 μl；显色剂为0.2%茚三酮。结果表明，展开系统：正丁醇-正丙醇-冰醋酸-水（3∶1∶1∶1）显色点较深。除此之外无太大差异。从溶剂的配比情况和样品的展开效果，可以选用展开系统正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）。见图6～7。

图6 蒜氨酸对照品和12批大蒜样品供试液薄层色谱图（略）

图7 蒜氨酸对照品和12批大蒜样品供试液薄层色谱图（略）

3 讨论

通过本实验最终确定：以蒜氨酸为对照品，以甲醇灭活蒜氨酸酶制备样品的供试液，采用正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）为展开系统，喷以0.2%茚三酮显色，105℃加热5 min后日光下观察，其中确定蒜氨酸对照品（1 mg/ml）的点样量为5 μl，大蒜供试液的点样量为2 μl，在相同的比移值处，蒜氨酸对照品和大蒜供试液呈现相同颜色的斑点。

文中所建的方法简单可行，重复性好，可用于大蒜药材的质量控制。

【参考文献】

第12篇

[关键词] 茂名地区；病毒灭活血浆；临床应用；效果

[中图分类号] R457.1+4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）04（a）-0038-02

Clinical effect discussion of the plasma by virus inactivation in Maoming area

LIANG Ruogu HUANG Yan LIANG Yanli FU Xueli

Central Blood Station of Maoming City, Guangdong Province, Maoming 525000, China

[Abstract] Objective To explore the clinical effect of the plasma by virus inactivation. Methods 510 cases in Maoming area were randomly divided into two groups. The patients in the observation group were treated with the plasma by virus inactivation, and the patients in the control group were treated with the general fresh frozen plasma. The physiological indicators such as temperature, respiratory, pulse, blood pressure of the patients in two groups were compared before and after transfusion. T lymphocyte subsets of the patients in perioperative period in two groups were compared after transfusion. Results After transfusion, there was no significant difference in the physiological indicators such as temperature, respiratory, pulse, blood pressure between the control group and the observation group, and there was no significant difference before and after transfusion in two groups (P > 0.05). After transfusion, the serum CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD8+ were significantly decreased in the control group during perioperative period (P < 0.05), and there was significant difference between the control group and the observation group (P < 0.05). Conclusion The plasma by virus inactivation has no effect on the physiological indicators of the patients, and may reduce the immunosuppressive effect on patients in perioperative period after transfusion.

[Key words] Maoming area; Plasma by virus inactivation; Clinical application; Effect

血浆是一种临床需求量大，携带病毒风险较高的血液制品[1]。目前，预防病毒感染最有效的方法是对血浆进行病毒灭活处理。为探讨血浆经病毒灭活技术是否会对血浆的临床应用效果造成影响，本研究特以广东茂名地区的255例受血者为研究对象，观察了输注血浆前后机体基本生理指标及围手术期患者免疫功能的影响，并与输注新鲜冰冻血浆的另255例受血者进行对比，以期为病毒灭活血浆的临床应用安全性和有效性的判定提供参考性依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年6月~2010年12月广东省茂名地区10家医院的510例受血者，随机分为观察组和对照组，每组各255例。其中观察组男128例，女127例；年龄18~56岁，平均35.7岁；围术期受血者165例，非围术期受血者140例；对照组男129例，女126例；年龄19~57岁，平均36.1岁；围术期受血者165例，非围术期受血者140例。两组受血者在年龄、性别等方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

观察组患者于治疗过程中输入病毒灭活血浆，对照组患者于治疗过程中输入新鲜冰冻血浆。输注血浆量均为8~10 mL/kg，在1 h内输注完毕。新鲜冰冻血浆及病毒灭活血浆均由广东茂名市中心血站提供。

1.3 观测指标

观察并测量各组受血者输注病毒灭活血浆或新鲜冰冻血浆前后的体温、呼吸、脉搏、血压等生理指标；观察并记录各组围术期受血者输注血浆前后T淋巴细胞亚群的变化情况。

1.4 统计学方法

所有数据资料均采用SPSS 13.0统计学软件包进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各受血者输注血浆前后的体温、呼吸、脉搏、血压等生理指标比较

