干细胞培养技术范文

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第1篇

目的： 利用简化无血清培养基和连续传代法，从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs)，观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点. 用p75， GFAP，Peripherin，αActin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系. 方法： 将新生1， 5 d的小鼠肠管制成单细胞悬液，接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养，连续传代培养并观察克隆球的形成过程. 将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中，观察其分化现象. 用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达. 结果： 成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞. 结论： 成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.

【关键词】 肠神经嵴干细胞 小鼠 细胞培养技术 细胞分化 Hirschsprung病

0引言

应用神经干细胞治疗某些神经系统的损伤和退行性疾病，经过较长时间的实践已被证明是行之有效的［1］. 肠神经嵴干细胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神经管背侧，具有干细胞特性［2］，将其用于治疗先天性巨结肠症及肠神经系统干细胞疾病的研究已引起人们的关注，本实验着重进行GNCSCs的基础研究，为临床应用建立理论基础.

1材料和方法

1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，体质量不拘，西安交通大学医学实验动物中心提供. ① DMEM/F12完全培养基（Gibco）组成：B27添加剂（Gibco），N2添加剂（Gibco），重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF， vitrogen)， β巯基乙醇（Sigma），青霉素和链霉素（华北制药）. ② 促分化培养基组成：DMEM/F12完全培养基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ胶原酶（Sigma），左旋多聚赖氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武汉博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗体(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗体（DAKO），鼠抗小鼠αActin单克隆抗体（Sigma）SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗为TRITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉).

1.2方法

1.2.1取材、克隆球的培养颈椎脱臼法处死2组小鼠，将其肠管放入Hanks，清洗，机械分散肠管组织，胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶分别消化肠管组织30 min，10 min，终止消化后反复吹打制成单细胞悬液，用200目，400目的滤网过滤，以800 r/min 离心 5 min，弃上清，用预先配置的无血清完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数活细胞，以 6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，添加培养基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，饱和湿度培养箱中水平放置，贴壁培养. 原代孵育24 h后弃去漂浮的死细胞，以2/3量换液，孵育3 d后进行传代，以6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，继续孵育40~48 h后再次传代，如有细胞团块形成则以1代/1~2 d的速度传代，3代之后可形成圆形的克隆球.

1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培养基重悬传代5次后的克隆球，接种于放置有预先包被左旋多聚赖氨酸盖玻片的35 mm培养皿内，每皿2 mL，动态观察克隆球的分化情况.

1.2.3克隆球及其分化细胞特异性标志物的染色应用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗体分别检测克隆球及其分化细胞系的性质，封片后分别用光学显微镜和激光共焦显微镜取图.

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2结果

2.1克隆球的生长状况接种初期，倒置显微镜下观察到单细胞和一些呈半球状或不规则的细胞团. 孵育24 h后，贴壁细胞胞呈圆形，胞体小，折光性好，部分贴壁细胞胞体增大，折光性增强，出现分裂相，形成2～5个细胞的细胞团，另一部分呈聚集生长. 3 d后形成十几或数十个细胞构成的克隆球(图1A)，克隆球增大的同时向周围伸出放射状的细胞索，形成较小的次级克隆，这些克隆球形态完整，折光性减弱，周边界线清晰，但其中心密集，界限不清，无法观察到完整的细胞结构 （图1B）. 重新传代培养，可观察到细胞胞体增大，出现分裂相的克隆球数量逐渐增多，杂质细胞减少，在连续传代过程中克隆球逐渐纯化.

2.2克隆球的分化接种含血清培养基12 h后，可见有细胞从克隆球中迁出，迁出的细胞贴壁生长；24 h后克隆球变扁，迁移出的细胞增多，相差显微镜下难以分别形态；48 h后贴壁细胞数量明显增加，逐渐形成单细胞层且细胞形态多元化.

2.3克隆球及其分化细胞系的免疫染色免疫细胞化学方法进行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（图1C，图2， 3）.

3讨论

许多研究表明GNCSCs在ENS的发生和发育起关键作用［3-4］. 目前HSCR的病因与RET等8种基因密切相关［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、迁徙及分化等功能发生障碍，受累肠道的相应神经节出现缺失，表明先天性巨结肠可能是一种干细胞疾病. 由于HSCR及肠神经系统干细胞性疾病在手术治疗后仍遗留有严重的并发症，因此用干细胞来进行临床治疗已成为研究的热点和重点. 鉴于胚胎干细胞的来源限制及免疫排斥问题，成体GNCSCs的研究将为今后的移植试验提供新契机.

