干细胞培养技术范文
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第1篇
目的： 利用简化无血清培养基和连续传代法，从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs)，观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点. 用p75， GFAP，Peripherin，αActin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系. 方法： 将新生1， 5 d的小鼠肠管制成单细胞悬液，接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养，连续传代培养并观察克隆球的形成过程. 将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中，观察其分化现象. 用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达. 结果： 成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞. 结论： 成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.
【关键词】 肠神经嵴干细胞 小鼠 细胞培养技术 细胞分化 Hirschsprung病
0引言
应用神经干细胞治疗某些神经系统的损伤和退行性疾病，经过较长时间的实践已被证明是行之有效的［1］. 肠神经嵴干细胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神经管背侧，具有干细胞特性［2］，将其用于治疗先天性巨结肠症及肠神经系统干细胞疾病的研究已引起人们的关注，本实验着重进行GNCSCs的基础研究，为临床应用建立理论基础.
1材料和方法
1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，体质量不拘，西安交通大学医学实验动物中心提供. ① DMEM/F12完全培养基（Gibco）组成：B27添加剂（Gibco），N2添加剂（Gibco），重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF， vitrogen)， β巯基乙醇（Sigma），青霉素和链霉素（华北制药）. ② 促分化培养基组成：DMEM/F12完全培养基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ胶原酶（Sigma），左旋多聚赖氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武汉博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗体(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗体（DAKO），鼠抗小鼠αActin单克隆抗体（Sigma）SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗为TRITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉).
1.2方法
1.2.1取材、克隆球的培养颈椎脱臼法处死2组小鼠，将其肠管放入Hanks，清洗，机械分散肠管组织，胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶分别消化肠管组织30 min，10 min，终止消化后反复吹打制成单细胞悬液，用200目，400目的滤网过滤，以800 r/min 离心 5 min，弃上清，用预先配置的无血清完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数活细胞，以 6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，添加培养基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，饱和湿度培养箱中水平放置，贴壁培养. 原代孵育24 h后弃去漂浮的死细胞，以2/3量换液，孵育3 d后进行传代，以6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，继续孵育40~48 h后再次传代，如有细胞团块形成则以1代/1~2 d的速度传代，3代之后可形成圆形的克隆球.
1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培养基重悬传代5次后的克隆球，接种于放置有预先包被左旋多聚赖氨酸盖玻片的35 mm培养皿内，每皿2 mL，动态观察克隆球的分化情况.
1.2.3克隆球及其分化细胞特异性标志物的染色应用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗体分别检测克隆球及其分化细胞系的性质，封片后分别用光学显微镜和激光共焦显微镜取图.
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2结果
2.1克隆球的生长状况接种初期，倒置显微镜下观察到单细胞和一些呈半球状或不规则的细胞团. 孵育24 h后，贴壁细胞胞呈圆形，胞体小，折光性好，部分贴壁细胞胞体增大，折光性增强，出现分裂相，形成2～5个细胞的细胞团，另一部分呈聚集生长. 3 d后形成十几或数十个细胞构成的克隆球(图1A)，克隆球增大的同时向周围伸出放射状的细胞索，形成较小的次级克隆，这些克隆球形态完整，折光性减弱，周边界线清晰，但其中心密集，界限不清，无法观察到完整的细胞结构 （图1B）. 重新传代培养，可观察到细胞胞体增大，出现分裂相的克隆球数量逐渐增多，杂质细胞减少，在连续传代过程中克隆球逐渐纯化.
2.2克隆球的分化接种含血清培养基12 h后，可见有细胞从克隆球中迁出，迁出的细胞贴壁生长；24 h后克隆球变扁，迁移出的细胞增多，相差显微镜下难以分别形态；48 h后贴壁细胞数量明显增加，逐渐形成单细胞层且细胞形态多元化.
2.3克隆球及其分化细胞系的免疫染色免疫细胞化学方法进行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（图1C，图2， 3）.
3讨论
许多研究表明GNCSCs在ENS的发生和发育起关键作用［3-4］. 目前HSCR的病因与RET等8种基因密切相关［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、迁徙及分化等功能发生障碍，受累肠道的相应神经节出现缺失，表明先天性巨结肠可能是一种干细胞疾病. 由于HSCR及肠神经系统干细胞性疾病在手术治疗后仍遗留有严重的并发症，因此用干细胞来进行临床治疗已成为研究的热点和重点. 鉴于胚胎干细胞的来源限制及免疫排斥问题，成体GNCSCs的研究将为今后的移植试验提供新契机.
GNCSCs的培养方法建立在中枢神经干细胞的基础上. 依据神经干细胞经典的培养方法，再结合GNCSCs“收获率”低、难以分离纯化的特点，联合应用简化的特殊培养剂和神经干细胞培养方法进行体外培养. 连续传10代后，GNCSCs的相对比例明显增加，这种体外培养的方法能有效地分离和纯化GNCSCs，但并不能完全消除其他细胞. 如果继续传代，其纯化程度越高，后续的试验效果将更佳. 连续传代不仅纯化了GNCSCs，还证实了干细胞的自我更新特性. 在体外培养干细胞时，培养条件稍有变化可导致分化机制的启动，因此采用血清促分化法诱导GNCSCs分化既简单又可靠. 通过免疫染色，证实了GNCSCs分化细胞的类型，同时显示了分化的亚型神经元及神经胶质细胞的形态，并表明了成体干细胞的多向分化能力.
参考文献
［1］ 杨帆，杨树源. 神经干细胞研究进展及临床应用前景［J］.医学综述， 2002；8(8):491-493.
［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.
［3］ Natarajan D， Grigoriou M， MarcosGutierrez CV， et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture［J］. Development 1999， 126(1):157-168.
第2篇
关键词： 大鼠 肌源性干细胞 体外培养
近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干细胞起源于胚胎血管祖细胞，在适当的微环境中，可分化为血细胞、成骨细胞、神经细胞等不同胚层的组织细胞，MDSCs的表面标志已被初步认识，对其分化的研究，及其分离纯化的技术研究正在进一步深入 ［1-3］。本实验经过技术改良，通过体外原代培养获得高纯度MDSCs，为组织工程的临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 I型胶原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培养基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及链霉素(国产)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（异硫氰酸荧光黄）(武汉博士德)。
1.2 原代MDSCs的取材、分离纯化 参照参考文献所报道的方法［4，5］ ，选用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的医用酒精中，5 min×3次，处死并消毒；无菌条件下取前肢肱三头肌，后肢腓肠肌，尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织：用PBS液漂洗2次，将肌组织移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜状；加入1%的Ⅰ型胶原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍体积的胎牛血清中止消化，反复吹打后滤过200目的筛网，收集滤液，1 000 r/ min离心7 min，室温静置5 min弃上层液，细胞团块用生长培养基(含20%胎牛血清的DMEM)重悬，移入培养瓶中，该培养瓶称为PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，此为PP2。此后连续4 d每隔24 h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3～PP6。PP1～PP5弃去不用，PP6用于进一步的鉴定实验，细胞在达到约70%汇合时必须传代。
1.3 MDSCs生长曲线的绘制 取PP6传至第2代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个／孔接种于24孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共7日根据记数结果绘制细胞生长曲线。
2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫荧光鉴定 取PP6中的MDSCs培养到第3代时，把细胞培养在6孔板中的盖玻片上，第5 d细胞生长达70%～80%汇合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，照相。
2 结 果
2.1 分离细胞的形态、生长特性 PP1、PP2（图1A）贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞，其余是宽大而呈星形或不规则的杂细胞，增殖较快，1周左右即可完全融合。PP3（图1B）开始即有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少。随着纯化的继续，圆形或短梭形细胞的数量明显增加，到PP6（图1C）时超过80%，这些细胞贴壁后绝大多数为梭形或纺锤形， 有两极， 体积小， 胞核折光性强。少数细胞呈多角形， 有突起。随培养时间延长，细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，若不加以控制及时传代，细胞可迅速融合成细胞链或聚成团块生长，细胞增殖速度减慢， 细胞相互融合， 形成肌小管（图1D）。图1A PP1、PP2贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞和宽大而呈星形或不规则的杂细胞×200
图1B PP3有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少×200
图1C PP6圆形或短梭形细胞的数量明显增加，超过80% ×200
图1D 细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，细胞增殖速度减慢，×200
图1E、F 细胞特异性desmin染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞发出绿色荧光×400
2.2 生长曲线 第2日开始进入对数生长期，第5日后由于接触抑制，增殖速度减慢(图2)。图2 传代MDSCs的生长曲线
2.3 对PP6的细胞表型鉴定 肌源性干细胞本身具有特征性的外形， 其胞浆中含有结蛋白(desmin) 可通过细胞免疫荧光方法鉴定。本实验采用小鼠抗大鼠desmin一抗对肌源性干细胞进行鉴定，细胞质desmin染色阳性（图1E，1F），细胞胞质呈现绿色荧光。观察500个细胞，90%为desmin阳性。
3 讨 论
第3篇
【关键词】 大鼠 肌源性干细胞 体外培养
Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods
By two-step method， the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin， and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions
MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.
Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro
近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干细胞起源于胚胎血管祖细胞，在适当的微环境中，可分化为血细胞、成骨细胞、神经细胞等不同胚层的组织细胞，MDSCs的表面标志已被初步认识，对其分化的研究，及其分离纯化的技术研究正在进一步深入 ［1-3］。本实验经过技术改良，通过体外原代培养获得高纯度MDSCs，为组织工程的临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 I型胶原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培养基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及链霉素(国产)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（异硫氰酸荧光黄）(武汉博士德)。
1.2 原代MDSCs的取材、分离纯化 参照参考文献所报道的方法［4，5］ ，选用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的医用酒精中，5 min×3次，处死并消毒；无菌条件下取前肢肱三头肌，后肢腓肠肌，尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织：用PBS液漂洗2次，将肌组织移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜状；加入1%的Ⅰ型胶原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍体积的胎牛血清中止消化，反复吹打后滤过200目的筛网，收集滤液，1 000 r/ min离心7 min，室温静置5 min弃上层液，细胞团块用生长培养基(含20%胎牛血清的DMEM)重悬，移入培养瓶中，该培养瓶称为PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，此为PP2。此后连续4 d每隔24 h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3～PP6。PP1～PP5弃去不用，PP6用于进一步的鉴定实验，细胞在达到约70%汇合时必须传代。
1.3 MDSCs生长曲线的绘制 取PP6传至第2代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个／孔接种于24孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共7日根据记数结果绘制细胞生长曲线。
2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫荧光鉴定 取PP6中的MDSCs培养到第3代时，把细胞培养在6孔板中的盖玻片上，第5 d细胞生长达70%～80%汇合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，照相。
2 结
果
2.1 分离细胞的形态、生长特性 PP1、PP2（图1A）贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞，其余是宽大而呈星形或不规则的杂细胞，增殖较快，1周左右即可完全融合。PP3（图1B）开始即有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少。随着纯化的继续，圆形或短梭形细胞的数量明显增加，到PP6（图1C）时超过80%，这些细胞贴壁后绝大多数为梭形或纺锤形， 有两极， 体积小， 胞核折光性强。少数细胞呈多角形， 有突起。随培养时间延长，细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，若不加以控制及时传代，细胞可迅速融合成细胞链或聚成团块生长，细胞增殖速度减慢， 细胞相互融合， 形成肌小管（图1D）。图1A PP1、PP2贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞和宽大而呈星形或不规则的杂细胞×200
图1B PP3有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少×200
图1C PP6圆形或短梭形细胞的数量明显增加，超过80% ×200
图1D 细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，细胞增殖速度减慢，×200
图1E、F 细胞特异性desmin染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞发出绿色荧光×400
2.2 生长曲线 第2日开始进入对数生长期，第5日后由于接触抑制，增殖速度减慢(图2)。图2 传代MDSCs的生长曲线
2.3 对PP6的细胞表型鉴定 肌源性干细胞本身具有特征性的外形， 其胞浆中含有结蛋白(desmin) 可通过细胞免疫荧光方法鉴定。本实验采用小鼠抗大鼠desmin一抗对肌源性干细胞进行鉴定，细胞质desmin染色阳性（图1E，1F），细胞胞质呈现绿色荧光。观察500个细胞，90%为desmin阳性。
3 讨
论
近年在骨骼肌中发现了一群被称为MDSCs的细胞群体。预期它们在组织工程应用领域特别是细胞移植和基因治疗方面前景广阔。国外已在进行大量MDSCs介导的相关的基因治疗和组织工程的动物实验［6-8］，并取得了较明显的效果。因此建立和完善MDSCs培养方法，获取高纯度的细胞具有重要实用价值。
骨骼肌细胞是由胚胎的生肌节和各处的间充质细胞分化而成，在肌膜和基膜之间有一种体积较小的扁平成立方形细胞，称为卫星细胞［9］，是保留在成年骨骼肌内具有增殖分化能力的单潜能成肌干细胞，这种组织特异性的干细胞在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持中起重要作用。有证据表明新近发现的肌源性干细胞(MDSCs)是一群与卫星细胞完全不同的细胞群。可能是一群未向任何方向定型的原始干细胞。
lee等［7］31-37从骨骼肌细胞中发现了MDSCs，与卫星细胞相比，其具有更多的分化潜能，不仅能分化成骨骼肌纤维，促进肌组织再生，还能分化成成骨细胞，促进骨骼愈合［5］，被认为是卫星细胞的前体。贴壁前的MDSCs呈小而圆的球形，折光性强，刚贴壁仍为圆形，贴壁后的MDSCs呈纺锤形，延迟分瓶时会融合成成熟的多核肌管，这与成纤维细胞不同。preplate技术利用差速贴壁获取MDSCs，其原理是成纤维细胞、内皮细胞的贴壁能力强于卫星细胞，卫星细胞的贴附能力又强于MDSCs，4 d内即可完全贴壁而此时MDSCs仍处于悬浮状态［6］1085-1100，实验中发现，组织块中加入胶原酶后很快就变成了乳糜状，胰酶对组织具有很好的离散作用，再通过反复吹打可将细胞从基膜中分离出来，得到的细胞为成纤维细胞、白细胞、内皮细胞、卫星细胞及MDSCs的混合物，利用差速贴壁法4 d后处于悬浮状态的细胞移出培养即为纯化的MDSCs。MDSCs本身具有特征性外形，我们通过结蛋白desmin染色鉴定其肌源性，通过其多向分化的能力来鉴定其干细胞特性。实验中我们还发现，随着乳鼠出生天数的延长，所取得的MDSCs的数量和活力逐渐下降，但出生时间太短，活力太差，又不利于取材。新出生3～5 d的大鼠最适宜进行原代取材。
结蛋白（desmin）是中间丝蛋白的一种，是成肌分化的早期的标志，常作为肌源性的标志，虽然成纤维细胞与骨骼肌内血管平滑肌细胞也产生结蛋白，但此细胞中结蛋白含量低，与抗体产生弱阳性反应，且仅有15％的desmin阳性率［10］，而通过本方法获取的MDSCs中desmin阳性率高达90%，由此可进行初步鉴别。
MDSCs属于成体干细胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点，在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。通过对常规技术的改良，本研究建立了一种稳定高效的新生大鼠MDSCs分离纯化技术，并成功对MDSCs进行了鉴定，为MDSCs在基因治疗和组织工程的临床应用打下了基础。
参考文献
［1］ Torrente Y，Tremblay J P，Pisati F，et a1.Intraarterial injection of muscle-derived CD34 (+)Sca-1(+) stem cells restores dystrophin in mdx mice［J］.J Cell Biol，2001，152(2)：335-348.