由表1可知，对照组与观察组受血者输血前体温、呼吸、脉搏、血压等生理指标差异均无统计学意义（P > 0.05）；输注血浆后，对照组与观察组受血者体温、呼吸、脉搏、血压等生理指标亦差异均无统计学意义（P > 0.05）。此外，对照组与观察组中各受血者输血前后体温、呼吸、脉搏、血压等生理指标差异均无统计学意义（P > 0.05）。提示病毒灭活血浆与新鲜冰冻血浆一样，对受血者的基本生理指标的影响不大，无明显输血不良反应发生。

2.2 围术期受血者输注血浆后对T淋巴细胞亚群的影响

由表2可知，对照组围术期受血者经输注血浆后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均显著降低，与输注血浆前比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；观察组围术期受血者经输注血浆后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+亦有所降低，但与输注血浆前比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；观察组围术期受血者经输注血浆后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

表2 围术期受血者输注血浆后对T淋巴细胞亚群的影响

（x±s）

注：与输注前比较，*P < 0.05；与对照组比较，#P < 0.05

3 讨论

新鲜冰冻血浆是自血液采集后6~8 h之内在4℃条件下将血浆分离，并于-50℃中速冻成块，然后于-30℃中保存至临床使用前，有效期为1年。病毒灭活血浆是利用光敏剂-亚甲基蓝可与病毒结合的特性，对血浆进行病毒灭活，并对血浆中残存的白细胞进行滤除，可提高血浆临床应用的安全性，并可有效地控制因血浆引起的病毒传播性疾病的发生率[2]。

T淋巴细胞亚群不仅包括细胞免疫的效应细胞，也包括免疫调节细胞。其中CD3+细胞代表细胞免疫的总体水平；CD4+为辅助/诱导性T淋巴细胞，可协助B淋巴细胞分泌抗体和调节其他T淋巴细胞参与免疫应答；CD8+为抑制性/细胞毒T细胞，可表现出细胞毒活性，并可抑制其他免疫细胞的功能；CD4+/CD8+降低可提示疾病严重或预后不良[3]。有资料报道，围术期输注血液制品可抑制患者机体免疫功能，并推测此方面的影响可能与异体血中的血浆成分和白细胞碎片有关[4]。本研究中，对照组围术期受血者经输注血浆后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均显著降低，而观察组围术期受血者经输注血浆后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+亦有所降低，但与输注血浆前比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；观察组围手术期受血者经输注血浆后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+显著高于对照组（P < 0.05）。说明新鲜冰冻血浆与灭活病毒血浆均对围术期机体免疫功能均具有抑制作用，但因病毒灭活血浆在进行病毒灭活的同时，对血浆中白细胞进行了有效的滤除，减少了因白细胞引起的输血不良反应。

以上研究结果提示，通过对茂名地区病毒灭活血浆与新鲜冰冻血浆的临床应用效果进行对比，病毒灭活血浆和新鲜冰冻血浆均对受血者输血前后体温、呼吸、脉搏、血压等生理指标无明显影响，与新鲜冰冻血浆比较，病毒灭活血浆尚可减轻围术期患者因输注血浆对机体免疫功能的抑制作用。此外，在病毒灭活方面，病毒灭活血浆优于新鲜冰冻血浆，可更加安全地应用于临床。

[参考文献]

[1] 黄彦，尹崇清，梁芬.冰冻机采血小板临床应用效果的观察[J].中国医药导报，2007，4（23）：158-159.

[2] 周锡鹏，许金波，孙萍.亚甲蓝/光化学灭活病毒方法对血浆成分的影响[J].中国实验血液学杂志，2003，11（3）：305-307.

[3] 江虹，李菊湘.T淋巴细胞亚群在恶性肿瘤患者外周血中的变化[J].检验医学与临床，2010，7（13）：1361-1362.

