基因工程载体的种类范文
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第1篇
学生做好这一模块的题目，就需要从四个方面入手。即如何切入，何为重点，何为难点，如何改进。
关键词：基因工程；复习；切入点；重难点；改进和调整
中图分类号：G633.91 文献标识码：A 文章编号：1992-7711（2016）08-0005
在过去三年的江苏高考卷中连续出现了三道基因工程方面的题目，而且分值较高。这就不禁让笔者有理由推测明年的高考卷中势必还会出现这种类型的题目，所以笔者在复习这一模块时，特别总结了相关注意事项，并思考如何才能让学生理清思路、游刃有余地把这一模块的题做好。过去三年出的三道题目很类似，都是提供几种限制酶识别序列及切割位点图和转基因操作流程图，考查的重点问题都是限制酶对质粒和目的基因的识别与切割，以及切割后的重组问题，即目的基因的获取和表达、载体的构建。那么，我们的学生要想做好这种题目，还需要形成哪些方面的认识呢？笔者认为在复习时应该从以下四个方面入手：
一、以肺炎双球菌转化实验为复习的切入点
复习前先带学生重新认知该实验的过程，复习巩固生物之间的自然的基因转接过程。从学习角度分析，借助学生所熟知的原型，可以启发、引导以实现温故而知新。这个实验是一个很好的认知原型，让学生能够感悟到大自然的鬼斧神工造就了自然发生的重组DNA，那我们人为地也可以改变，即我们的基因工程。基因工程的操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取，基因的表达与载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。其中，获取目的基因和基因表达与载体的构建是整个工程的核心技术。这一技术涉及许多知识点，如DNA的结构、DNA的复制、限制酶和DNA连接酶及DNA作用与特性、基因的表达、载体的结构组成和作用等。因此，命题者可以从多个角度考查学生对这一系列知识的整体掌握程度及相关的能力。前几年的题目都分别考查了不同的限制酶切割目的基因和质粒后可得到重组质粒的种类、目的基因导入质粒后对质粒结构和功能的影响、DNA水解酶、毒素蛋白与受体细胞中受体间的特异性结合、转基因植物栽培中降低害虫种群抗性基因频率增长速率的措施等问题。基因工程内容重要，基础性知识要求较高，涉及的知识和技术多，同一个问题还可以从不同的角度设置问题，笔者认为，教师在教学中、学生在学习中仍然要格外重视这部分内容。
二、基因工程是现代生物技术的核心内容
高中生物选修内容包括选修一《生物技术实践》、选修二《生物科学与社会》、选修三《现代生物科技专题》。其中，选修三选择了现代生物技术中深刻影响着人类社会的生活、生产和发展的四大工程：基因工程、细胞工程、胚胎工程、生态工程。由于基因工程是现代生物技术的核心内容，所以显得尤为重要。因此，我们在给学生复习的时候要特别重视基因工程的复习，但在复习方法上要侧重理论与原理，注重理解和应用，注重与必修内容、社会热点、生物科技发展的最新成果的联系，注重这些技术在农业、工业以及在医疗卫生事业上的应用，努力用已学的原理和技术去分析理解并解决其中的一些实际问题。复习的深度不宜过深，在操作技术上至少要求一般性了解，不宜过细。另外，微观的技术要注意采用模拟操作的方法加强理解，宏观的技术要尽可能走进工厂或研究所参观学习，加强直观理解，实在没有条件的学校，要想办法找一些视频或录像反复地观看。只有做到理解，才能达到真正掌握和应用。笔者认为，学生之所以一直感到这部分内容难，主要原因就在于他们缺乏这一学习过程，而是局限于看书和记忆。所以，我们在复习这部分内容时一定要将这个过程给他们补上。
三、对双基的掌握和分析、解决问题的能力是复习的重难点
近几年的生物高考命题指导思想都强调以能力测试为指导，重点考查对基础知识和基本技能的整体掌握程度，力求引导中学全面实施素质教育。这一指导思想通过近几年的高考实践已经得到充分的证明，也就是要求学生全面掌握《生物课程标准》和考试大纲规定的基础知识和基本技能。这种整体掌握不但体现在必修和选修上，还体现在要求考生能在相对简单的情境中综合运用进行分析、判断、推理和评价。这一指导思想表现在试题上为：知识覆盖率高，注重基础知识和基本技能，重点内容、主干知识的考查出现频率高且相对稳定，试题的学科内、专题内和专题间综合性强。那么，像基因工程这么重要的知识在近三年高考题中连续出现的现象就不足为奇了。事实上像遗传规律的应用、人类遗传系谱图的分析、免疫、生态等内容也是连年考，但设置的问题和考查的角度不完全相同。这一指导思想要求我们学生既应踏踏实实地、全面系统地、重点突出地掌握基础知识和基本技能，也要能从不同的角度去理解知识，要能挖掘知识之间的区别和联系，并在不同的情境中运用知识。
第2篇
一、考点解读
考点1 基因工程的理论基础
1.基因拼接的理论基础
（1）DNA是主要的遗传物质；
（2）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核糖核苷酸；
（3）DNA的双螺旋结构。
2.外源基因表达的理论基础
（1）基因是控制生物性状独立遗传的单位；
（2）遗传信息的传递都遵循中心法则；
（3）生物界共用一套遗传密码。
3.技术支持
基因转移载体的发现；工具酶的发明；DNA体外重组的实现；重组DNA表达实验的成功。
考点2 基因工程的操作工具分析