［2］ Torrente Y，Camirand G，Pisati F，et a1.Identification of a putative pathway for the muscle homing of stem ceils in a muscular dystrophy model［J］.J Cell Biol，2003，162(3)：511-520.
［3］ Cao B，Bruder J，Kovesdi I，et a1.Muscle stem cells can act as antigen-presentingcells.implication for gene therapy［J］.Gene Ther，2004，11：1321－1330.
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［5］ Zhuqing Qu，Deaaasy B，Jankowski R，et al.Identification of anovel population of muscle stem cells in mice:potential for Muscle regeneration ［J］.J Cell Biol，2002，(157):851-864.
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［8］ Deasy BM，Jankow ski RJ，Huard J.M usele-derived stem cells：characterization and potential for cell-mediated therapy［J］.Blood Cells Molecules Diseases，2001，27：924-933.
第4篇
“细胞悬浮培养技术是在传统的转瓶培养基础上发展而来的大量培养动物细胞的新兴技术，目前，该技术在欧美国家仅用于小规模生产人用禽流感疫苗。”此前，山东信得有关负责人说，作为一家同时拥有生物制品、生化制药、兽药制剂、饲料添加剂及兽药原料药五大产品线的高科技公司，山东信得首次实现了细胞悬浮培养技术在动物用禽流感疫苗研发生产中的规模化应用，而这一研发生产过程持续了7年之久，从“十一五”期间就开始了。产技术研究与开发项目引起了业界关注，并得到国家科技部门的支持，作为我国兽药行业加快提升行业生产技术水平的代表项目。
为此，在2010年，山东信得专门成立动物疫苗有限公司，并投资1.5亿元建成了国内首家大规模细胞悬浮培养工艺生产高致病性禽流感灭活疫苗的GMP车间，并于次年初通过了农业部的GMP动态验收，获得GMP证书和兽药生产许可证。2012年，山东信得获得农业部颁发的禽流感细胞苗新兽药证书。
“此次获得重组禽流感病毒（H5N1亚型）灭活疫苗的生产文号，标志着山东信得研发生产的产品将由此进入规模生产阶段，并能面向市场供应。”山东信得有关负责人表示，同时也说明了细胞悬浮培养技术已经打破多年来动物疫苗生产行业一直采用鸡胚生产禽流感疫苗的技术瓶颈，标志着我国在禽流感疫苗的研发和生产方面，已经走到了世界技术前沿，具有极大的引领和示范作用。
据了解，采用细胞悬浮培养技术生产高致病性禽流感疫苗，基本上能够克服鸡胚孵化生产工艺的缺点，是我国动物疫苗生产的发展趋势。具体来说，该技术避免了鸡胚培养中由于含有大量杂蛋白而存在的安全隐患问题，以及由于鸡胚废弃物处理不当而存在的散毒危险。同时，由于各种技术参数由电脑程序统一操控，整个生产过程更加可控，无外源病毒污染和母源抗体影响，疫苗质量批间差异最小化，产品更加稳定。“简单来说，就是技术更先进、质量更可控。”山东信得这位负责人认为，该工艺的改进，给我国乃至世界动物疫苗产业带来了技术升级，将提升疫苗的工业化生产水平，为养殖户提供安全、优质、高效的疫苗。
第5篇
【摘要】 目的 研究还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤的影响。方法 建立心肌细胞A/R损伤模型，随机分为5组：A组，正常对照组；B组，单纯缺氧/复氧(A/R低氧2h，复氧1h)组；C、D、E组为还原型谷胱甘肽处理组，加入还原型谷胱甘肽(GSH)分别使其终浓度为40、80、160 mg/L，后A/R。于复氧后测定各组培养液中乳酸脱氢酶(LDH)变化及细胞内丙二醛(MDA)含量和细胞存活率。结果 与正常组相比，单纯低氧/复氧组LDH漏出量、MDA水平显著升高(P
【关键词】 还原型谷胱甘肽 心肌细胞 缺氧 复氧
The effects of reduced glutathione sodium on anoxia/reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes
【Abstract】 Objective To study the effects of reduced glutathione sodium(GSH) on anoxia /reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes.Methods A/R model of myocardial cells of neonatal rats was established. The cells of neonatal rats were randomly pided into five groups: control group(A): without any treatment; A/R group(B):2-hour anoxia followed by 1-hour reoxygenation; GSH conditioned group(C):adding GSH into culture medium till the final concentration of 40mg/L then A/R; GSH conditioned group (D):adding GSH into culture medium till the final concentration of 80mg/L then A/R; GSH conditioned group (E):adding GSH into culture medium till the final concentration of 160mg/L then A/R. The activity of lactate dehydrogenase(LDH)，the contents of cellular melondadehyde(MDA) and the rate of cell viability of each group were evaluated after reoxyenation.Results Compared with group A，the A/R group showed a great increase in levels of LDH，MDA and a decrease in the rate of cell viability(P
【Key words】 reduced glutathione sodium cardiomyocytes anoxia reoxygenation
1 材料与方法
1.1 材料 实验用1～3天的Wistar大鼠乳鼠，山东大学实验动物中心提供，雌雄不拘；DMEM培养基由爱博公司出品；胎牛血清为美国 Gibco公司出品；胰酶为Sigma公司出品；丙二醛（MDA），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒均购自南京建成生物研究所；还原型谷胱甘肽（古拉定）由 Laboratorio Farmaceutico C.T.S.R.1生产(批号：4027)。
1.2 乳鼠心肌细胞培养 无菌取出生1～3天大鼠乳鼠心脏，剪碎后用0.25％胰酶消化4～5次，取除第1次以外的上清，用含15％胎牛血清的高糖DMEM 中止消化，离心取心肌细胞沉淀，加入培养液，集中混匀制成悬液，应用差速贴壁法分离纯化心肌细胞，以5×105/ml的培养密度接种于24孔培养板中， 在CO2培养箱中培养，48h后换液。
1.3 实验分组及操作程序 试验分为5组，每组重复8孔，A组为正常对照组（培养板置培养箱中持续孵育3h结束实验）；B组为单纯缺氧／复氧组（A/R 缺氧2h，复氧1h）：将培养板置于充有99.5％氮气的缺氧孵育器中37℃密闭培养2h，再以95％氧气＋5％二氧化碳进行复氧1h；C组，D组，E组为古拉定处理组，加入古拉定使其终浓度分别为40、80、160mg/L。各组缺氧前、复氧前均给药。
1.4 实验检测指标 (1)计数细胞搏动：在倒置显微镜观察并计数心肌细胞搏动的频率及节律。(2)细胞存活率计数：采用台盼蓝排斥法检测，各组取少许细胞混悬液，0.4%台盼蓝混匀2min，按白细胞计数法在光镜下计数蓝染细胞。台盼蓝摄取率＝蓝染细胞／（蓝染细胞＋未蓝染细胞）×100%。(3)LDH及MDA活性及含量测定：实验结束后按试剂盒说明测定。
1.5 统计学方法 数据以均数±标准差(x±s)
2 结果
2.1 古拉定对缺氧/复氧心肌细胞搏动的影响 正常培养对照组心肌细胞搏动相对恒定，节律规则；A/R组心肌细胞搏动频率减慢，搏动幅度减弱，节律不齐，有部分停搏，与对照组相比，差异有非常显著性（P
2.2 古拉定对心肌细胞缺氧/复氧损伤LDH及MDA的影响 结果表明，A/R心肌损伤是十分明显的，而古拉定能明显减轻这种损伤，古拉定处理组各观察指标均差异有显著性，因此提示古拉定对于缺氧／复氧心肌细胞损害具有保护作用，且存在量效关系，见表1。
注：B组与A组比较，P＜0.01；与B组比较，**P＜0.01；与B组比较，*P＜0.05
3 讨论
3.1 还原型谷胱甘肽对缺氧／复氧心肌细胞损伤的影响 大量研究表明，缺血再灌注期间大量氧自由基的产生可造成细胞损伤。氧自由基导致细胞损伤主要环节为作用于细胞外基质，使胶原和透明质酸崩解，使膜磷脂结构的多聚不饱和脂肪酸过氧化而直接损伤细胞膜；肌浆网和线粒体崩溃，心肌细胞在缺氧缺糖条件下，ATP产生减少，代谢障碍，代谢产物堆积，使膜稳定性降低，溶酶体释放，导致生物损伤、变性，使LDH释放在培养基中，同时再给氧时氧自由基增加，细胞膜受攻击，细胞膜损伤。细胞内LDH进一步增加，故LDH释放量是观测缺血再灌注损伤重要指标。脂质过氧化产物丙二醛(MDA)，其含量变化可作为评定自由基生成及对膜脂质双层结构破坏的指标。本实验从培养的未成熟鼠心肌细胞入手，排除了在体和离体灌注模型中神经、体液因素及其他混杂细胞因素的影响，直接利用还原型谷胱甘肽处理培养的未成熟鼠心肌细胞，结果发现还原型谷胱甘肽各浓度组均可降低缺氧／复氧损伤造成的心肌细胞死亡率，减少细胞内LDH漏出，减少细胞内MDA生成，且存在量效关系，表明还原型谷胱甘肽对未成熟鼠心肌细胞有保护作用。
3.2 还原型谷胱甘肽对缺氧／复氧心肌细胞损伤的保护机制 还原型谷胱甘肽(GSH)对清除自由基有重要作用，它是机体内一种重要的抗氧化剂，它能有效清除氧化产生的自由基，维持细胞内环境的稳定，并在使暴露于氧化环境的组织免受自由基损害方面起重要作用［4］。GSH在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的作用下对有机过氧化物(ROOH)和无机过氧化物(H2O2)起重要清除作用，其还可以起维生素C还原剂的作用，使维生素C成为还原型而不断清除超氧自由基。近期有研究表明［5］，GSH可维持线粒体内膜巯基基团的还原状态。当GSH含量下降，内源性自由基攻击线粒体蛋白巯基的可能性增大，一方面使酶活性降低，影响线粒体氧化代谢的3个关键酶及电子传递链中酶的活性，NADH减少，ATP产生减少。另一方面，导致膜蛋白巯基氧化交联，构型改变，线粒体膜渗透性转运通道打开，钙释放增加，胞浆钙上升，激活细胞膜PLA2和中性蛋白水解酶(CANP)，导致细胞膜的损伤或死亡。本实验表明补充外源性GSH，对保护细胞膜的功能可能具有重要意义，对临床各种疾患造成的心肌细胞缺氧／复氧损伤有保护作用。
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第6篇
【关键词】 表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱；蛋白质陈列分析；肝肿瘤；肿瘤细胞，培养的；差异蛋白
Analysis of different protein expressions in different liver cell strains in vitro using SELDI
【Abstract】 AIM: To examine the differential expressions of proteins in hepatoma cell line (HepG2)，hepatoma cell line transfected by HBV （HepG2.2.15）compared with normal liver cell line(LO2) by using surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (SELDITOFMS)， so as to establish a foundation for further studying on the mechanism of hepatoma at the protein level. METHODS: The 3 types of cells above mentioned were cultured as general and collected when they were in good conditions. After cell disruption， SELDITOFMS was employed to detect the differential expressions of proteomes of HepG2， HepG 2.2.15 and LO2. RESULTS: Ninetyone proteins were captured by WCX2 array. Compared with normal liver cell lines， in the segments from Mr 5000 to 15 000， proteins in the HepG2 and HepG2.2.15 showed apparent changes， in which 2 proteins expressions were increased in carcinoma cells， the other 5 decreased. Nine proteins in HepG2 were increased and 10 proteins in HepG 2.2.15 were increased. CONCLUSION: The SELDI ProteinChip technology can be a desired method in detecting the biological markers in the earlier period of hepatoma. This method is of convenience， high sensitivity， and good reproducibility. The biological tags of tissuespecific proteins we found have a potential applying value in the early diagnosis of hepatoma. These tags are also meaningful in screening and identifying signal proteins from serum and tissue specimen in different types of hepatoma. Certain foundation has been established in studying the etiopathogenesis of hepatoma at the level of proteins， as well as the searching of new therapeutic target sites.
【Keywords】 SELDITOFMS; protein array analysis; liver neoplasms; tumor cells， cultured; distinct protein
【摘要】 目的： 运用表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱(SELDITOFMS) 技术，检测体外培养的肝癌细胞株（HepG2），转染乙肝病毒的肝癌细胞株（HepG2.2.15）与正常肝细胞株（LO2）蛋白质的差异表达，筛选肝细胞癌的标志蛋白，为进一步研究肝癌发病的蛋白质组学机制奠定基础. 方法： 常规培养上述3种细胞，细胞状态良好时收集细胞，裂解细胞后采用 SELDITOFMS技术用WCX2芯片检测HepG2， HepG2.2.15， LO2细胞内蛋白质组学的差异表达. 结果： WCX2芯片共捕获91个蛋白，在Mr 5000~15 000区段，与正常肝细胞株比较，有7个蛋白质在两种肝癌细胞中出现明显变化，其中2个蛋白在肝癌细胞中表达量增高，5个蛋白在肝癌细胞中表达量降低；另外两种肝癌细胞株也有其各自的标志蛋白，9个蛋白分子在HepG2表达量增高，10个蛋白分子在HepG2.2.15表达量增高. 结论： SELDI蛋白芯片技术检测可作为检测肝癌早期生物标记的方法，它简便，敏感性高，重复性好，本文发现的这些组织特异性蛋白生物标记对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值，对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义，从而为从蛋白质水平研究肝癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础.