第13篇

一、生化药物的制备方法

生化制药就是将动物、植物或微生物机体内的生物活性物质在其结构和功能不遭破坏的前提下，采用多种生化分离的方法提取、纯化的工艺过程。 ？？生化制药的六个阶段：原料的选择和预处理；组织及细胞的破碎；从破碎的细胞中提取有效成分制成粗品；采用多种生化技术从粗品中将目的物精制出来；干燥及保存；制剂。以上各阶段在不同的生化药物制备中，根据所选材料的不同，可灵活取舍选择使用

生化药物的分离纯化方法主要有五类：根据分子大小和形状不同进行分离，如凝胶过滤法、透析和超滤法、密度梯度离心法等；根据分子的带电性质进行分离，如离子交换层析法、电泳法、等电聚焦法；根据分子极性大小及溶解度不同进行分离，如等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、逆流分配法等；根据配体特异性进行分离，如亲和层析法；根据物质吸附性质不同进行分离，如选择性吸附和吸附层析法。

二、生化药物质量控制研究要点

（一）脏器生化药物

脏器生化药是指从动物来源的生化药物，即从动物的组织、器官、腺体、体液、分泌物以及胎盘、毛、皮、角和蹄甲等提取的药物。脏器生化药物中多数有效成分不明确，多属高分子物质，现在多数还不能用合成的方法生产，有的物质还需要有同时存在的其它物质的协同作用才能发挥较好的生理功能。

（二）脏器生化药物的研究和质量控制要点

因动物的来源复杂（包括动物的种属、健康状况、饲养环境、年龄、采集时间、采集方法等），提取纯化工艺简单，其有效成分的含量和比例会产生较大的差异，因此，单靠质量标准不能全面控制产品的质量，而需要控制源头和工艺过程，再结合质量标准才能较有效地控制产品的质量，确保临床应用的安全性和有效性。换句话说，生化药物的质量控制重点就是要保证生产产品与临床研究样品质量一致，这种质量的一致性单凭质量标准中的质量控制指标不能全面地反映出来（这一点不同于化学药物），必须通过严格地控制源头和工艺过程来实现，这一点类似于生物制品。

1、脏器生化药物研究的一般过程

研究脏器生化药物首先要固定源头（原材料），包括动物的种属、健康状况、饲养环境（封闭饲养）、年龄、采集时间和采集方法等，并制订原材料的质量标准。然后研究合适的提取纯化方法，包括动物源性病毒的灭活和验证，确定原液（或半成品）的生产工艺；研究原液（或半成品）中的主要成分、含量、主成分的比例，以及其它成分的控制方法等，制订原液（或半成品）的质量标准。进行制剂的处方工艺研究，最后制成临床应用的制剂（成品），并进行相应的质量研究，制订成品的质量标准。

2、动物源性病毒的灭活工艺及验证

因组织来源动物的种类不同，其自然携带或者感染病毒的种类也会有所不同，再加上目前动物来源的原材料可控性较差，故必须要对动物源性病毒进行灭活或去除，并对灭活或去除工艺进行验证。灭活或去除动物源性病毒，首先要了解选定动物的病毒情况，重点关注已确认对人类具有感染和致病能力的病毒（例如牛和猪的口蹄疫病毒，猪的乙型脑炎病毒等）及已有试验提示与人类疾病具有关联性的病毒（例如牛腹泻病毒，猪的戊肝病毒等），了解病毒的生物学和对理化因素敏感性等方面的特性。检验原材料中病毒的污染程度和负载量，为采取相应的处理工艺提供研究数据。如果已知原材料中污染了对人感染或者致病的病毒，或者检出了内源性逆转录病毒、具有种属特异性的其它污染病毒，则必须废弃该原材料并妥善处理。

3、脏器生化药物的质量控制要点

根据脏器生化药物研究的一般过程，其质量控制要点主要分以下三个方面：固定源头（原材料），包括动物的种属、健康状况、饲养环境（封闭饲养）、年龄、采集时间和采集方法等，并制订原材料的质量标准；研究合适的提取纯化方法，包括动物源性病毒的灭活和验证，确定原液（或半成品）的生产工艺，研究原液（或半成品）中的主要成分、含量、主成分的比例，以及其它成分的控制方法等，制订原液（或半成品）的质量标准；进行制剂的处方工艺研究，制成临床应用的制剂（成品），并进行相应的质量研究，制订成品的质量标准。总之，脏器生化药物质量控制的核心就是全程控制（从源头到终产品，工艺过程控制和质量标准控制）。

三、生化药物研究应注意的问题

因生化药物的来源复杂，不同的原材料和生产工艺得到的产品的质量会有差异，包括主要成分的含量、比例，以及其它成分的种类和/或含量等，而这些差异往往质量标准反映不出来，从严格意义上说，生化药物没有仿制。所以，在进行生化药物研究时首先要基于“不可仿制”来考虑问题。