1.“分子手术刀”――限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：限制性核酸内切酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。这种酶在原核生物中的作用是防止外来病原物的侵害，将外源DNA切割保证自身安全。
（2）作用特点：①切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，达到保护自身的目的。
②专一性：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（3）作用结果：经限制酶切割产生的DN段末端通常有两种形式――黏性末端和平末端，如下图：
（4）作用实质：使特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开
2.“分子缝合针”――DNA连接酶
（1）类型：有两种DNA连接酶：E・coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
（2）两种DNA连接酶的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：
E・coliDNA连接酶来源：大肠杆菌作用：使黏性末端之间 连接
T4DNA连接酶来源：T4噬菌体作用：既能连接黏性末端，也 能连接平末端，但后者 效率低
【易错警示】限制性内切酶和DNA连接酶的作用部位都是脱氧核苷酸之间形成的磷酸二酯键（不是氢键），只是一个是切开，一个是连接。
3.“分子运输车”――载体
（1）作用：①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；
②利用载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
（2）具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；
②具有一至多个限制酶切点，供外源DN段插入；
③具有标记基因，方便对重组DNA的鉴定和选择。
（3）种类：①最常用的载体是质粒，它是一种的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
②其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【归纳总结】①一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。
②限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
③质粒是最常用的运载体，而不是唯一的运载体，除此之外，噬菌体和动植物病毒也可作为运载体。运载体的化学本质为DNA，其基本单位为脱氧核苷酸。
考点3 基因工程基本操作程序分析
1.目的基因的获取
（1）直接分离：
从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库中获取。
（2）人工合成目的基因：
常用的方法有：①已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。
②以RNA为模板，在逆转录酶作用下进行人工合成。
（3）PCR技术与DNA复制的比较：
PCR技术DNA复制
相同点原理DNA双链复制（碱基互补配对）
原料四种游离的脱氧核苷酸
条件模板、ATP、酶等
不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化
场所体外复制主要在细胞核内
酶热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）细胞内含有的DNA聚合酶
结果在短时间内形成大量的DN段形成整个DNA分子
第3篇
2008－2010年高考生物江苏卷中连续出现了三道基因工程方面的大题，它们是2008年的第32题(8分)、2009年的第34题(7分)、2010年的第27题(8分)。2011年的第33题(8分)。下面以这几道题目为例深度分析该类试题易考知识点及几点思考。
1 试题分析
2008年第32题主要考查了：PCR中使用的DNA聚合酶的最主要特点(耐高温)；PER中退火温度的设定与引物DNA的碱基种类的关系(G-E碱基对多，DNA结构稳定，退火温度高)；DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专业性要求(没有)；将目的基因导入植物细胞采用最多的是农杆菌；两种限制性内切酶切割重组质粒得到DN段的种类。
2009年第34题中第(1)(2)小题考查了两种不同的限制性内切酶切割目的基因和质粒后可得重组质粒的种类。第(3)小题考查目的基因导人质粒后对质粒结构和功能的影响(只能在特定位置，不能在质粒复制原点、启动子、终止子及抗生素抗性基因中)。第(4)～(6)小题分别考查了DNA水解酶、毒素蛋白与受体细胞中受体问的特异性结合、转基因植物栽培种降低害虫种群抗性基因频率增长速度的措施等问题。
2010年第27题仍然考查了质粒DNA热稳定性与碱基种类的关系、酶切位点的选择(不能破坏质粒标记基因及目的基因)、DNA连接酶的作用、单酶切载体和目的基因自身环化的问题(这个问题比较新颖，需要一定的实践经验，考生一般是想不到的，要解决这个问题只有选择两种不同的限制性内切酶来切割目的基因和载体)、目的基因表达的检测与鉴定的具体操作方法(这个问题涉及到配制选择性培养基的问题，由于教科书中缺乏这方面的知识，考生一般无法作答)。