【关键词】 表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱；蛋白质陈列分析；肝肿瘤；肿瘤细胞，培养的；差异蛋白
0引言
原发性肝癌(HCC)在我国是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在部分城市中占恶性肿瘤死因的第二位. 每年有11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%. 肝癌早期没有明显体征，多数病人确诊时已属晚期，难以治愈，死亡率很高. 所以，对于肝癌的早期诊断，在无症状的人群中发现早期病例，对控制肝癌的病死率有现实的意义. 因此，研究并寻找有价值的预警肝癌的标志物，成为进一步提高肝癌临床治疗水平的关键. 任何疾病在出现病理变化之前，细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变，癌症的发生是一个多基因多阶段多因子的动力学过程，HCC也不例外，目前对肝癌发生机制的研究大都是在基因水平，但是mRNA的水平并不能真正代表所表达的蛋白质水平，因此，要求对生物功能的执行者蛋白质进行研究.
蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织或一种生物体所表达的全部蛋白质［1］. 蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质组概念的延伸，是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的学科. 蛋白质组学技术为研究肿瘤标志物与肿瘤进展转移研究提供良好的技术平台， 为研究开辟了新的手段和视角. SELDI蛋白质芯片技术是近年来新兴的一种蛋白质组学技术，它具有简单、快捷、灵敏等特点，可以检测分子量在Mr 500~500 000之间的蛋白或多肽，而且所需样本体积小（0.5~400 μL）［2-3］. 我们应用细胞裂解液裂解体外培养的3种细胞（LO2， HepG2， HepG2.2.15），进行了表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱技术（SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝细胞、肝癌细胞与转染乙肝病毒的肝癌细胞的蛋白表达图谱［4］，发现了一系列（信噪比）差异表达的蛋白，为今后从血清或肝癌组织中筛选标志蛋白提供科学依据.
1材料与方法
1.1材料正常肝细胞株（LO2）购自中科院上海细胞库；肝癌细胞株（HepG2）及携带乙肝病毒的肝癌细胞株（HepG2.2.15）由第四军医大学吴力克主任医师赠送. HPLC水，乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA），TritonX100，尿素，4羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），表面活性剂（CHAPS）均购自美国Sigma公司，蛋白质芯片时间质谱分析仪（PBSⅡC）及WCX2（弱阳离子交换芯片）购自美国Ciphergen Biosystems公司.
1.2方法
1.2.1细胞总蛋白质的提取LO2， HepG2细胞采用含100 mL/L胎牛血清的1640培养基培养，HepG2.2.15细胞另外加入终浓度200 g/L的G418，细胞长成单层后，用无菌细胞刮刀刮取细胞，PBS洗3次，加入裂解液（8 mol/L urea， 40 g/L CHAPS， 40 mmol/L TrisHCl， pH 7.4）200 μL， 4℃剧烈震荡30 min， 20 817 g离心30 min. 上清采用日本日立的 Gene Spec V蛋白核酸分析系统测定蛋白浓度，用裂解液调节至所有样品浓度为2 g/L，其余上清分装-86℃备用. 每种细胞收获3次，以排除组间差别. 每份样品至少在2个以上的同种芯片上检测，以排除不同芯片间的差异.
1.2.2WCX2蛋白芯片操作步骤将芯片装入蛋白工作平台，每孔加入200 μL结合/洗脱缓冲液（50 mmol/L NaAc， pH 4.0）预处理芯片，室温下200 r/min振荡5 min，弃缓冲液，重复上述操作1次. 每孔加入50 μL 1∶2稀释的样品，剧烈震荡，室温孵育1 h. 弃掉样品，每孔用200 μL结合/洗涤缓冲液洗涤2次，每次震荡5 min. 弃去孔中液体，每孔加入200 μL HPLC 水，立刻甩出. 从蛋白工作平台中取出芯片，空气中干燥，每孔加入0.5 μL EAM（SPA中加入75 μL乙氰和75 μL 10 mL/L三氟乙酸）重复1次. 干燥后用蛋白质芯片阅读机进行质谱分析.
1.2.3数据采集和结果分析用加有Allinone标准分子量蛋白的NP20芯片校正质谱仪，仪器参数设置如下： 激光强度220，检测敏感度10，优化分子质量范围为Mr 2000~10 000，最高分子量为Mr 50 000，采用Ciphergen ProteinChip 3.0版本的分析软件自动采集数据，然后用Biomarker Wizard 软件分析LO2， HepG2， HepG2.2.15细胞的蛋白质谱差异.
2结果
2.1重复性试验为了保证试验结果的可靠性，我们首先进行细胞计数为1010/L，样品蛋白浓度为2 g/L以减少细胞本身蛋白的差异；同时每种细胞收获3次，以排除组间差别；每份样品至少在同种芯片3个以上不同点进行检测，以排除不同芯片点之间的差异. 然后用SELDITOFMS对样品孔进行测定，经质谱分析后选择了8个蛋白峰，测变异系数，结果显示其M/Z及强度的CV分别为1%， 5%，分析结果表明试验重复性好，结果可靠.
2.2差异蛋白的比较
2.2.1LO2， HepG2， HepG2.2.15三者比较明显差异蛋白峰共7个，其中Mr 7945， 7979在肝癌细胞中表达增高， 5818， 8428， 10 106， 10 312， 11 084在肝癌细胞中表达降低（图1）.
2.2.2肝癌细胞和转染乙肝病毒的肝癌细胞蛋白质表达差异HepG2， HepG2.2.15细胞差异蛋白峰共19个， 9个蛋白峰在肝癌细胞中表达增高，10个蛋白峰在肝癌细胞中表达降低（图2）.
2.2.3差异蛋白质的初步鉴定将发现的差异蛋白峰在Swiss蛋白数据库中搜索（us.expasy.org/tools/tagident.html），发现Mr 11 084.0蛋白峰与钙结合蛋白S100 A10相符. 其他几种蛋白暂时寻找不到.
A： LO2细胞；B： HepG2.2.15细胞；C： HepG2细胞. 上部分为蛋白峰表达情况: 横坐标表示相对分子量，纵坐标表示蛋白质峰的强度；Mr 11 084.6， 10 106.4蛋白在LO2中表达最高，在HepG2中次之，在HepG2.2.15中最低. 下部分为蛋白质图谱的模拟凝胶图： Mr 11 084.6， 10 106.4两条带是LO2， HepG2.2.15和HepG2细胞的差异蛋白.
图13种细胞在Mr 10 000~11 500区段的蛋白质检测结果（略）
A: Chip 19C G2; B: Chip 19H 2.2.15. 横坐标表示相对分子量，纵坐标表示蛋白质峰的强度. Mr 10 106.4， 11 084.0， 11 658.4蛋白在HepG2中高表达，在HepG2.2.15中低表达.
图2HepG2， HepG2.2.15细胞在Mr 10 000~12 000区段的蛋白质检测结果（略）
3讨论
肿瘤早期就可在蛋白质水平出现细微但重要的组合改变［5］，近来研究表明，肿瘤性疾病从蛋白质组学的角度又可以被认为是一种蛋白质缺陷病，其发生过程中有多种蛋白会发生异常变化. 从组织增生产生原位癌到产生癌变的过程中，有不同的功能性蛋白的参与；转移也是多步骤复杂连续的过程， 与转移有关的特殊基因受到激活并有多种水解酶的参与. 总之， 肿瘤在发生发展转移的过程中， 在分子水平有不同的功能性蛋白参与， 并且功能性蛋白很可能在各个环节相互协调共同表达. 蛋白表达异常不仅包括蛋白表达量的增加或减少，还包括蛋白翻译后加工上的改变，从而导致肿瘤组织表达的蛋白质谱(protein profile) 的改变. 因此利用蛋白质组学方法检测蛋白质谱的变化可以更加准确地诊断肿瘤及了解肿瘤的发病机制.
临床上现有的HCC标志物众多，但尚无单一标志物能够诊断所有HCC. 这就需要探索一种新的技术以发现早期肿瘤标志物. SELDI蛋白质芯片技术可检测疾病进展中不同阶段血清中多肽量的变化，翻译后修饰的改变或某些多肽的聚糖结构变化，为HCC肿瘤标志物的进展提供了一个新的方法，它灵敏度高、特异性好、重复性强、操作简单且微量化［6］，可同时检测血清中的多种蛋白质已被应用于检测多种生物学样品.
体外培养的细胞株虽然不能完全反映体内细胞的生长状态和生物学活性，但它具有成分单一、均质性好、实验条件容易控制等优点. 尤其在做对比性研究时可避免由组织细胞成分复杂，细胞异质性高等缺点造成的结果不真实和不可靠［7］. 我们培养了LO2， HepG2和HepG2.2.15细胞，裂解细胞蛋白定量后SELDITOFMS分析蛋白表达的差异. WCX2芯片，用于分析正电荷蛋白，弱阳离子碳化合物构成活性位点，与样品中赖、精或组氨酸反应，它捕获的蛋白pI一般大于4. 我们在分子量Mr 3000~30 000范围内，共捕获91个蛋白峰. 其中肝癌细胞株与正常肝细胞株差异蛋白共7个，不同亚型肝癌细胞与正常肝细胞比较有共同的差异蛋白，说明在肝癌的发生或发展过程中涉及到一些共同的蛋白质改变；我们对不同类型的肝癌细胞株差异蛋白质进行分析，结果HepG2， HepG2.2.15细胞差异蛋白峰共19个，表明不同肝癌细胞株也具有特异的差异蛋白，这对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义.
这些组织特异性蛋白生物标记对我们从血清或组织标本中筛选或鉴定标志蛋白有重要意义，对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值，更主要的是为研究肝细胞癌变机制提供了一个基础，而且这些蛋白有可能为肝癌治疗提供新的靶位，可以进行RNA干扰来阻断其高表达或通过基因导入来促进低表达蛋白的表达.
用Swiss蛋白数据库中检索分子量和pI值匹配的蛋白质发现Mr 11 084蛋白峰可能为钙结合蛋白S100 A10. S100蛋白家族是一个有21个成员的钙结合蛋白家族， S100蛋白通过对钙离子的调节及与靶蛋白的相互作用，在体内发挥多种生物学功能. 研究发现 S100家族与肿瘤的发生发展关系密切，它们参与细胞周期调控，在多种肿瘤中表达异常，并与肿瘤的浸润、转移有关. S100 A10在肿瘤发生中的作用还不确定，它可能与Annexin II（p36）组成复合物，抑制p36磷酸化，参与细胞周期调控［8］. 在肝癌的发生中S100 A10可能通过p36起作用，它在肝癌细胞 HEPG2中低表达，抑制p36磷酸化的作用降低，从而抑制细胞增殖的作用降低，可能引起细胞生长失控而致癌.
从理论上讲，肝癌在发生、发展过程中其细胞内的蛋白质变化可以反应到血清中，可从体外培养的肝癌细胞株中筛选出部分与癌病人血清相一致的标志蛋白，有些改变可能只存在于细胞内而不分泌或代谢到细胞外，这部分蛋白可能是与癌症的发病密切相关的功能蛋白和调节蛋白.
目前，我们正进一步研究HBV感染携带者与HCC患者及正常人血清蛋白质的差异表达，结合体外培养细胞株的研究通过对比分析进一步筛选差异蛋白，下一步我们将蛋白纯化后进行序列测定，应用串联质谱分析鉴定特定的蛋白，以期确认肝癌的标志蛋白和功能蛋白，为临床肝癌的诊断提供新的思路，以期使肝癌的血清学诊断成为可能.