1、注重原材料和工艺过程控制，结合质量标准，较全面地控制产品的质量。

2、产品上市后不要轻易更换原材料、变更生产工艺、改换剂型（尤其是水针、粉针、大输液互换）、延长有效期等。如果需要进行以上变更，应针对变更情况对产品的质量、安全性和有效性的影响（这种影响是指产品的真实质量，并不只是质量标准中的质量控制指标）进行相应的研究工作，包括药学、药理毒理和临床研究。

3、因为生化药物的质量是靠全程控制来保证，其原液（或半成品）应不可以自由销售，否则不仅增大了流通环节再次染菌的可能性，又不利于成品全程的质量控制。

4、动物源性病毒的灭活工艺及验证是一个需要研发者、审评人员，以及有关方面的专家共同研究和探讨的课题。因为人们对动物源性病毒的认识，以及动物源性病毒与人类感染性疾病的关系的认识是在逐步地深入，对病毒的灭活和工艺验证也会随着人们认识的提高而不断地趋于更科学和合理。

参考文献：

[1]季敏，谢培晨.我院90例药品不良反应报告分析[J].中国药房，2009，20（23）：1812.？

第14篇

关键词：模似生产；流程；大肠杆菌

中图分类号：G71 文献标识码：A

文章编号：1005-913X（2017）01-0143-02

大肠杆菌疫苗制作的课堂教学在内容设计上，由原来的零散实验如：培养基的制作、菌种的培养、细菌的计数方法、铝胶的配制、配苗和检验等，改为模拟大肠杆菌的生产工艺流程，按照生产岗位的操作标准，以生产上的工序过程，利用理实一体化课堂教学模式，完成大肠杆菌铝胶灭活苗的制作和检验，全过程分基本知识介绍和基本技能操作两部分。

一、基本知识介绍

让学生课下复肠杆菌相关的理论知识，课堂上通过播放工业生产中大肠杆菌苗的视频及课件了解大肠杆菌苗的整体制作过程；同时讲清大肠杆菌每道工序操作的要点及注意事项。让学生明晰在生产岗位所要从事的工作。

二、基本技能操作训练

整个操作过程分6道工序完成。将学生分成6个小组，按工序的顺序进行实施。完成每一道工序时，按生产上的操作标准（模拟生产要求）执行，同时按要求检验每道工序作品是否合格，合格后方可执行下一道工序。

（一）菌种的选择与鉴定

可选用购买的大肠杆菌标准菌种或按常规制作血液琼脂平板或营养琼脂平板，分离培养含大肠杆菌的病料（死于大肠杆菌病的动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物），经伊红美兰琼脂平板培养，挑选出黑色带金属光泽菌落；经靛基质试验、甲基红试验，结果呈阳性，VP试验，结果呈阴性；细菌经涂片、革兰氏染色、显微镜检查，结果呈中等大小革兰氏阴性（红色）的杆菌；经因子血清鉴定确定血清型后，可作为标准菌种使朋。菌种可保存在琼脂斜面中（短期使用）或采用冷冻干燥法保存（长期使用），以免发生变异。

（二）种子培养及菌液的制备

取上述大肠杆菌菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24 h，挑取单个典型菌落，移植于琼脂斜面中作为种子。用灭菌吸管取5 mL马丁肉汤加人大肠杆菌的琼脂斜面中，用接种环刮取下菌体，研磨稀释后倒入另一只灭菌试管中，置37%培养18～24h后，作为一级种子。将一级种子按10%的量再次接种马丁肉汤中进一步扩大培养后，做为配苗菌液。取配苗菌液少量装于灭菌试管中做菌数计数，其余菌液灭活待做配苗用（强毒细菌须在杀菌后，再行计数）。

（三）采用活菌计数法或比浊计数法对配苗菌液进行计数

活菌计数法可选用平板表面涂布法或倾注平板培养法。

1.活菌计数。活菌计数法是将待测菌液精确地作一系列稀释，然后吸取一定量某稀释度的菌液样品，选用适当的方法进行培养。一个活的细菌经培养后，在平板培养基上大量繁殖可形成一个肉眼可见的菌落，从长出的菌落数及稀释倍数，换算出每毫升待测菌液中的活菌数即细菌总数。