GNCSCs的培养方法建立在中枢神经干细胞的基础上. 依据神经干细胞经典的培养方法，再结合GNCSCs“收获率”低、难以分离纯化的特点，联合应用简化的特殊培养剂和神经干细胞培养方法进行体外培养. 连续传10代后，GNCSCs的相对比例明显增加，这种体外培养的方法能有效地分离和纯化GNCSCs，但并不能完全消除其他细胞. 如果继续传代，其纯化程度越高，后续的试验效果将更佳. 连续传代不仅纯化了GNCSCs，还证实了干细胞的自我更新特性. 在体外培养干细胞时，培养条件稍有变化可导致分化机制的启动，因此采用血清促分化法诱导GNCSCs分化既简单又可靠. 通过免疫染色，证实了GNCSCs分化细胞的类型，同时显示了分化的亚型神经元及神经胶质细胞的形态，并表明了成体干细胞的多向分化能力.

参考文献

［1］ 杨帆，杨树源. 神经干细胞研究进展及临床应用前景［J］.医学综述， 2002；8(8):491-493.

［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.

［3］ Natarajan D， Grigoriou M， MarcosGutierrez CV， et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture［J］. Development 1999， 126(1):157-168.

第2篇

关键词：  大鼠 肌源性干细胞 体外培养

    近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干细胞起源于胚胎血管祖细胞，在适当的微环境中，可分化为血细胞、成骨细胞、神经细胞等不同胚层的组织细胞，MDSCs的表面标志已被初步认识，对其分化的研究，及其分离纯化的技术研究正在进一步深入 ［1-3］。本实验经过技术改良，通过体外原代培养获得高纯度MDSCs，为组织工程的临床应用奠定基础。

    1  材料与方法

    1.1  材料  I型胶原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培养基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及链霉素(国产)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（异硫氰酸荧光黄）(武汉博士德)。

    1.2  原代MDSCs的取材、分离纯化  参照参考文献所报道的方法［4，5］ ，选用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的医用酒精中，5 min×3次，处死并消毒；无菌条件下取前肢肱三头肌，后肢腓肠肌，尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织：用PBS液漂洗2次，将肌组织移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜状；加入1%的Ⅰ型胶原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍体积的胎牛血清中止消化，反复吹打后滤过200目的筛网，收集滤液，1 000 r/ min离心7 min，室温静置5 min弃上层液，细胞团块用生长培养基(含20%胎牛血清的DMEM)重悬，移入培养瓶中，该培养瓶称为PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，此为PP2。此后连续4 d每隔24 h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3～PP6。PP1～PP5弃去不用，PP6用于进一步的鉴定实验，细胞在达到约70%汇合时必须传代。

    1.3  MDSCs生长曲线的绘制  取PP6传至第2代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个／孔接种于24孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共7日根据记数结果绘制细胞生长曲线。

     2008年2月，29(1)1.4  MDSCs的免疫荧光鉴定  取PP6中的MDSCs培养到第3代时，把细胞培养在6孔板中的盖玻片上，第5 d细胞生长达70%～80%汇合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，照相。

    2  结    果

    2.1  分离细胞的形态、生长特性  PP1、PP2（图1A）贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞，其余是宽大而呈星形或不规则的杂细胞，增殖较快，1周左右即可完全融合。PP3（图1B）开始即有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少。随着纯化的继续，圆形或短梭形细胞的数量明显增加，到PP6（图1C）时超过80%，这些细胞贴壁后绝大多数为梭形或纺锤形， 有两极， 体积小， 胞核折光性强。少数细胞呈多角形， 有突起。随培养时间延长，细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，若不加以控制及时传代，细胞可迅速融合成细胞链或聚成团块生长，细胞增殖速度减慢， 细胞相互融合， 形成肌小管（图1D）。图1A  PP1、PP2贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞和宽大而呈星形或不规则的杂细胞×200 

    图1B  PP3有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少×200

    图1C  PP6圆形或短梭形细胞的数量明显增加，超过80% ×200

    图1D  细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，细胞增殖速度减慢，×200

    图1E、F  细胞特异性desmin染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞发出绿色荧光×400

    2.2  生长曲线  第2日开始进入对数生长期，第5日后由于接触抑制，增殖速度减慢(图2)。图2  传代MDSCs的生长曲线

    2.3  对PP6的细胞表型鉴定  肌源性干细胞本身具有特征性的外形， 其胞浆中含有结蛋白(desmin) 可通过细胞免疫荧光方法鉴定。本实验采用小鼠抗大鼠desmin一抗对肌源性干细胞进行鉴定，细胞质desmin染色阳性（图1E，1F），细胞胞质呈现绿色荧光。观察500个细胞，90%为desmin阳性。

3  讨    论

第3篇

【关键词】 大鼠 肌源性干细胞 体外培养

Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods

By two-step method， the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin， and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions

MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.

Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro

近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干细胞起源于胚胎血管祖细胞，在适当的微环境中，可分化为血细胞、成骨细胞、神经细胞等不同胚层的组织细胞，MDSCs的表面标志已被初步认识，对其分化的研究，及其分离纯化的技术研究正在进一步深入 ［1-3］。本实验经过技术改良，通过体外原代培养获得高纯度MDSCs，为组织工程的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 I型胶原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培养基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及链霉素(国产)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（异硫氰酸荧光黄）(武汉博士德)。

1.2 原代MDSCs的取材、分离纯化 参照参考文献所报道的方法［4，5］ ，选用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的医用酒精中，5 min×3次，处死并消毒；无菌条件下取前肢肱三头肌，后肢腓肠肌，尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织：用PBS液漂洗2次，将肌组织移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜状；加入1%的Ⅰ型胶原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍体积的胎牛血清中止消化，反复吹打后滤过200目的筛网，收集滤液，1 000 r/ min离心7 min，室温静置5 min弃上层液，细胞团块用生长培养基(含20%胎牛血清的DMEM)重悬，移入培养瓶中，该培养瓶称为PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，此为PP2。此后连续4 d每隔24 h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3～PP6。PP1～PP5弃去不用，PP6用于进一步的鉴定实验，细胞在达到约70%汇合时必须传代。

1.3 MDSCs生长曲线的绘制 取PP6传至第2代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个／孔接种于24孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共7日根据记数结果绘制细胞生长曲线。

2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫荧光鉴定 取PP6中的MDSCs培养到第3代时，把细胞培养在6孔板中的盖玻片上，第5 d细胞生长达70%～80%汇合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，照相。

2 结

果

2.1 分离细胞的形态、生长特性 PP1、PP2（图1A）贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞，其余是宽大而呈星形或不规则的杂细胞，增殖较快，1周左右即可完全融合。PP3（图1B）开始即有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少。随着纯化的继续，圆形或短梭形细胞的数量明显增加，到PP6（图1C）时超过80%，这些细胞贴壁后绝大多数为梭形或纺锤形， 有两极， 体积小， 胞核折光性强。少数细胞呈多角形， 有突起。随培养时间延长，细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，若不加以控制及时传代，细胞可迅速融合成细胞链或聚成团块生长，细胞增殖速度减慢， 细胞相互融合， 形成肌小管（图1D）。图1A PP1、PP2贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞和宽大而呈星形或不规则的杂细胞×200

图1B PP3有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少×200

图1C PP6圆形或短梭形细胞的数量明显增加，超过80% ×200

图1D 细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，细胞增殖速度减慢，×200

图1E、F 细胞特异性desmin染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞发出绿色荧光×400

2.2 生长曲线 第2日开始进入对数生长期，第5日后由于接触抑制，增殖速度减慢(图2)。图2 传代MDSCs的生长曲线

2.3 对PP6的细胞表型鉴定 肌源性干细胞本身具有特征性的外形， 其胞浆中含有结蛋白(desmin) 可通过细胞免疫荧光方法鉴定。本实验采用小鼠抗大鼠desmin一抗对肌源性干细胞进行鉴定，细胞质desmin染色阳性（图1E，1F），细胞胞质呈现绿色荧光。观察500个细胞，90%为desmin阳性。

3 讨

论

近年在骨骼肌中发现了一群被称为MDSCs的细胞群体。预期它们在组织工程应用领域特别是细胞移植和基因治疗方面前景广阔。国外已在进行大量MDSCs介导的相关的基因治疗和组织工程的动物实验［6-8］，并取得了较明显的效果。因此建立和完善MDSCs培养方法，获取高纯度的细胞具有重要实用价值。