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第7篇
【关键词】间充质干细胞；大鼠
【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0044-02
引言
研究表明，骨髓含有造血干细胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多种成体干细胞。EPCs主要分化为血管内皮细胞，有助于血管疾病组织的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潜力的特点，研究表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化为成骨、软骨、心肌、肌腱、上皮、内皮等几乎所有三胚层类型细胞的能力[1-3]，基于这个特性使BMMSCs成为了中药诱导、临床移植及一些分子生物学实验的种子细胞源。因此，本实验采用最简单普通贴壁培养法分离、培养大鼠BMMSCs，若能得到较为纯净BMMSCs，在节约了培养BMMSCs成本基础上，提供了一种既简单又能稳定获得纯净BMMSCs的方法，为相关的实验提供丰富的BMMSCs。
1 材料和方法
时间及地点：于2009-09/2011-02在遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室完成。材料：清洁级SD大鼠，购自第三军医大学大坪医院动物实验中心[许可证号：SCXK（渝）2007-0005]。本研究所采用的动物实验操作程序经遵义医学院实验动物伦理委员会审议批准。主要试剂：LG-DMEM ，Gibco（New York，USA）
实验方法：
大鼠BMMSCs的分离、培养：颈椎脱臼法处死2～3周龄SD大鼠，无菌条件下手术取下两侧完整股骨（连同肌肉），浸入0.1%新吉尔灭15 min；剥离股骨附着肌肉，并用含双抗的D-PBS反复清洗。剪开股骨两端，用D-PBS冲洗骨髓腔，收集含骨髓细胞的洗脱液，1000 g离心5 min，弃上清，细胞沉淀用含10% FBS的LG-DMEM培养基重悬浮，每只大鼠分离的骨髓细胞接种两个T25培养瓶，置37 °C、5% CO2饱和湿度培养箱培养。每2 d换液1次，同时洗脱未贴壁的血细胞，倒置相差显微镜下每日观察细胞生长情况并照相。当BMMSCs生长汇合度达60～70 %时，采用0.125%胰蛋白酶消化法，按2～5×105个/ml细胞密度进行传代培养。
大鼠BMMSCs表型鉴定：取第3代BMMSCs进行CD45、CD29和CD90表型分子的流式细胞仪检测，具体步骤如下：0.125%胰酶消化BMMSCs并制成单细胞悬液，1000 g离心5 min；弃上清，加入D-PBS振荡混匀，1000 g离心5 min；弃上清，加入适量D-PBS振荡混匀；向预先加入各表型分子抗体的流式检测管内加入100 ?l细胞悬液（细胞数不少于100 000个），各管分别含PE Mouse IgG1/FITC Armenian Hamster IgG、PE anti-rat CD45/FITC anti-mouse/rat CD29及PE anti-rat CD90/mouse CD90.1不同荧光素标记的流式细胞仪检测抗体，振荡混匀，避光孵育20 min；每管加入2 ml D-PBS，振荡混匀，1000 g 离心5 min；弃上清，每管加入250 ?l 1%多聚甲醛固定液，振荡混匀，4 ?C保存待此后上机检测。
第8篇
关键词：植物；干细胞；培养；生长特性
中图分类号：R282.2／R282.71 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2012)01-0052-04
植物来源的天然产物作为先导化合物和药物的主要来源，曾在制药业的发展中发挥过非常重要的作用。近年其地位日渐衰落，主要是因天然植物生长缓慢、活性成分含量低，致使此类化合物的来源难以保障，难以适应现代制药业工业化大生产的需求。
鉴于天然化合物具有重要的药用潜力和经济价值，随着现代科学的发展，各领域的学者为解决其来源给出了自己的答案，较有成效的研究主要集中在以下几方面：(1)在微生物中表达天然产物的合成途径，采用转基因工程菌发酵方式生产某些活性成分，如紫杉醇等；(2)以容易获得的化工原料或天然前体为基础，半合成某些结构复杂的化合物，例如：青蒿素等；(3)植物组织培养，定向生产目标成分，如紫草素等。然而，由于很多天然产物化学结构非常复杂和独特，涉及的生物合成途径也非常多，例如紫杉醇(20步反应)、喜树碱(11步反应)、长春新碱(18步反应)等化合物的生物合成均涉及一系列繁杂的酶促反应，要化学合成需要多达数十步反应。这样的天然产物在很长一段时间内是难以依靠化学合成或者合成途径表达的方法实现原料供应的。而植物培养技术，以生源植物细胞或组织固有的生物合成途径为基础，利用内源的相关酶系统，结合诱导子和生物反应器技术，定向生产目标成分，经过多年研究，已经有成功工业化的案例(表1)。如日本Mitsui Petrochemical Industries采用人工培养紫草细胞方法获得紫草素，实现了该成分的工业化生产。所得的紫草素不仅用以生产抗炎药，制成唇膏，在本国高科技绿色产品的概念推动下，当年销售量达到200万支，获得了良好的市场效益。美国Phyton Biotech公司利用红豆杉细胞培养技术，结合大量的诱导子实验，创立了紫杉醇高产的方法，其专利中披露的最高产量达902 mg／L。该公司目前已经获得FDA批准，以此专利技术为施贵宝公司供应紫杉醇。
1.植物培养技术面临的挑战
尽管已有许多成功的案例，植物培养技术在适应工业化生产过程中，仍要面临着很多问题需要解决。(1)很多活性成分在生源植物中的分布，呈现组织特异性。某些特定的组织培养物(如：茎、根、芽、毛状根等)，可以表现出与生源植物类似的代谢产物谱，但脱分化细胞中的二次代谢产物丰度非常低，甚至根本没有。例如：喜树碱在脱分化细胞中含量非常低，或者根本检测不到，但在喜树的根培养物中，其含量则与原植物不相上下。与此类似的是，在黄花蒿的脱分化细胞中，也没能检测到其抗疟成分――青蒿素。虽然，培养特定组织容易获得较高产率，但是，该类培养物在常用的生物反应器中难以生长，甚至不能存活，需要开发定制特殊的反应器，难以适应现阶段工业化生产的需要。脱分化细胞在该方面具有明显的优势，能够很好的适应商业化生产的需要。因此，如何提高脱分化细胞中目标成分的含量及产量，已成为目前植物组织培养研究的热点。现阶段采用的方法有：细胞系优选、培养条件优化、诱导子的使用、前体饲喂、阶段培养、灌注培养、细胞固定化等。根据具体情况选择不同的方法，可以获得较理想的结果。(2)植物细胞长期培养时，由于细胞不均一、基因突变、环境因素影响等原因，其生理、生化以及遗传性状逐渐发生变化，成为其商业化的另一大障碍。含量低和易变性作为植物细胞培养商业化的两大阻碍。迄今的研究多集中在前者上，经过多年努力，已建立了一系列卓有成效的实验技术和解决方案。相对而言，控制可变性的研究尚处于较浅水平，鲜有确实可行的方法。近年，在长期培养的细胞系中，随着培养时间延长，代谢产物含量普遍降低，使研究者日益关注植物细胞培养中可变性的机制以及控制方法。由于植物的种间差异和多样性，使此问题异常复杂，传统的研究方法和角度难以对此问题做出全面解答。由韩国和英国学者开发的植物干细胞培养技术，利用干细胞生长和遗传特性方面的优势，为解决上述问题提供了一个全新的方案。
2.植物干细胞培养基本方法
2010年11月，韩国Unhwa公司和英国爱丁堡大学的研究者将以红豆杉干细胞培养为主体的研究成果，以“Cultured cambial meristematic cells as a source of plantnatural products”为题在Nature的子刊Nature Biotechnology上发表。该刊同期还发表了对此成果进行报道评论的综述“Plant natural products from cultured multipotentcells”。以红豆杉体系为代表的植物干细胞培养技术，吸引了全世界的关注。
植物干细胞培养技术，是在传统组培技术的基础上，改进了现有方法，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系。植物干细胞培养技术，不仅丰富了植物培养技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研究方向和契机。
根据目标干细胞的不同，目前较为成功的植物干细胞培养方法主要有以下几种。
木本植物维管形成层分生(以红豆杉为例)：采取野生红豆杉的新生枝条，表面灭菌后切开；将含有形成层、韧皮部、皮质和表皮的组织轻轻地从木质部剥离；将获得的组织在分离培养基上培养30d后，新生的形成层细胞和其他脱分化细胞(愈伤组织)因组织现状的差异自然分离――形成层细胞为均一生长的平板状组织，愈伤组织则为不规则的聚集生长物；将获得形成层细胞转移到生长培养基上培养。目前报道该方法成功的案例仅限于红豆杉属。
草本植物储藏根的维管形成层(以人参为例)：取户外培育、平滑无伤口的人参，表面灭菌；将主根削成薄片，再切成长5～7 mm，宽5～7 mm，高2～5 mm，使每片都含有形成层；将制备好的外植体用蔗糖高渗透液处理，使分化的组织――皮层、韧皮部、木质部、髓部等失去活力，仅形成层能保留生命力；将渗透液处理过的的外植体转移到诱导培养基，培养3-7 d后，外植体的形成层变成淡黄色；再过7～14 d后，淡黄色部分有一圈细胞生长出；将外植体继代到生长培养基，培养10-20 d后，即可分离得形成层细胞，所得细胞继续在同样的培养基上培养。目前，仅有人参属确实报道成功建立了该类干细胞培养体系。
静止中心(以水稻为例)：将稻谷剥皮，表面灭菌，干燥至水分完全去除；将干种子种入培养基，25℃下培养5 d，使其发芽；种子发芽5-6 d后，收集含有静止中心的根组织，去掉根端的根冠，从切口开始截取1 mm长作为外植体；将外植体放入诱导培养基，30 d后观察到细胞被
诱导出：所得静止中心干细胞为白色，均一，且周围环绕着黏性物质(黏原蛋白)，而一般根组织得到的细胞不均一，黄色，无黏性物质，这些差异使干细胞可以和其它细胞自然分离；将分离得到的静止中心干细胞转移到生长培养基。目前，利用该方法可以获得水稻、玉米等植物的干细胞培养体系。
3.植物干细胞培养体系的特性研究
不同来源的植物干细胞培养体系，有着不同的生长特性(表2)，这些特性决定了其各自的用途。这些方法由韩国Unhwa公司开发，现已申请了一系列相关专利。
所有的研究中，考察红豆杉干细胞培养体系的生长特性最为深入和全面。在完成了培养体系的初步建立工作后，研究者首先考察了获得细胞的形态、遗传学特征和基因组学方面的考察，以验证培养的细胞确为维管形成层细胞。另一方面，对培养体系的生长特性进行了研究，主要考察了细胞生长速度、长期培养稳定性(时长22个月)以及对生物反应器的适应性，并与脱分化得到的愈伤组织进行对比。红豆杉干细胞培养体系不仅生长速度快，性状稳定，而且由于细胞具有游离生长、液泡分散的特性，培养体系对各种类型(气升式、搅拌桨式)、各种规格(3L、10L、20L、3吨)的生物反应器均具有良好的适应性，具备了商业化生产的基本条件。为开发培养体系的实用价值，研究者诱导了所得培养体系活性成分，使其中紫杉醇含量提高了数十倍，并进一步进行灌注培养，促使更多的紫杉醇分泌到培养基中[含量268 mg／kg(细胞鲜重)，分泌率74％]。此外，研究者还系列测试了红豆杉干细胞提取物的抗癌活性，在抑制HHC-95肺癌细胞、PC-3前列腺癌等瘤株的实验中，提取物均显示了可与紫杉醇媲美的抗癌效果(该实验所用的培养体系未经诱导，经检测基本不含紫杉醇)。以上工作，从各方面为该技术的商业化提供了有力的技术支持。
对于水稻等干细胞的研究，主要目的是建立植物细胞银行。建立细胞银行可使植物细胞采用类似动物细胞冻存一复苏的培养方法，彻底解决植物细胞培养过程中的变异问题。该策略虽简单可行，但是一般的植物细胞却难以在冻存后顺利复苏，其存活率非常低，且回复生长能力的延迟期漫长。因此，该方面的研究一直停滞不前。如表2所示，以上各种干细胞的一个共同特征就是可在冻存条件下保持良好的生命力，这使植物细胞银行的建立具备了良好的前提。此外，植物干细胞培养体系建立方法的多样性使该技术具有普遍推广的潜力，因而可以预见，植物细胞银行中能够容纳的植物种类将非常丰富。作者相信，随着植物细胞银行的建立，不仅可以为植物细胞培养的稳定性提供一个切实有效的解决方法，而且将在植物种质资源的保存方面发挥关键作用。
目前，人参干细胞的研究成果，主要用于保健品和化妆品的开发，除了相关专利和文章外，已有相关产品面世。相信在植物干细胞这个高科技和全天然概念推动下，该类产品将会很快地在高端市场占有一席之地。
4.植物干细胞培养体系的应用展望
第9篇
达情况，着重观察单个细胞培养形成细胞克隆的形态与时间。结果 以有限稀释法获取192个Tca8113M1舌癌单个细胞，在96孔板中进行体外培养，获取12个细胞亚系（获取比例为6.25%），均有高成瘤性。癌干细胞相关标志CD44
与ESA均为高水平表达，而CD184表达则在12个细胞系之间有差异。在单个细胞培养中，形成完全克隆、部分克隆与旁克隆3种形态，12个细胞亚系均源于单个细胞形成的完全克隆，均可进行连续传代与扩增，而部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡。结论 Tca8113M1细胞系中可能存在癌干细胞，而单细胞培养可形成完全克隆并建立细胞亚系，是进行舌癌干细胞后续研究重要的细胞培养模式。
[关键词] 单细胞； 有限稀释法； 舌癌干细胞； 完全克隆
[中图分类号] Q 21 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干细胞是癌组织中一小群具有干细胞特性的细胞，具有自我复制与更新的能力，而且增殖与分裂能力极强，少量细胞即可形成体外移植瘤[1]。近年
有关肿瘤发生、转移、耐药与复发等诸多难题均从癌干细胞的角度进行研究。这种研究的基础和前提是明确癌干细胞的标志或分离出癌干细胞，以提供研究的靶细胞。目前已发现多种永生性癌细胞系中存在有癌干细胞，Tca8113M1舌癌细胞系同样可能存在有癌干细胞，可以作为舌癌干细胞的研究对象。鉴于癌干细胞独特的自我复制与更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌细胞系为研究对象，采用有限稀释法分离出单个舌癌细胞进行体外培养，利用癌干细胞的自我复制能力进行分裂增殖，形成预期的单细胞克隆，进一步形成细胞亚系，以此证明Tca8113M1
舌癌细胞系中存在癌干细胞的可能性，同时检测细胞亚系癌干细胞标志的表达情况，观察不同细胞亚系的生物学特性，并且动态观察单细胞培养中细胞克隆形成的规律，为从Tca8113M1细胞系中分离舌癌干细胞提供前期实验依据。
1 材料和方法
1.1 舌癌细胞系来源
人舌癌细胞系Tca8113由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室建系，四川大学华西口腔医院赠送。右江民族医学院肿瘤分子生物学实验室在此基础上建立了转移人舌癌细胞系Tca8113M1[2]。
1.2 主要试剂和仪器
胎牛血清（Hyclone公司，美国），RPMI1640培
养基（Gibco公司，美国）；PE标记抗人CD44抗体，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗人细胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-
gen，ESA）抗体，PE/cy5标记抗人CD184抗体，同
型对照抗体分别为大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1与小鼠IgG2aκ4。CO2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪（BD公司，美国），倒置显微镜（Olympus公司，日
本）。
1.3 体外单细胞培养、建系及细胞克隆生长的动态
观察