（1）平板表面涂布法

制备营养琼脂平板。用商品化的营养琼脂粉，按常规方法制作营养琼脂平板8个，用前将营养琼脂平板倒置在37℃温箱中烘干1h，使其表面的水分蒸发。取出后将其分为4组，每组2个平板，第4组为对照组。

稀释菌液。根据待测菌液中菌数含量的多少，在做培养之前，用普通肉汤或生理盐水将被测菌液作10倍递进稀释即10-1、10-2、10-3、10-4……。稀释方法为：取灭菌试管6～10支，分别标明稀释倍数；每支试管中加入灭菌生理盐水或肉汤9mL；另取灭菌吸管吸取待测菌液1mL，加入第1支试管中，充分混匀，稀倍数为10-1；从第1支试管中吸取稀释菌液1mL加入到第2支试管中，充分混匀，稀释倍数为10-2，如此一直稀释到最后一支试管。

涂样。另取三支灭菌吸管，分别吸取后三个稀释度试管中的菌悬液0.1mL，对应加在3组营养琼脂平板上，每一个稀释度菌液接种2个平板，用灭菌L形玻璃棒将菌液涂匀。在平皿底作好与试管稀释度相同的标记。第4组作对照，加稀释液0.1mL。

培养。将上述各组的平板置37℃温箱中培养1～2h，使菌液渗透于培养基内，然后倒置培养24h。

计数。从培养箱中取出培养皿，用肉眼观察计算每个平板上的菌落数，必要时可用5-10倍放大镜观察，以免遗漏。一般选择菌落数在30～300之间的平皿用以计数，每个稀释度应取其菌落平均数，并求3个稀释度之和再取其平均值，得出每毫升待测菌液所含的活菌数。按下式计算活菌数。

活菌数/mL=2个平板平均菌落数×10×稀释倍数。举例：在10-8稀释的平板中所得平均菌落数为85个。计算结果：85×10×108=8.5×1010个活菌/mL

说明：对照组应无菌落生长，否则试验结果不准确，应重做。

前一稀释度的平均菌落数应大致为后一稀释度平均菌落数的10倍左右，如差别太大，则说明试验不准确，应重做。

（2）倾注平板培养法

待检菌液稀释方法同上。分别吸取后三个稀释度试管中的菌悬液1mL加在灭菌平皿中，然后取预先融化且冷却至50℃～55℃的营养琼脂培养基分别倾入上述平皿中，立即摇匀平放，待其冷凝后，置37℃培养24h。统计平皿上长出的菌落数，乘以稀释倍数，计算出三个稀释度的平均数，即为每毫升待测菌液所含的活菌数。

2.比浊计数法

比浊计数法是通过对比待测菌液与标准比浊管的浊度，求出大致的细菌总数。标准比浊管由国家生物制品检定部门提供，每套包括一支细菌比浊标准管、数支对照空管和一张比浊用的图片，说明书上注明标准管相当于不同细菌种类的菌数，使用期为1年。也可自行制作标准比浊管。比浊计数法节时方便，但误差大。

（1）标准比浊管的制备

选取口径和管壁厚薄一致的洁净试管10支，分别加入1%氯化钡溶液，然后加入1%浓硫酸溶液，使各管总液量为10mL，加塞并用石蜡封固，保存备用。各管加液量及浊度单位见表1。

（2）比浊方法

取待测菌液1mL加入空试管中，与标准管并列紧贴在图片前，使两管受光均匀，透过两管管壁对比观察，目测图片的清晰度。比浊时标准管与待测菌液管应经常摇匀。若待测菌液管较标准管过浓时，可在待测管中加适量生理盐水进行调整，直至两管背后的图片清晰度相同为止。

例如：测定大肠杆菌的菌数，若1mL菌液加入4mL的生理盐水后，与标准管的浊度相同，即表示该菌液经5倍稀释后相当于标准管。大肠杆菌标准管的菌数相当于8亿个/mL，故被测菌数为8×5=40亿个/mL，

（四）灭活与检验

灭活在疫苗制造上是将细菌及其产生的毒素用物理或化学方法处理，使其丧失毒力或致病性，而保留其抗原性的过程。灭活时，根据细菌的特性选用有效的灭活剂和最适的灭活条件。甲醛是大肠杆菌灭活中最有效的灭活剂，向上述培养的大量菌液中加人终浓度0.3%甲醛溶液，置37℃温箱灭活24～48h。取少量灭活后菌液接种于营养琼脂斜面培养3天，检查无细菌生长，证明灭活完全。