2011年第3题考查了利用PCR技术扩增目的基因的原理和用限制酶切割质粒产生的位点问题。这部份内容教材当中虽然有相关知识点但学生回答时必须对书本知识有深入的理解的应用。试题中所提出的PCR技术扩增目的基因时出现的问题，是在PCR技术扩增目的基因实际实际操作中经常发生的问题和必须解决的问题，可以说这个考点来源于实际生产或者实验，对于有实验或实践经验的学生和老师解答起来没有问题，但是有多少学生做了PCR技术扩增目的基因这实验呢，出题者的意图是希望教材中应该做的实验应该让学生动手操作，让学生体会实验教程和解决实验过程中出现的问题。
以上列举了DNA重组工程的易考知识点和已考知识点，从易考知识点来看这类题目考查的方面很集中重复性也很强，但是从2010年的已考知识点来看这类题目的难度已经远远超出了课本的范围，对学生的实践经验要求很强(基因工程实验的学习应该是在大学课程中)，这对没有这方面经验的学生作答题目是很困难得。所以下面列举一些笔者能想到的未考查知识点。
2 对今后高考中考查基因工程内容的思考与展望
2.1 DNA连接酶的种类及作用
E.coli DNA连接酶只能将双链DN段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DN段平末端之间进行连接。而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端。
2.2 受体细胞选择原核生物(特别是大肠杆菌)的原因
原核生物遗传背景简单、繁殖快、多为单细胞；而真核生物遗传背景复杂繁殖较慢，都是多细胞生物，所以经常选择原核生物作为受体细胞，且大肠杆菌是原核生物中遗传背景最简单的模式生物，自然是受体细胞的首选。
2.3 目的基因进入大肠杆菌的方法(除去Ca2+之外)
重组质粒导入受体细胞最常用的是Ca2+处理受体细胞，使受体细胞在温和的环境下能吸收周围环境中DNA分子。除了Ca2+处理受体细胞外，还可以用电转化的方法在高压环境下使受体细胞细胞膜的通透性增强，重组DNA分子就容易进入细胞。一般情况下电转化的效率要比ca2+转化高100多倍，如果要求获得高效率的重组DNA分子就要采用电转化的方法将目的基因导入受体细胞。
2.4 检验自我复制的质粒导入受体细胞(主要是原核生物)后是否是重组的
2.4.1 如果自我复制的质粒连接的是带有标记基因(该标记基因与质粒上的标记基因不同)的目的基因
比如质粒上带有抗氨苄青霉素基因(ampr)，目的基因带有卡那霉素基因(kanr)，检验自我复制的质粒导入受体细胞后是否是重组的，只要将受体菌株在含有氨苄青霉素和卡那霉素的培养基上培养，能正常生长出来的菌株都是含有重组的质粒，没有重组的质粒在卡那霉素的培养基上是不能生长的。
2.4.2 如果自我复制的质粒连接的是没有标记基因的目的基因
第4篇
叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年baur和correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣[1]。1988年boynton等首次用野生型叶绿体dna转化了单细胞生物衣藻突变体(atpb基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生[2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。
1叶绿体基因工程概述
1.1叶绿体简介
叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状dna。叶绿体dna分子一般长120~160kb。叶绿体dna有ira和irb 2个反向重复序列(分别位于a链和b链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。
1.2叶绿体基因组转化优点
叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数[3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。
1.3叶绿体转化的主要过程
叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物[4]。
1.4叶绿体转化的主要方法
依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株[5]。二是农杆菌t-dna介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是peg处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的peg浓度下与植物原生质体共培养。
2叶绿体基因工程的应用
2.1提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于rubisco酶的丰富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量[6]。很多科学家正试图通过提高rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突破,证明叶绿体基因工程是生产高光合效率作物植物的最有价值的方法。
2.2合成有机物质