采用有限稀释法进行体外单细胞培养与建系。Tca8113M1细胞经复苏后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。用0.25%胰蛋白酶消化细胞制备细胞悬液，转移至96孔板，采用有限稀释法保证每个孔有1个细胞，在倒置显微镜下观察其生长和增殖情况，待其生长成多个细胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化转移至6孔板扩增培养后，在培养瓶中反复传代建立细胞亚系。此外，在此培养过程中动态观察单个细胞形成细胞克隆的形态与生长情况，观察时点分别为3 d和1、2、3周。
1.4 舌癌细胞亚系成瘤性检测
建立裸鼠皮下移植瘤模型。体外培养Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌细胞亚系细胞，选取形态良好的生长期细胞，在生长旺盛时接种。具体步骤如下：消化收集舌癌细胞，800 r・min-1离心3～
5 min，弃上清液，计数细胞总量，以含10%胎牛血清的DMEM培养液按每毫升1×107个细胞的密度稀释细胞；消毒裸鼠右腋窝的皮肤，将细胞接种于皮下，以皮下结节直径超过1.0 cm为成瘤标准。共接种裸鼠45只，具体分组如下：1）Tca8113M1舌癌细胞亚系组，共12个亚系，每组3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌细胞组，6只，为母系细胞系对照组；3）Tca8113舌癌细胞组，3只，为来源细胞系对照组。
1.5 流式细胞术检测舌癌细胞亚系癌干细胞相关标
志CD44、CD184、ESA的表达情况
将舌癌细胞（密度为每毫升1×106个）消化以后，800 r・min-1离心5 min，弃上清液，加入D-hanks液重悬，尽量将细胞吹散，将细胞悬液分别移入试管中（每管体积为500 μL），设置对照管和样本管。在对照管中加入同型对照抗体（分别是大鼠IgG2bκ2、小鼠
IgG1与小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在样本管中加入荧光抗体（PE标记抗人CD44、FITC标记抗人ESA、PE/cy5
标记抗人CD184）各5 μL，置于避光环境下室温孵育30 min，然后于流式细胞仪上检测CD44、CD184、ESA的表达情况。
2 结果
2.1 Tca8113M1细胞体外单细胞建系培养
Tca8113M1单细胞培养12 h后，细胞贴壁；24 h后部分细胞出现变大变薄、空泡样变等老化现象；3 d后，有7个孔的细胞出现增殖分裂现象；7～10 d后有12个孔的细胞开始增殖为单个或数个完全细胞克隆（克隆形成过程见图l）。
培养4～6周后，细胞基本达到稳定生长并增殖的状态，以癌细胞的克隆样生长为主，细胞呈铺路石状，可见巨核、多核细胞，核分裂象多见。待培养孔接近80%铺满时，将细胞转移至6孔板上扩增培养，1～2周后转移至培养瓶中继续传代培养，稳定传代30代后冻存。本研究以有限稀释法获取192个Tca8113M1舌癌单细胞，并在96孔板中进行体外传代建系培养，获取12个细胞亚系，比例为6.25%，分别命名为Tca8113-S1～Tca8113-S12。
2.2 Tca8113M1细胞体外单细胞培养形成细胞克隆
的动态观察
以3 d和1、2、3周为观察时点，发现单个细胞形成细胞克隆的形态主要有3种：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12细胞亚系的细胞均源于单个细胞形成的完全克隆，均可以进行连续传代与细胞培养扩增，而其他单个细胞培养形成的部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡，未能连续传代进行细胞扩增。3种克隆在培养过程中的变化情况如下。1）完全克隆：细胞之间紧凑密集成型，增殖速度快，其中1～2周为典型的完全克隆状，3周时在细胞克隆中央出现细胞重叠生长现象（图2中A1～A4）；2）部分克隆：克隆形态界于旁克隆与完全克隆之间，细胞间较疏松，其中1～2周为典型的部分克隆状，但第3周细胞克隆疏松，形状消散，
有转变为旁克隆的趋势（图2中B1～B4）；3）旁克隆：
细胞间疏松不成型，第1周较典型，第2、3周后细胞老化（图2中C1～C4）。
2.3 Tca8113M1舌癌细胞亚系成瘤情况
将舌癌细胞亚系Tca8113-S1～Tca8113-S12接种于裸鼠皮下后，1周后可触及皮下结节，表面光滑、质硬、可活动；2周后可见皮下结节生长迅速；3～4周后皮下结节最大直径达1.0 cm以上。含对照组在内的45只裸鼠均接种成瘤，成瘤率为100%。
2.4 流式细胞术检测细胞亚系癌干细胞相关标志
CD44、CD184、ESA表达情况
流式细胞术检测结果见表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6与Tca8113-S10的ESA阳性表达率分别为60.7%±3.6%、74.1%±1.5%与65.3%±2.8%外，其余细胞亚系ESA的阳性表达率均在80%以上；各亚系CD44阳性表达率均很高，除了Tca8113-S7为68.9%±2.4%外，其余亚系的阳性率均在90%以上；12个亚系的CD184表达存在差异，阳性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之间波动。
3 讨论
本研究利用有限稀释法等经典的细胞培养技术，以舌癌Tca8113M1细胞系为研究对象，随机选取192个舌癌细胞，在96孔板中进行单细胞培养，经过长期传代培养，共建立12个舌癌Tca8113细胞亚系，比例为6.25%，而且都具备很强的成瘤性。进一步检测12个Tca8113细胞亚系的癌干细胞相关标志，结果发现：CD44与ESA均为高水平表达，阳性表达率多在90%左右，而CD184的阳性表达率则各有不同。据此结果可以结合癌干细胞的生物学特性对本实验获得的细胞系进行分析。
本研究发现：舌癌Tca8113M1细胞系中有6.25%的单个细胞可以进行自我分裂、增殖，形成细胞亚系。还有研究[3]发现：Tca8113细胞连续经过两次单细胞培养实验，其中具备分裂增殖活性的细胞比例为5.09%～10.85%。这提示即使在永生化细胞系中，具备持续增殖能力的细胞占整个群体的比例都较少。根据目前的文献[4]报道，在癌细胞群或组织中，癌干
细胞比例为0.01%～5%；体外培养的永生化癌干细胞系中，癌干细胞的比例可能偏高一些。本研究采用经典的有限稀释法获取单个细胞，这种细胞表现出强大的增殖与分裂活力，而且还形成了成瘤性很强的细胞亚系。这些单个培养的细胞是否就是癌干细胞尚需进行单细胞水平的鉴定，但可以大胆推测的是，其中应该包含有癌干细胞。肿瘤干细胞的概念于20世纪60年代提出，并据此建立了肿瘤细胞克隆实验。本研究在单个细胞培养中也发现，单细胞的增殖方式是克隆样增殖，即形成一个细胞克隆后扩大生长，并且在周围形成小的细胞克隆，最后融合成片，但究其细胞来源就是一个癌细胞而已，所有后续的细胞克隆与癌细胞就是源于它，所以可以认为该细胞具有癌干细胞的潜质，可以考虑从癌细胞系中筛选癌干细胞。
在12个Tca8113细胞亚系中，为明确其癌干细胞相关标志的表达情况，为后续舌癌干细胞的筛选提供前期实验数据，本研究综合文献报道，选取了CD44、ESA与CD184等癌干细胞相关标志进行检测。CD44是乳腺癌、头颈部肿瘤、结肠癌等上皮组织的癌干细胞的相关标志，CD184是胰腺癌干细胞的相关标志；ESA则是上皮来源的癌干细胞标志，而且属于细胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12个细胞亚系中，
CD44与ESA均处于高水平表达，而CD184的表达则高低不一，其中亚系间均数差值最大者接近60%。从这3个指标的表达情况来分析，可以进行如下推测：1）CD44与ESA是不同细胞亚系共有的标志，提示这些细胞亚系可能具有共同的组织起源；2）CD184的差异性表达提示Tca8113细胞系中存在细胞异质性，但从其比例来看，大致有3个等级，即15%、30%、50%以上，提示其生物学特性可能有明显的差别，但可作为舌癌干细胞研究的候选细胞群体进行研究。
此外，在单个细胞培养基础上建立细胞亚系的过程中，笔者发现单个细胞形成细胞克隆的形态与细胞最后成系关系密切。在单个细胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3种克隆形式中，只有完全克隆能够形成细胞亚系，而且这些细胞亚系表现出肿瘤的异质性与成瘤性，而部分克隆以及旁克隆则在传代与扩增培养过程中逐渐老化或消亡。这一结果可进行逆向推理：将最初形成完全克隆的12个细胞确定为舌癌干细胞，而其形成的完全克隆则是癌干细胞自我更新与增殖的结果，其中可能富含癌干细胞。这一观点也为前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神经胶质瘤等相关研究[7-12]所证实。这些研究发现完全克隆细胞可以高表达癌干细胞标志；接种1 000个完全克隆前列腺癌细胞就可形成移植瘤；通过悬浮球培养的癌细胞球在消化后进行单细胞培养，可以形成高比例的完全克隆。有学者[13]进一步在头颈肿瘤细胞系中发现，CD133与CD44阳性表达的癌细胞多形成完全克隆，而CD133与CD44阴性的癌细胞则多趋向于形成部分克隆或旁克隆，从而认为CD133与CD44是头颈肿瘤癌干细胞的标志。由此可见，完全克隆为癌干细胞的自我更新方式与富集、纯化癌
干细胞及癌干细胞标志的研究提供了新的途径，近年在癌干细胞研究中逐渐被应用和关注[11]。此外，针对完全克隆的研究切入时间与方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在单个细胞培养1～2周时形成，最好不要超过3周；扩增培养后，可使癌干细胞比例减少或分化细胞比例增加，从而影响对癌干细胞行为学的观察。
本研究属于寻找舌癌干细胞的前期性和阶段性实验，但是结果很有意义，这12个细胞亚系表明了Tca8113M1细胞系中有存在舌癌干细胞的可能性，而其最初的来源细胞系Tca8113也应存在癌干细胞。结合细胞克隆形态分析的单个癌细胞培养模式可为深入研究舌癌干细胞提供细胞研究平台。
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第10篇
关键词：IPS细胞；分化；造血干细胞
0 引言
目前，临床上普遍使用造血干细胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海贫血等病的治疗。造血干细胞的主要来源是脐带血、骨髓。如果直接进行骨髓移植，则需要进行人体的白细胞抗原配型，否则发生免疫排异会危及患者生命。现有脐带血库储存的造血干细胞免疫原性弱，但数量供不应求，使其在疾病中的临床应用中受到限制。随着诱导性多能干细胞（IPS）提取技术的出现，使分化自身细胞变为了现实，不但避免了伦理问题，解决了免疫排斥问题，造血干细胞的数量也能满足临床需求。下面将分化研究过程报道如下：
1 材料和方法
1.1细胞株的来源
小鼠骨髓基质细胞OP9购于美国ATCC，诱导性多能干细胞IPS由中科院广州生物医药与健康研究院提供。
1.2试剂和仪器
小鼠骨髓基质细胞OP9的培养基为α-MEM，内含20%的胎牛血清，OP9细胞诱导干细胞分化培养基为α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明胶），CD34来自MACS公司。抗体为APS-TRA-1-85，半固体培养基购于SCT公司。流式细胞仪为美国AccuriC6型，定量PCR仪为CFX96型。
1.3方法
在六孔板中先铺好1%的metrigel进行细胞培养，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持对照组细胞的未分化状态，OP9用细胞培养液培养，培养时放在大小为10cm且铺有0.1%的明胶的盘里，，每隔四天用胰酶消化传代。细胞培养温度为37℃，CO2浓度为0.5，湿度饱和。
OP9细胞进行传代培养4天后，将OP9的培养液换成诱导干细胞分化的培养液，将UC013细胞洗两遍后，再对边缘部位细胞进行消化，将细胞吸出后加入Dispace，再用枪头吹吸混匀细胞后，将其转移到加有分化培养液的细胞盘中摇匀，在与上述培养的温度、空气CO2浓度和湿度相同的条件下进行培养，培养的第二天将培养液换为共培养液，第四天开始每隔一天半换一次培养液，第九天收样品。
免疫磁珠法分选CD34+细胞，将细胞用PBS洗两遍，接着用胰蛋白酶进行消化，制备单细胞悬液，再将细胞收集到离心管中进行离心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均匀。过滤后，向其中加入FCR和 CD34标记细胞，30秒后加入流式细胞缓冲液，再离心，然后吸取上清，加入流式细胞缓冲液重悬。将制备好的细胞悬液加入流式细胞仪进行分离，通过流式细胞仪分离柱的CD34-细胞被移出分离柱弃之，最终，通过加压洗脱分离柱上黏附的细胞，即得到CD34+细胞。
用流式细胞术进行检测，将共培养9天后的细胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制备单细胞悬液，收集到离心管中，静置五秒后，用加有2%血清的流式缓冲液重悬，细胞过滤后，加入FCR和抗体，孵育15min，再用流式缓冲液清洗，重悬，最后用流式细胞仪进行检测。
集落形成实验。将分选的CD34+细胞接种到半固体培养基中，放于培养皿中进行培养，每孔接种1万个细胞，培养14-16天。然后，在显微镜下根据集落成的血细胞形成特征，对集落细胞进行分类和计数。同时，提取共培养2、4、6、8、10和12天的细胞的RNA，用RT-PCR法检测各基因在细胞中的相对表达量。
2 结果
2.1细胞培养与观察
观察培养的细胞，结果显示，对照组未分化的人体细胞集落状生长，呈扁平状，排列紧密，没有分化的迹象。实验组培养2天后的细胞，表面布满细胞集落，已进行造血干细胞分化。OP9细胞贴着细胞壁生长，细胞为三角形，周围向外出伸出像纤维状的伪足，细胞排列规则，生长迅速，培养4天后细胞铺满了培养皿底。
2.2诱导造血干细胞分化
通过在本实验组的诱导分化条件下，对实验组和对照组细胞的培养，实验组细胞分化到一定程度后，便开始大量克隆，细胞的形态也发生了分化，接着，OP9细胞开始出现老化迹象。
2.3流式细胞术检测
共培养9天后用流式细胞仪检测细胞造血表面标志物表达情况，用流式细胞仪分析培养细胞的CD34、CD43、CD31的表达情况，结果显示表达上述表面标志物的细胞分别占有比例为20%、2%和7.1%。
2.4 4RT-PCR检测
运用RT-PCR对共培养的细胞进行基因表达检测，结果显示，IPS细胞发生造血分化时，Oct-4基因的表达慢慢消失；造血转录因子基因表达缓慢升高；Runx-1基因在造血干细胞分化12天当中的表达呈波浪式变化，其中分化第二天表达量最高，第四天开始下降，第八天开始升高；CD34在造血分化过程中的基因表达量逐渐增高。
2.5 CD34+细胞集落实验
CD34+细胞在半固体培养基中进行培养，根据造血干细胞的形态特征，对细胞集落进行分类和计数。结果显示，红系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒―巨核系集落（CFU-GM）集落数量持续升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落数量逐渐降至最低。
3 讨论
随着干细胞技术的发展，通过诱导分化得到造血干细胞已经成为事实。相对于多能干细胞而言，IPS通过导入转录因子以及重编程进行定向分化的比例较低，，但是IPS的获得方法比较简单稳定，避免了胚胎干细胞面临的伦理和法律等问题，使IPS可以应用于细胞替代性治疗，并可以进行疾病的机理研究和肿瘤治疗药物的筛选。IPS细胞分化得到的造血干细胞免疫原性较低，解决了移植排斥的问题。
在本文的研究中，没有外加细胞因子，直接将IPS细胞诱导分化为造血干细胞，结果获得了20%的CD34+细胞，即造血干细胞，CD34是表达于造血干细胞的表面标志物，表明IPS可以分化为造血干细胞，但是转化率比较低。Runx1是调控造血干细胞分化的转录因子，期基因的表达量在分化过程中呈现波浪式的变化，Gata-2的表达则逐渐升高。体外分化得到的造血干细胞在半固体培养基中成集落状态，说明IPS可以向各细胞系进行分化。