骨骼肌细胞是由胚胎的生肌节和各处的间充质细胞分化而成，在肌膜和基膜之间有一种体积较小的扁平成立方形细胞，称为卫星细胞［9］，是保留在成年骨骼肌内具有增殖分化能力的单潜能成肌干细胞，这种组织特异性的干细胞在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持中起重要作用。有证据表明新近发现的肌源性干细胞(MDSCs)是一群与卫星细胞完全不同的细胞群。可能是一群未向任何方向定型的原始干细胞。

lee等［7］31-37从骨骼肌细胞中发现了MDSCs，与卫星细胞相比，其具有更多的分化潜能，不仅能分化成骨骼肌纤维，促进肌组织再生，还能分化成成骨细胞，促进骨骼愈合［5］，被认为是卫星细胞的前体。贴壁前的MDSCs呈小而圆的球形，折光性强，刚贴壁仍为圆形，贴壁后的MDSCs呈纺锤形，延迟分瓶时会融合成成熟的多核肌管，这与成纤维细胞不同。preplate技术利用差速贴壁获取MDSCs，其原理是成纤维细胞、内皮细胞的贴壁能力强于卫星细胞，卫星细胞的贴附能力又强于MDSCs，4 d内即可完全贴壁而此时MDSCs仍处于悬浮状态［6］1085-1100，实验中发现，组织块中加入胶原酶后很快就变成了乳糜状，胰酶对组织具有很好的离散作用，再通过反复吹打可将细胞从基膜中分离出来，得到的细胞为成纤维细胞、白细胞、内皮细胞、卫星细胞及MDSCs的混合物，利用差速贴壁法4 d后处于悬浮状态的细胞移出培养即为纯化的MDSCs。MDSCs本身具有特征性外形，我们通过结蛋白desmin染色鉴定其肌源性，通过其多向分化的能力来鉴定其干细胞特性。实验中我们还发现，随着乳鼠出生天数的延长，所取得的MDSCs的数量和活力逐渐下降，但出生时间太短，活力太差，又不利于取材。新出生3～5 d的大鼠最适宜进行原代取材。

结蛋白（desmin）是中间丝蛋白的一种，是成肌分化的早期的标志，常作为肌源性的标志，虽然成纤维细胞与骨骼肌内血管平滑肌细胞也产生结蛋白，但此细胞中结蛋白含量低，与抗体产生弱阳性反应，且仅有15％的desmin阳性率［10］，而通过本方法获取的MDSCs中desmin阳性率高达90%，由此可进行初步鉴别。

MDSCs属于成体干细胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点，在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。通过对常规技术的改良，本研究建立了一种稳定高效的新生大鼠MDSCs分离纯化技术，并成功对MDSCs进行了鉴定，为MDSCs在基因治疗和组织工程的临床应用打下了基础。

参考文献

［1］ Torrente Y，Tremblay J P，Pisati F，et a1.Intraarterial injection of muscle-derived CD34 (+)Sca-1(+) stem cells restores dystrophin in mdx mice［J］.J Cell Biol，2001，152(2)：335-348.

［2］ Torrente Y，Camirand G，Pisati F，et a1.Identification of a putative pathway for the muscle homing of stem ceils in a muscular dystrophy model［J］.J Cell Biol，2003，162(3)：511-520.

［3］ Cao B，Bruder J，Kovesdi I，et a1.Muscle stem cells can act as antigen-presentingcells.implication for gene therapy［J］.Gene Ther，2004，11：1321－1330.

［4］ Thomas A ， R ， Helen M ， B. Primary mouse myoblast purification ， characterization ， and transplantation for cell mediated gene therapy［J］. J Cell Bio ，1994 ，125 :1275

［5］ Zhuqing Qu，Deaaasy B，Jankowski R，et al.Identification of anovel population of muscle stem cells in mice:potential for Muscle regeneration ［J］.J Cell Biol，2002，(157):851-864.

［6］ Lee JY，Qu-Petersen Z，Cao B.et a1.Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing［J］.J cell Biol，2000，150，1085-l100.

［7］ Lee JY，Cannon TW，Pruehnie R，et a1.The effects of periurethral muscle-derived stem cell injeetion on leak point pressure in a rat model of Stress urinary Inoonth lce［J］.Int urogynecol J，2003，l4：3l-37.

［8］ Deasy BM，Jankow ski RJ，Huard J.M usele-derived stem cells：characterization and potential for cell-mediated therapy［J］.Blood Cells Molecules Diseases，2001，27：924-933.