（五）配制氢氧化铝胶与配苗

将灭活后的菌液按5份菌液加入1份氢氧化铝胶进行配苗，大肠杆菌的菌液浓度为100亿-400亿个/ml。配苗时应充分振荡，加入0.01%硫柳汞防腐，置2～8℃静置2-3天，抽弃上清液，浓缩成全量的60%。塞上胶塞，用固体石蜡溶化封口，贴上标签，注明菌苗名称，使用前充分摇匀。在菌液中加入氢氧化铝胶（佐剂），是为了增强免疫效果。

氢氧化铝胶的制作：先用去离子水将无水A1Cl3配成25%溶液，加热溶化，使用时稀释成8%的溶液；另配4%NaOH溶液，将两种溶液同时加温至56℃～60℃。在此温度下，将NaOH溶液缓慢加入于8%AlCl3溶液中，边加边搅拌，当pH值达5.6-6.0时，即为终点，继续搅拌10分钟，置高压灭菌器内121.3℃灭菌20分钟，氢氧化铝胶呈透明略带乳光液体，保存期不超过3个月。

（六）成品检验

1.无菌检查

取1mlX胶苗加入49ml硫乙醇酸盐培养基中，培养72h后，移植于葡萄糖蛋白胨水培养基中和酪胨琼脂培养基上培养5天，检查无细菌生长。

2.安全检验

取1月龄健康易感鸡5只，各颈部皮下或肌肉注射铝胶苗2ml，同时设不接种疫苗的对照组，与免疫组同条件饲养，观察14天，应健康存活，剖检时，内脏器官及注射部位应无损伤。

3.效力检验

第15篇

灭活疫苗与活疫苗

菌苗和疫苗都是由微生物制成的生物制剂，接种于人体后，可诱生特异性免疫。我国习惯上把细菌、螺旋体生物制剂称为菌苗，把病毒、立克次体、衣原体等的生物制剂称为疫苗。

通常所用的疫(菌)苗有两类：一是灭活疫(菌)苗，即把微生物培养物用物理或化学方法杀死而制成。二是减毒活疫(菌)苗，即将有毒力的微生物用人工定向变异的方法使其毒力减弱，或从自然界筛选出来的弱毒或无毒微生物制成活疫(菌)苗。

灭活疫(菌)苗的优点是：在使用上可单独注射，也可几种疫苗按一定比例混合注射，较易保存。保存期限为1年，注射后较安全。缺点是：注射次数多，初种至少需接种2次以上，注射剂量较大。可能出现发热、全身或局部反应，其免疫效果也较差，不持久，常需数月或每年增强免疫一次。

活疫(菌)苗的优点是：其免疫作用较强，一般只需接种1次。接种剂量也较小，接种后反应小或无，接种后的免疫效果可靠而持久，一般可维持1～5年。缺点是：一般只宜单独使用；疫苗不易保存，在普通冰箱内两周即失效。

要特别注意制备活疫苗的病原减毒株的稳定性以及致癌等问题。因此，研制新发病原的疫苗时，由于对该病原的特殊性尚未完全了解，应先从制备灭活疫苗开始。

基因工程疫苗

基因工程是按照人类的愿望，通过基因重新组合得到新的生物品种的一种技术。这种基因工程方法制备生产的疫苗称为基因工程疫苗。以乙肝疫苗为例，就是用基因剪切技术将调控乙肝表面抗原(HB―sAg)的这段基因剪切下来，装到一个表达载体中，表达载体可以把这段基因的功能发挥出来；再把这种表达载体转移到受体细胞内，如大肠杆菌或酵母菌等，最后再通过这些大肠杆菌或酵母菌的快速繁殖，产生出大量我们所需的乙肝疫苗。

过去，乙肝疫苗的来源，是以乙肝病毒携带者的血液为原料，把HB－sAg提取出来制成的，制造过程复杂，价格也较贵。而且这种血源性疫苗也不够安全，它可能混有其他病毒的污染。同时，血液来源也是极有限的，远不能满足全国的需要。基因工程疫苗的问世解决了这一难题。