现在多能干细胞分化为造血干细胞的方法主要有：一是形成胚状体后再进行诱导生成造血干细胞；二是基质细胞与多能干细胞共培养；三是形成EB后与OP9进行共培养；四是单层诱导ESC生成造血干细胞。利用OP9细胞与胚胎干细胞共培养，可以模拟体内的造血微环境，为研究细胞定向分化为造血干细胞创造了可能性，OP9细胞主要支持早期的造血干细胞分化，并协助B淋巴细胞增殖。基质细胞通过释放的细胞因子支持造血干细胞的分化。这种诱导方法分化时间短，为临床造血干细胞的移植提供了便利。诱导分化过程中不用添加细胞因子，比较经济。但该诱导方法也存在着一定的缺点，即存在鼠源性污染细胞的可能性，加之所用血清的成分的不明确性，限制了其在临床应用。
目前临床上移植造血干细胞主要是用脐血和骨髓来源的造血干细胞，而体外分化和扩增得到造血干细胞只能通过动物试验来获得。将造血干细胞植入重建小鼠体内，可以评价造血干细胞的功能。体外分化获得的造血干细胞和脐血中的造血干细胞与重建小鼠体内造血系统差异较大，需要进一步优化体外诱导多能干细胞分化为造血干细胞的过程，才能满足该实验需求
4 小结
通过将IPS定向分化为造血干细胞的研究，成功诱导了造血干细胞，分化得到的细胞在体外培养中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技术方法希望可以为IPS细胞在造血疾病中的应用提供一定的实验依据。
参考文献：
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第11篇
[关键词] 骨髓基质干细胞；成骨细胞；诱导分化
中图分类号：R681 文献标识码：B 文章编号：2055-5200（2014）02-035-04
前 言
骨髓基质干细胞作为干细胞的一种，具自我更新和多分化潜能，具备成为种子细胞[1-2]的可能，在组织工程发展的热潮中引起科学工作者关注，但围绕骨髓干细胞的相关研究尚处于起步阶段[3-4]。胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）可以通过跨膜的酪氨酸蛋白激酶受体RET激活细胞内多巴胺（DA）神经信号，从而促进神经细胞存活和分化过程。aDA-2006是本实验者在实验中筛选、发现的一种易透过细胞膜、无细胞毒作用、可人工合成的小分子化合物。本实验具体分析DA-2006促进骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的机制，为骨组织工程的临床应用提供一定依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验动物：选择南京青龙山的3周龄新西兰大白兔（雄性）。实验试剂与相关仪器：Trizol（美国Invertrogen公司），SYBR Green（日本Toyobo株式会社），反转录试剂盒（日本Toyobo株式会社），0.25% 胰酶（上海生物工程有限公司）、新生牛血清（维森特生物技术有限公司）、细胞孵育箱（赛默飞世尔科技中国有限公司） 、超净工作台（浙江安泰医药有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 培养方法 脱颈处死大白兔，在75% 酒精中浸泡25-35min后，在兔胫骨结节0.5-1cm处分别抽取骨髓1.5mL，同时加入等体积的DMEM培养液，将液体移至50mL离心管中，1400rpm/min转速离心5-10min，吸去上清及脂肪层，然后在离心管中添加10%FBS的DMEM培养液4 mL，进行颠倒混匀20次，按1×106个细胞/cm2的密度，将细胞接种于10cm细胞培养皿中，置于饱和湿度孵箱（37℃、5%CO2）中培养。经48h细胞培养后，换液50%，去除未贴壁细胞、红细胞等，以后每72h进行一次换液。原代培养9-12d后细胞达80%融合，采用添加0.02%的EDTA的0.25%胰蛋白酶进行消化后传代[2]。
将第2代细胞分3组进行培养，诱导组A采用诱导培养液[4]（普通培养液中添加108mol/L地塞米松，0.01mol/Lβ-甘油磷酸钠，50mg/L维生素C），诱导组B采用含1?LMDA-2006的普通培养液。对照组采用普通培养液。
1.2.2 检测方法 （1） PCR检测标志基因的表达：取传至第3代BMSCs细胞，吸弃培养液，添加1mL冰浴PBS，利用移液器反复轻微吹打细胞，致细胞脱落，1000rpm/min离心细胞收取，转至1.7mL离心管，加入1mL Trizol溶液，加入0.2mL氯仿。Vortex混匀，5min室温静置，然后11000rmp离心，时间为15min。将上层的水相转入到1.5mLEP管，添加等体积异丙醇，Vortex混匀，然后放于-20℃冰箱中，过30min后，11000rmp离心，10min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1mL 75%的乙醇，然后洗涤RNA沉淀，最后7000rmp离心6min。弃上清，静置5min。
NanoDrop定量后按照TOYOBO 的RT-PCR试剂盒说明书进行。应用Primer Premier 5.0的软件设计、合成ALP、OC、OPN基因引物（上海博尚生物技术有限公司），其特异性利用融解曲线进行分析验证。
cDNA表达丰度采用Ct值进行检测，β-actin的Ct值作为内参。
反转录结束之后，利用SYBR Green（Toyobo）按说明书进行荧光定量PCR。
3步法进行Q-PCR扩增，反应条件如下表1。
表1 Q-PCR扩增条件
温度（°C） 时间（S） 循环次数
95 10 1
92 15 45
60 20 45
72 35 45
（2）MTT法测生长率：各组细胞， 经胰酶消化后， 进行计数， 以2.5*103/L接种于24 孔板中， 每一孔添加250?L，3组均处于37℃、5%CO2 条件下进行培养，在检测前，每孔加入4mg/mLMTT25L，继续培养3h， 吸弃培养液， 每孔添加150?L DMSO，振荡10min， 利用酶联免疫检测仪，在490nm 波长进行检测各孔吸光光度值，每日检测3孔， 进行均值计算。
观察不同组别不同时期细胞的形态学，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线，进行生长率的判断与计算。同时观察不同组别的ALP、OC、OPN基因表达情况。
1.3 统计学处理
采用SPSS软件进行统计处理。所有数据采用x±s显示，组间差异比较，用两样本的均数t 检验，P
2 结果
2.1 细胞形态学情况
细胞生长的形态学特点如下：具有良好状态，具有梭形形状，且放射状生长，细胞间贴附紧密，70%细胞沿细胞体的长轴排列有序（见图1），细胞具有良好的纯度。通过0.25%胰蛋白酶消化后，传代培养的骨髓基质干细胞生长明显速度增加。但传至20代左右，生长速度会逐渐减慢，细胞内产生颗粒状的堆积物。
图1 传代第3代骨髓基质干细胞（×100）
2.2 生长率情况
该实验分为诱导组A，即诱导培养液组，诱导组B，即含DA-2006的培养液组，对照组，即普通培养液组。通过MTT法，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线（见图2）
3组实验进行一周的细胞培养后，3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低（B组相比于A组，F=0.152，P=0.453），说明组B的诱导能力高于其他两组，但是无明显差异。
图2 骨髓基质干细胞生长曲线图
2.3 成骨分化标志基因表达情况
标志骨髓基质干细胞的成骨分化的基因有ALP[5]、OC、OPN，这些基因在骨形成中担当着重要作用。通过荧光定量PCR技术，检测这3个标志基因在添加有诱导培养液或者含DA-2006的培养液的条件下的表达变化（见图3）。结果显示对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A（X2=3.621，6.521，4.052，P=0.012，0.000，0.009）。
图3 骨髓基质干细胞的成骨分化标志基因表达情况
3 讨论
当前骨髓基质干细胞已经被实验证实其作为载体在细胞治疗和基因治疗方面的价值[6-7]。骨髓基质干细胞相对较容易从骨髓中抽取分离，同时较容易进行体外细胞培养及转染多种外源基因。因此，骨髓基质干细胞相比HSCs在基因治疗方面有更多优势[8-10]，例如HSCs的分离需求大量的骨髓，并且这些细胞是很难大批量体外培养的。
经典的诱导骨髓基质干细胞分化成成骨细胞的方法包括流式细胞仪分离技术，密度梯度离心法，贴壁筛选法[11-12]。操作较简单的方法为贴壁筛选法，该法筛选的细胞容易成活。在细胞培养过程中，换液次数减少可以保护骨髓基质干细胞的活力。
多巴胺受体可能作为肿瘤干细胞的生物标志物。将人脐带间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元并观察其中脑源性神经营养因子的表达情况，研究指出，脐带间充质干细胞经诱导后可向多巴胺能神经元分化，且分化后的细胞可表达脑源性神经营养因子。而对于诱导骨髓基质干细胞分化的方法，目前主要是利用骨形成蛋白或者地塞米松[13]进行诱导，本实验探讨人工合成的小分子化合物DA-2006的诱导作用及其机制。结果显示3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低，而且诱导组B的密集程度最高，说明含DA-2006的培养液条件下的骨髓基质干细胞的细胞活性比较强，该结果也验证了增值与分化的矛盾统一原理[14-15]。
人类的骨质是由成骨细胞进行骨质的累积和破骨细胞进行骨质的降解相平衡的一个完美的平衡过程。近年来科学家发现ALP、OC、OPN参与了肿瘤形成、细胞增殖和分化、病毒防御等几乎所有的生物学过程，它可能有非常广泛多样的生物功能。本文通过荧光定量PCR实验，检测骨髓基质干细胞在诱导分化后的相关成骨标志基因的表达变化，可以反应其成骨分化水平，骨碱性磷酸酶（LAP）作为成骨细胞表型的标志物之一[16，17]，可反映成骨细胞的活性和功能状况，主要应用于小儿佝偻病早期诊断，骨源性碱性磷酸酶从骨质中分泌，当骨头中钙盐沉淀出现不足时，分泌会增多，骨中钙盐充足则分泌减少。同时相关研究显示，在干细胞诱导分化为成骨细胞时，OPN与OC的表达水平显著上调。本文结果显示，对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A。可能机制在于作为干细胞一种开关的多巴胺能控制成骨中新细胞的形成。如果多巴胺信号被抑制，它们就不能产生新的成骨细胞。
总之，本研究探讨了DA-2006对骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞的作用及分子机制。研究发现在含DA-2006的细胞培养液诱导环境下，骨髓基质干细胞的成骨分化情况较强于经典的地塞米松诱导效果，其机制的发挥可能与上调ALP、OC与OPN的表达水平有关。
参 考 文 献
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第12篇
关键词： 植物 干细胞 教学应用
干细胞是指具有自我更新能力和增殖分化能力的一类细胞，目前学习者对动物干细胞的理论和应用知识掌握较多。由于植物细胞的全能型，长期以来很多学习者误认为植物中不存在干细胞，再加上教师对干细胞这部分内容的讲授不透彻，造成学习者对植物干细胞、动物干细胞及植物愈伤组织细胞的概念往往混淆不清，存在植物干细胞认知上的错误，因此很有必要对植物干细胞的相关知识进行总结。
1.植物干细胞
1.1植物干细胞的概念和特征。植物干细胞是位于植物分生组织中固有的未分化细胞，具有自我更新和再生能力。植物干细胞具有很强的自我更新能力，并且可以分化为特化的细胞类型，这些特化的细胞产生新的植物器官（根、茎、叶和花等）。这些细胞表型的变化是由影响植物功能的基因表达变化引起的，受到内源性和外源性的信号共同调节[1]。植物干细胞的特征包括：能够形成所有分化细胞的类型；具有自我更新的能力，维持干细胞的数量；位于分生组织。
1.2植物干细胞与动物干细胞的比较。在动物中，通常将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有全能性，它可以分化形成所有的成体组织细胞，甚至发育成为完整的个体；成体干细胞（如造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞等）大多为多能干细胞，它们具有多向分化的潜能，可以分化形成除自身组织细胞外的其他组织细胞，真正具有全能性的细胞是受精卵和其分裂产生的子细胞。与此相比，许多植物干细胞具有旺盛的再生能力，在干细胞的整个生活周期中能使植物生长并且产生新的器官（如植物茎端分生组织中的干细胞和根端分生组织中的干细胞）[2]。
1.3植物干细胞与植物愈伤组织细胞的比较。植物愈伤组织细胞是由成体细胞经过脱分化而形成的具有分化能力的细胞，虽然愈伤组织的分化能力与植物干细胞相似，但它们在来源、细胞分化和增值能力等方面是不同的。植物愈伤组织细胞来源于异质性的体细胞，它是体细胞对损伤的暂时响应，是一个临时获得刺激的细胞，尽管愈伤组织具有干细胞样属性，但愈伤组织不易维持稳定的细胞分裂[3]。而植物干细胞来源于植物分生组织的同质性细胞，它们在植物的整个生命周期可以产生并形成新的组织和器官。
2.植物干细胞的类别与调控
根据分生组织的种类，植物干细胞可分为茎尖分生组织中的干细胞和根尖分生组织中的干细胞。
2.1茎尖分生组织中的干细胞。茎尖分生组织包括中心区和中心区下方的带状区。中心区包括上部干细胞区和下部的组织中心（即干细胞区下部靠近带状区的小细胞群）。干细胞分裂时上部的干细胞分裂成两部分子细胞，一部分干细胞后裔留在中心区并保持多能性；另一部分细胞则离开茎尖分生组织的中心区，但保持较快的分裂速度，最终分化为叶或者花原基器官，为侧生器官的生长和分化提供保证[4]。目前已知的位于干细胞周围“组织中心”的WUS（WUSCHEL）是保持茎尖干细胞特征的必要信号分子，它参与对茎尖干细胞的稳态调控，使整个植物茎尖干细胞保持连续不断的自我更新和分化。
2.2根尖分生组织中的干细胞。静止中心位于根尖分生组织中心，干细胞则围绕在静止中心细胞周围。静止中心作为组织中心维持周围干细胞的稳定和功能，静止中心周围的干细胞分布于中柱鞘外侧，维管干细胞形成维管组织、皮层/内皮层干细胞，进而形成皮层、内皮层与根冠干细胞，然后形成根冠细胞。目前已知的WOX5（WUS-RELATED HOMEOBOX 5）作为最主要的干细胞决定因子，特异的表达于根端分生组织的静止中心，参与对根端干细胞的稳态调控，使整个植物的根尖干细胞保持连续不断的自我更新和分化[4]。
3.植物干细胞的应用
3.1生产天然产物，开发药品或者化妆品。传统的植物细胞培养存在细胞生长缓慢、生产成本高等问题，而植物干细胞培养具有遗传稳定、细胞生长率和生长模式稳定、凝集程度低等优点，可以用来大量生产有用的植物天然产物，并用于药品、功能性食品、化妆品中。如悬浮培养紫杉干细胞可以生产松香烷型三环二萜、美丽红豆杉素A和美丽红豆杉素B等产物，以达到抑制肿瘤血管的生成和抗癌作用，而且其产值远大于传统细胞培养的产值，具有很好的开发前景[5]。
3.2植物细胞系库的建立和利用。一般的植物细胞冻存后存活率低，恢复生长能力慢，因此限制其在植物细胞培养中的应用。植物干细胞系在低温储藏方面有很大的优势，不仅有高的存活率，而且在低温储藏前后遗传物质没有变异，是植物细胞系库建立的很好材料。细胞系库的建立不仅会使研究材料的供应得到满足，而且使植物细胞系的研究周期缩短，并在植物种子资源的保存和利用方面发挥重要作用[6]。除了以上应用外，利用植物干细胞还可以进行植物干细胞的分子调控机制和分子设计育种等方面的研究。
4.结语
植物干细胞是位于植物分生组织中固有的未分化细胞，它们具有自我更新和再生能力。根据目前学习者对植物干细胞认识不足的实际，本文对植物干细胞、动物干细胞及植物愈伤组织细胞的概念进行了辨析，并对植物干细胞的分类及应用进行了论述。学习者清楚植物干细胞、植物愈伤组织细胞和动物干细胞的概念后，在学习植物干细胞的理论和应用等方面时才能正确理解相关的知识点。
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第13篇
一、分子水平的克隆—PCR技术
该科技技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
PCR由三个基本反应步骤：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链 DNA解旋，使之成为单链，以便它与引物结合;②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合;③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
二、细胞水平的克隆—动物细胞培养技术
动物细胞培养是用酶解法将组织碎块分离成单个细胞，用培养液制成细胞悬浮液，在体外适宜条件下使细胞生长繁殖，并保留一定的结构和功能特性。
(一)细胞培养所需的条件
1.培养液
现多用合成培养液。合成培养液有多种，不同培养液适用于不同细胞。可根据培养细胞的特殊要求进行添加：抗生素、有机补充物(如丙酮酸钠，谷胺酰氨等)、促细胞分裂因子(生长因子类的FGF等)、贴壁和铺展因子(如胶原蛋白，纤粘蛋白等)。
2.血清
在细胞培养液中必须添加一定量的血清方能获得成功。血清中除了含有细胞生长的部分氨基酸外，还有促进细胞生长和贴壁的成分。不同动物血清的作用差别很大，即使同一种动物的不同个体间的差异也很显著。不同种细胞要求血清量也不同，大部分细胞生长液中加入10%血清已可满足细胞生长要求。目前国内外正在研制无血清培养液，以避免血清中某些物质对细胞生长和病毒复制的影响。
3.PH
细胞生长的PH为6.6-7.8，但最适PH 7.0-7.4。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。
4.温度
细胞培养的最适宜温度应与细胞来源的动物体温一致。
此外，成功的细胞培养还需要严格的无菌操作及洁净的培养器皿。
(二)细胞生长的三个阶段
1.潜伏期
细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。
2.指数生长期
指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。
3.停滞期
即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。
(三)动物细胞的培养
1.原代细胞(primary cell)
动物组
织经胰蛋白酶等消化、分散、获得单个细胞，在培养皿中大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一。原代细胞一般对病毒较易感染，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。
2.二倍体细胞株(diploid cell strain)
将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性则基本无变化。
3.传代细胞系(establishell cell line)
与上述两类细胞不同，这类细胞在传代过程中染色体发生异常变异，在体外可无限制分裂。
三、个体水平的克隆—动物细胞核移植技术
所谓细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。
(一)供体核的获得
供体核可以是早期胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞。早期都采用合子核到64细胞期的胚胎细胞核质体分裂球作供体细胞核，80年代开始，随着胚胎干细胞(embryo stem cells，ES)的建立和对其研究的深入，人们对胚胎干细胞在核移植方面的应用前景寄予厚望，但ES建系太困难，仅在小鼠上获得成功。1997年 Dolly羊的出现，开始了体细胞的核移植，并发展很快。
(二)受体细胞去核
作为细胞核移植的受体细胞主要有三类：去核的卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎，其中卵母细胞应用最为广泛。研究证明，体外成熟培养的卵母细胞核移植成功率不如体内成熟的卵母细胞，其原因可能是卵母细胞在体外成熟过程中，需要合成一些蛋白质来完成第一次减数分裂，其活动有可能受到抑制。
(三)核卵重组
在显微操作仪操纵下，用一直径接近卵裂球大的移植针吸取一枚分离出的完整卵裂球，注入去核的受体卵母细胞的间隙中，根据移入的部位不同，可分为带下移植和细胞质内注射。在移植针移开后，对移植卵裂球上方的透明带施加压力使卵裂球与卵母细胞接触。
(四)细胞融合与激活
由于卵细胞去核过程中破坏了卵膜和一部分细胞质，若直接移植，成功率很低，故需对重组胚融合，其采用的方法有仙台病毒法、物理或化学方法(如电融合法、钙离子载体、乙醇、蛋白质酶合成抑制剂等)激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育过程，电融合法更常用。
(五)重构胚培养与移植
重构胚需一定时间的培养，方可移植到受体，家兔和猪重构胚在体外培养24h以内，就可通过非手术移植，而羊和牛重构胚所需培养时间较长，一般发育到囊胚或桑椹胚时移植。
第14篇
【关键词】 ，大鼠；神经前体细胞；神经节，脊；细胞培养技术；免疫荧光组织化学
Observation of neural precursor cells in rat dorsal root ganglia
【Abstract】 AIM: To investigate neural precursor cells in rat dorsal root ganglia (DRG). METHODS: DRG from embryonic and adult rats were frozen and sliced for Brdu， Nestin， P75 immunofluorescence histochemical test.Additionally， the cells of ganglia were respectively cultured and observed in their proliferation and differentiation. The cells were identified by Brdu， Nestin， P75， NF and GFAP immunofluorescence histochemical test. RESULTS: In the frozen DRG sections from adult and embryonic rats， Brdu/Nestin and Nestin/P75 positive cells were found. The cultured cells could pide and proliferate and showed Nestin， Brdu， P75 positive. The thirdpassage cells could differentiate in the presence of fetal bovine serum. The differentiating cells showed NF and GFAP positive. CONCLUSION: There are neural precursor cells that can pide and proliferate in rat DRG. They can differentiate into neuron and glial cells.
【Keywords】 rats; neural precursor cells; ganglia， spinal; cell culture techniques; immunofluorescence histochemistry
【摘要】 目的： 探讨大鼠脊髓背根神经节(DRG)内是否存在神经前体细胞. 方法： 取成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片，进行Brdu， Nestin， P75免疫荧光组织化学检测，分别取成年和胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养，观察其增殖与分化情况，并行Nestin免疫组织化学和Brdu， P75， NF， GFAP免疫荧光组织化学鉴定. 结果： 在成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片上均见有Brdu/Nestin和Nestin/P75免疫荧光双标细胞. 细胞培养观察到取自DRG的细胞有分裂增殖，呈Nestin免疫组织化学阳性反应和Brdu， P75免疫荧光组织化学阳性反应；培养第三代细胞加入胎牛血清后出现分化，分化细胞呈NF和GFAP免疫荧光组织化学阳性反应. 结论： 大鼠DRG内存在有分裂增殖的神经前体细胞，这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.
【关键词】 大鼠；神经前体细胞；神经节，脊；细胞培养技术；免疫荧光组织化学
0引言
成年动物的中枢神经系统内存在有神经干细胞（neural stem cells， NSCs）已成为公认的事实，这些细胞可以自我更新，分裂增殖，并且向神经元与神经胶质细胞分化［1-2］. NSCs的发现给神经系统损伤的修复带来了希望. 随着研究的深入，人们认识到干细胞广泛存在于体内. 但外周神经系统是否存在NSCs的研究报道甚少. 我们用免疫组织化学和细胞培养的方法观察了成年和胚胎大鼠脊髓背根神经节（dorsal root ganglia， DRG）内神经前体细胞.对哺乳动物外用内神经前体细胞进行了有益的探索.
1材料和方法
1.1材料健康孕14 d和成年SD大鼠，东南大学医学院实验动物中心提供；细胞培养主要试剂： DMEM/F12(1∶1)，N2，无血清培养液添加剂B27，表皮生长因子（epidermal growth factor， EGF），碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），胎牛血清（Gibco公司）；小鼠抗大鼠Nestin mAb， 小鼠抗大鼠NF mAb，小鼠抗大鼠BrdU mAb，兔抗大鼠GFAP多克隆抗体（Sigma公司）;羊抗小鼠SAP试剂盒，BCIP/NBT染色试剂盒（北京中杉公司）;兔抗大鼠P75多克隆抗体，山羊抗小鼠IgG: FITC，山羊抗小鼠IgG: TRITC，山羊抗兔IgG: TRITC（武汉博士德公司）.
1.2方法
1.2.1切片制备与染色取孕14 d和成年大鼠于处死前3 d，分别给予BrdU mAb腹腔注射2次(每次50 mg/kg). 于深麻下，打开胸腔，先后用生理盐水和40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液进行升主动脉灌注. 取出DRG，置于40 g/L多聚甲醛内后固定，次日行冰冻切片，片厚15 μm. 将切片分为三套，分别行HE染色和BrdU/Nestin， P75/Nestin双标免疫荧光组织化学染色.
HE染色： DRG切片入苏木精染液染色，水洗玻片上多余染液，10 mL/L盐酸乙醇分色. 流水冲洗，反蓝. 蒸馏水冲洗；1～5 g/L伊红染液染色，依次经700， 850， 1000 mL/L乙醇脱水；二甲苯透明，封片.
BrdU/Nestin双标免疫荧光组织化学染色：依次加入500 mL/L甲酰胺，2×SSC， 1 mol/L盐酸， 1 g/L胰蛋白酶及封闭羊血清后，再加入小鼠抗大鼠BrdU抗体（1∶200），4℃过夜，加入山羊抗小鼠IgG: TRITC（1∶300），加封闭羊血清，加小鼠抗大鼠Nestin抗体（1∶200），4℃ 8 h，加山羊抗小鼠IgG: FITC（1∶300），甘油缓冲液封片.
P75/Nestin双标免疫荧光组织化学染色： 依次加封闭羊血清，兔抗大鼠P75抗体（1∶200）， 4℃过夜，加入山羊抗兔IgG: TRITC（1∶300），小鼠抗大鼠Nestin抗体（1∶200），4℃ 8 h，山羊抗小鼠IgG:FITC（1∶300），甘油缓冲液封片.
1.2.2背根神经节细胞原代培养取孕14 d大鼠于麻醉后取出胚鼠，分离出DRG，DMEM液冲洗，剪碎，放在300目的滤网研磨过滤. 收集过滤液，离心5 min，1000 r/min. 弃去上清. 再次离心后，所得细胞用含有EGF，bFGF的DMEM重悬. 将细胞以1×108/L浓度接种于10 mL培养瓶内. 置于培养箱中培养（37℃， 50 mL/L CO2）.
取成年大鼠麻醉后，脱颈处死消毒，解剖分离出DRG. 将收集到的神经节组织进行原代细胞培养（方法同前）.
1.2.3细胞传代培养在细胞培养到7 d时，用2.5 g/L的胰酶消化5 min，加入100 mL/L胎牛血清终止消化，再用吸管吹打成单细胞悬液，离心弃上清，反复两次. 所得细胞用前述培养液重悬. 将一部分细胞悬液调整成密度为1×108/L，种入新的培养瓶中，继续按照先前条件，置于培养箱培养. 另取一部分细胞悬液，用培养液稀释到2×103/L，接种入96孔培养板中，每孔100 μL. 2 h后在倒置显微镜下观察，对只有一个细胞的培养孔做标记. 以后每天动态观察标记孔中单细胞的分裂和克隆形成情况. 在细胞分裂增殖到一定程度后，按照同样的方法进行第二次传代.
1.2.4培养细胞的鉴定选择第二次传代后有细胞增殖的培养孔，分为三组，前两组分别加入5 μmol/L的BrdU， 100 mL/L胎牛血清，第三组不加任何物质. 继续培养3 d后，对加入BrdU的培养孔中的细胞进行抗BrdU的免疫荧光组织化学染色（TRITC标记）. 对加入胎牛血清的培养孔的细胞分别进行GFAP，NF的免疫荧光组织化学染色（GFAP用TRITC标记，NF用FITC标记）. 第三组进行Nestin免疫组织化学染色（SAP法），苏木素复染.
上述切片和培养细胞分别在普通和荧光显微镜、倒置显微镜下观察，并照相记录.
2结果
2.1HE染色在低倍光镜下可见，整个DRG呈梨形，其外膜的结缔组织伸入节内，把节内细胞分成多群. 在高倍光镜下，节内细胞多数呈圆形，体积较大，胞质嗜酸性，胞核大而圆，嗜碱性，染色浅，核仁清楚. 围绕胞体外周有一层扁平或立方形细胞即卫星细胞. 在细胞群之间可见到大量神经纤维（图1）.
图1成年大鼠背根节HE染色×100（略）
2.2免疫荧光组织化学检测TRITC和FITC分别标记的BrdU， Nestin免疫荧光抗体检测显示，在胚胎鼠和成年大鼠的神经节内均可见BrdU， Nestin和BrdU/Nestin免疫荧光单标和双标细胞. BrdU单标细胞核圆形，较大，呈红色，散在分布于节内；Nestin单标细胞圆形或椭圆形，呈绿色；BrdU/Nestin双标细胞显示为红色的核和绿色的胞体，核质比高（图2）. 用同样方法也可以检测P75/Nestin双标细胞，P75单标细胞呈红色，大小不等，圆形；Nestin单标细胞为绿色；双标细胞呈棕黄色，散在分布于各细胞群之间，多呈圆形，胞体中等大小，有的可见突起，胞核较大（图3）.
图2成年大鼠背根节BrdU/Nestin免疫组织荧光化学染色×400（略）
图3胚鼠背根节P75/Nestin免疫组织荧光化学染色×400（略）
2.3原代细胞培养DRG细胞悬液原代培养后第2日即可见圆形、折光性较强的细胞，细胞小而透明. 随着培养天数的增加，细胞数量逐渐增多，可见呈分裂相的细胞和细胞团. 继之细胞形态变大，有的细胞呈悬浮状态. 到7~10 d时，可见到大部分呈葡萄串状或桑椹状的细胞团，体积较小，细胞团内的细胞呈圆形，大小不一；少部分呈散在成群分布，细胞多数为梭形，伸出2~3个突起. 培养到20 d时，可见到一种单个巨大的圆形或椭圆形细胞，有的文献上称之谓“O细胞”［3］. 细胞传代后生长速度变慢，有一部分细胞会停止生长. 成年鼠与胚胎鼠DRG培养的细胞形态上未见有明显差异，但胚鼠生长速度快于成年鼠.
2.4培养细胞的鉴定对传代两次后的培养细胞行免疫组织化学染色显示，这些细胞呈Nestin阳性，细胞呈梭形或多角形，有突起，核大而深染(图4). 免疫荧光组织化学检测，在加入BrdU的培养孔内可见BrdU阳性细胞，细胞核圆，较大，在荧光显微镜下发出红光. 在加入胎牛血清的培养孔内，可见GFAP和NF阳性细胞，GFAP阳性细胞呈红色，形态不规则，突起较多且长；NF阳性细胞呈绿色，胞体较大，圆形或多角形，突起少并且短（图5，6）. 3讨论
从起源上来说，DRG来自神经嵴. 神经嵴细胞是一种多能干细胞，其衍化物具有3个经典胚层衍化物的性质. 据报道［4-5］，在成年动物的胃肠道和皮肤组织中仍然存在着神经嵴细胞. 在生后15 d大鼠的胃肠中存在的神经嵴细胞仍然具有向TH阳性神经元分化的能力. 表皮内存在的神经嵴细胞也具有比较高的可塑性，可以分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞和黑色素细胞. 本实验通过免疫组织化学和细胞培养的方法发现在大鼠的DRG内亦存在有分裂增殖能力，并可以向神经元和神经胶质细胞分化的神经前体细胞. 说明神经前体细胞不但存在于中枢神经系统，也存在于周围神经系统.
图4成年大鼠背根节传代培养细胞Nestin免疫组织化学染色，苏木素复染×200（略）
图5成年大鼠背根节传代培养细胞分化后GFAP免疫荧光组织化学染色×400（略）
图6成年大鼠背根节传代培养细胞分化后NF免疫荧光组织化学染色×400（略）
P75是低亲和力神经营养因子受体，有文献报道把它作为神经嵴细胞的标志物［6］. 在大鼠的神经节内检测到Brdu/Nestin和P75/Nestin双标细胞，说明在神经节内可能存在着具有原始特性的神经前体细胞. 这些前体细胞培养后为球形，梭形或多角形. 单个细胞不断分裂后可以形成克隆. 其子代细胞可以在一定条件下发生分化. 决定NSCs定向分化的机制有两种:一是细胞自身基因调控;另一种是外来信号调控和NSCs所处的内环境［7-9］. 在向培养细胞中加入胎牛血清后，对其进行的GFAP和NF的免疫荧光组织化学染色表明，培养细胞当中出现了较多的具有神经胶质样和神经元样细胞.
与中枢的NSCs培养相比，DRG内细胞培养有两个不同： ① 不形成典型的“神经球”，克隆的形态呈较小的桑椹状，葡萄串状或散在成群状. ② 细胞之间连接松散. 在DRG培养的细胞传代时，用胰酶消化法和机械分离法分离细胞都比分离中枢的神经干细胞球容易.
对胚鼠和成年鼠的背根节细胞培养进行比较，也存在有差异. ① 胚鼠的原代培养细胞生长得更快. ② 胚鼠的原代细胞形成的克隆数多于成年鼠. ③ 胚鼠O细胞产生的数目往往更多. 这种体积巨大的细胞很可能发育为非神经细胞，如黑色素细胞等. 在有关神经组织标志物免疫组织化学检测时O细胞表现为阴性结果［3］. O细胞的出现以及其在发育不同阶段的数量变化有何意义，目前尚不清楚. 但无论是胚鼠还是成年鼠的培养细胞，传代以后其生长速度都会减慢，传代后两者生长速度基本相同. 另外随着培养时间的延长，细胞的增殖能力也逐渐减弱. 神经嵴细胞的发育是具有时间性和空间性的［10］，那么作为其后代的神经节内神经前体细胞，其增殖能力和分化的潜能有多大，受哪些因素的调控，能否作为神经系统疾病细胞替代治疗的供体等，尚须做大量的研究.
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第15篇
放免法检测胰岛素分泌量。结果: 在大鼠β细胞素浓度为20～30 mg/L时， 大鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的数量明显高于对照组; 其胰岛素分泌量明显高于对照组(P
【关键词】 β细胞素; 糖尿病 胰腺干细胞
胰岛移植是治疗糖尿病的一个热点， 但供体的缺乏和存在免疫排斥反应限制了其应用。胰腺干细胞能定向分化成胰岛细胞， 这为胰岛移植提供了新的材料来源［1］。细胞生长因子在干细胞的发育和分化中发挥了重要作用。研究表明， β细胞素（betacellulin， BTC）属于表皮细
胞生长因子家族中的一个成员， 具有多种生物学功能， 胰腺BTC mRNA的高水平表达， 提示BTC可能在胰腺组织的发育中发挥重要的生理作用［2， 3］。本研究中通过建立稳定的胰腺干细胞体外培养方法， 将β细胞素用于胰腺干细胞的体外培养， 观察其是否能促进胰腺干细胞转分化为成熟的胰岛， 为克服胰岛移植时的供体短缺提供新的胰岛来源。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（体质量250 g， 雌雄不限， 饲养于清洁级动物房自由饮水和进食， 手术前1 d禁饮食）由第四军医大学动物中心提供， Ⅴ型胶原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 碱性成纤维细胞生长因子2(basic fibroblast growth factor 2， bFGF2)、 角朊细胞生长因子(keratinocyte growth factor， KGF)、 ITS(insulintransferin selenium)购自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 购自杭州四季青生物制品公司; 双硫腙（dithizone， DTZ）、 二甲基亚砜（DMSO）、 烟碱购
于华美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗体购自北京中山生物工程有限公司; 免疫组化SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 购于Gibco公司; 胰岛素放射免疫分析试剂盒购于北京北方生物技术研究所; 大鼠β细胞素由本研究室采用基因工程方法获得［4］。
1.2 方法
1.2.1 大鼠胰腺干细胞的分离、 培养
采用宋振顺等［5］的方法， 首先以Ⅴ型胶原酶消化成年SD大鼠胰腺组织， 然后采用非连续密度梯度离
心法纯化消化后的胰腺细胞， 去除胰岛细胞后， 收集外分泌部细胞进行培养。所获的细胞培养在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培养液中， 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L链霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天将培养液改为DMEM/F12， 其中加入ITS（5 mU/L胰岛素+5 mg/L转铁蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B， 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L烟碱， 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d换液1次。于相差显微镜下观察细胞生长状况和克隆形成情况。
1.2.2 胰腺干细胞免疫组织化学染色
分别取培养3、 7、 14 d后的细胞爬片， 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后， PBS缓冲液冲洗玻片， 分别与兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗体4℃反应过夜， 二抗及呈色反应参照SP试剂盒说明。二氨基联苯胺(DAB)显色， 显微镜观察， 自来水冲洗， 苏木精复染， 中性树胶封固。阴性对照用PBS代替一抗。
1.2.3 双硫腙染色与计数
双硫腙(DTZ)为螯合剂， 可与铅、 铜、 锌等螯合， 人和动物（豚鼠除外）的胰岛β细胞因含有锌， 双硫腙染色呈猩红色， 其他胰岛细胞不着色。配制及染色方法: 用二甲基亚砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO， 用Hanks（pH7.8）1∶100稀释， 0.22 μm滤膜过滤， DTZ与胰腺干细胞培养后转分化形成的克隆混合， 室温5～10 min后做镜检。按胰岛的直径>50 μm计数染色的胰岛样细胞团，
1.2.4 胰岛素检测
胰腺干细胞转分化后形成的胰岛克隆对葡萄糖刺激有胰岛素分泌反应。显微镜下挑取100个胰岛样细胞团克隆， 培养于24孔培养板， 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育1 h后， 更换为含高糖（16.7 mmol/L）加烟碱（10 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育2 h后， 取培养液上清， 采用放免法测定胰岛素含量。
1.2.5 实验分组
按照实验方法1.2.1中胰腺干细胞的培养方法培养大鼠胰腺干细胞， 并将其设为正常对照组， 各实验组中分别加入不同浓度的大鼠β细胞素， 依次为10、 20、 30、 40、 50 mg/L， 共设立5个实验组。
1.2.6 统计学处理
采用Student t检验方法， 应用SPSS10.0统计软件完成统计学分析。
2 结果
2.1 成人胰腺导管上皮细胞光镜下形态学变化
收获的非胰岛细胞于24～48 h内部分黏着于培养瓶底。在第1～3天换液时， 大量漂浮于培养液中的外分泌细胞和胰岛被弃除。培养5 d内， 单个贴壁细胞迅速扩增为鹅卵石样小细胞片进而分裂增殖成单层细胞。培养第3天改用无血清培养液及加入霍乱毒素， 可明显地促进导管上皮细胞的生长和抑制成纤维细胞的污染。细胞培养第7天胰岛样细胞芽团开始从细胞片或单层细胞的中央或边缘出现， 同时鹅卵石样细胞片迅速扩大。此后大量胰岛样细胞芽团和囊状细胞团出现。双硫腙染色呈弱阳性。第21～27天， 大量较成熟的胰岛样结构出现，双硫腙染色强阳性（图1）。
2.2 免疫组织化学
（1）CK19染色: 细胞培养第1天， 4孔板中的部分细胞呈CK19抗体染色强阳性。此时的细胞多为贴壁的单个或小细胞片， 亦可见较多阴性反应的细胞碎片。培养3 d后， 细胞片不断扩大， 第7天起， 可见胰岛样细胞芽团出现并逐渐增多， 绝大多数细胞集落和胰岛样细胞芽团均为CK19强阳性（图2）。（2）PDX1染色: 培养第1天， 4孔玻板中的细胞大部呈PDX1抗体染色阳性。但在同一细胞片中细胞染色程度不一， 部分呈强阳性， 部分呈弱阳性， 少数细胞为阴性。第7天起， 可见胰岛样细胞芽团逐渐增多; 第11～27天， 胰岛样细胞芽团不断增大， PDX1抗体染色呈强阳性(图3)。
2.3 BTC对胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的影响
在正常对照组中， 胰岛克隆为（139±8.5）个/g胰腺， 各实验组培养液中加入不同浓度的大鼠β细胞素后， 胰岛克隆的数量明显增加， 在大鼠β细胞素的浓度为20～30 mg/L时， 培养液中胰岛样细胞团克隆的数量增加最为明显
(P
2.4 胰岛素分泌量的检测
各实验组分别挑取100个胰岛样细胞团（直径＞50 μm）， 培养于24孔培养板中， 胰岛素分泌试验结果表明， 在正常对照组中， 培养液上清中胰岛素含量为（3.0±0.4）μU/100胰岛。各实验组培养液中加入不同浓度的大鼠β细胞素后， 培养液中胰岛素的分泌量也有明显增加， 在大鼠β细胞素的浓度为20～30 mg/L时， 培养液中胰岛素的分泌量增加最为明显(P
3 讨论
由于胰岛素产生细胞的缺陷或缺乏导致的Ⅰ型糖尿病不仅对患者及其亲属， 而且对社会均带来了严重的负担。开发胰岛素产生细胞新的来源诸如猪的胰腺、 人体胰腺导管上皮细胞、 胎儿胰腺干细胞和胚胎干细胞成为目前研究的热点。其中最有前景的是由人胰腺导管上皮细胞转
分化为胰岛β细胞。
本实验观察到胰腺导管上皮细胞在培养第1天， 绝大多数贴壁生长的细胞为单个细胞或很小的细胞团。这些单个细胞和小细胞片在7 d 内迅速生长扩增为鹅卵石样细胞片和大面积单层细胞片。胰岛样细胞芽团于培养第7天出现， 部分细胞PDX1 的表达及CK19 染色阳性从培养
第1天即开始。PDX1基因是一种在胰岛细胞发育、成熟过程中有高表达的基因， 而CK19是胰腺导管上皮细胞向干细胞转化的标志， 部分细胞PDX1的表达及CK19 染色阳性说明培养的细胞自第一天起即开始转分化，这与Gmyr等［6］所报告的结果相似。
近年的研究表明， 一种肽类表皮细胞生长因子β细胞素（BTC）在活体动物体内能有效的促进糖尿病鼠及90%胰腺切除鼠胰岛细胞的再生和成熟［7］， 将大鼠胰腺切除90%后， 立即给大鼠尾静脉注射BTC（0.5 μg/g体质量）， 10 d后大鼠糖尿病状态有所缓解， BTC治疗组大鼠血
糖水平显著低于对照组， 而血浆胰岛素水平明显高于非治疗组， 持续时间长达4周， 治疗30 d后病理学检查证实BTC组大鼠胰岛β细胞团较对照组的大， 胰岛样细胞团的数目明显增多， 糖耐量试验表明BTC治疗的大鼠对糖刺激有很好的反应性［8］; 用链脲霉素制成的糖尿病小鼠注射BTC
后， 也取得了同样的效果［9］， Cho等［10］研究发现， BTC能促进人类胚胎干细胞向胰腺β细胞的分化由此可以推断， BTC可能促进了β细胞的增殖或者是促进了胰腺干细胞增殖分化为β细胞， 分泌胰岛素达到降低血糖的作用。
本研究中我们首先按照宋振顺等的胰腺干细胞培养方法培养出大鼠胰腺干细胞， 并对其转分化为胰岛的情况做了初步研究。然后以该培养条件为对照， 在培养液中加入不同浓度的大鼠BTC， 结果发现， 在20～30 mg/L的条件下大鼠β细胞素能有效促进胰腺干细胞的增殖， 促进胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞， 为进一步研究糖尿病疾病的病因， 发病机制， 预防及治疗等提供了一定的实验依据。在本研究中， 当进一步增加β细胞素的剂量后， 胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团受抑制的原因， 我们认为是由于本实验室在进行β细胞素的分子克隆中， 我们的蛋白质纯化和复性工艺存在局限性， 因此， β细胞素的制剂中可能存在较多的无机盐或其他杂质， 当增加β细胞素的剂量后， 可能对胰腺干细胞产生毒性作用， 在今后的工作中需要进一步改善蛋白质纯化和复性工艺， 提高β细胞素的纯度。关于β细胞素在体外促进胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的分子机制， 目前尚不明确， 值得进一步研究。
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