由于叶绿体型转基因植物具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点,已被越来越多的人关注,并成为工业化生产特定有机物质的可靠场所。例如,有科学家已发明了用叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因的方法。聚3-羟基丁酸酯及其他类型的聚3-羟基链烷酸酯同属于聚酯类物质,是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。具有生物可降解性,如取代化学合成塑料将能从源头解决塑料废弃物引起的“白色污染”。其通过构建了含phbb、phm、phbc和aada基因表达盒的叶绿体整合及表达载体,通过基因枪轰击法转化烟草。northem点杂交、rt-pcr分析结果表明,叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因。
2.3生产疫苗
人类治疗用蛋白质可以在叶绿体中实现表达,表达效率取决于外源基因的整合位点,增强转录和翻译的调控元件以及外
源蛋白的稳定性等。人类已经在用叶绿体基因生产疫苗方面开展了卓有成效的工作。例如,范国昌等将甲型肝炎病毒vp3p1区和丙型肝炎病毒c区融合,并导入到衣藻叶绿体基因组中,融合蛋白得到高效表达,且具有双抗原活性。而霍乱病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已经在叶绿体中转化成功,预示着转基因植物疫苗的可商业化前景。tregoning等将tetc基因在烟草叶绿体基因组进行表达,为了增加mrna的稳定性及在烟草叶片内表达的可行性,他们将基因进行了密码子优化,分别表达了未经改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表达量分别为总可溶蛋白的25%和10%。
2.4在植物抗性方面的研究
在抗虫性方面,kota和cosa分别于1999年、2001年将btcryzaaz基因转入烟草叶绿体,前者可100%杀死4 000多倍抗性的抗性虫,后者报道bt表达量达46.1%。在抗逆性方面,人们通过编码sod、apx等酶的基因已经转入到烟草、苜蓿、马铃薯、棉花的叶绿体中,提高了植物的耐氧化能力,从而提高了植物对环境胁迫的耐受能力。
2.5叶绿体基因组在系统发育学上的应用
叶绿体在系统发育学上的优点:一是叶绿体基因组是仅次于核基因组的第二大基因组,为比较研究提供了一个较大的数据基础;二是叶绿体dna的核酸置换率适中,在应用上很有价值。然而,用叶绿体dna研究系统发育也存在着明显的不足:一是叶绿体基因组是母性遗传的,因此并不能单靠叶绿体基因组来解释居群间的杂交现象;二是虽然有越来越多的叶绿体dna被用作分子标记来研究类群间的系统发育关系,但只有将这些分子片段提供的信息与其他的分子片段信息、传统的形态及生理特征结合起来获得更多的信息,才能更接近系统发育的本来面目。
2.6叶绿体基因在消除环境忧虑问题上的前景
当今最为普遍的问题就是外源基因从转基因作物到杂草的逃逸,这一逃逸主要是通过花粉的扩散,产生超级杂草或产生和其他作物之间的基因污染,对环境极为不利。叶绿体基因工程产生的基因逃逸现象的风险远远低于核转化作物,因为大多数作物中的质体dna都是母系遗传,这样就可以避免作物和作物、作物和杂草之间的杂交,消除人们对基因污染的忧虑。 3叶绿体基因工程存在的问题
3.1叶绿体基因转化在杂合体上的稳定性问题
由于高等植物的每个细胞中有10~100个叶绿体,每个叶绿体内有10~100个叶绿体基因组拷贝,因此转化的叶绿体和未转化的野生型叶绿体同时存在于转基因植株中,造成这种杂合体在遗传上是不稳定的。在转化外源基因之前,目前可采用降低叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变体作为外源基因的受体等方法使转基因植株易于同质化。
3.2植物的种类有待扩展
可能是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚,因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。目前,已成功转化的植物种类很少,只有番茄和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定遗传,而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积累的可食用果实的植物。
4展望
虽然在叶绿体基因工程领域人们已经取得了一定的进展,但对于改变叶绿体基因工程中所存在的缺点,科学界仍然要有大量的工作需要进行。为此,寻找更多更加合适的方法来改进叶绿体基因工程,使其优点更加明显,必将在未来生物技术领域带来又一场革命,为人类造福。
5参考文献
[1] 刘良式.植物分子遗传学[m].北京:科学出版社,1997.
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[3] 李宏韬,赵淑青,赵彦修,等.叶绿体基因工程简介[j].遗传,2003,25(4):495-498.
[4] svab z,hajdukiewicz p,maliga p.stable transformation of plastids in higher plants[j].proc natlacad sci usa,1990(87):8526-8530.
[5] 沈桂芳,倪丕冲.植物叶绿体基因工程[j].高科技与产业化,1999(1):26-28.
第5篇
关键词:生物技术;基因工程;细胞工程
现代生物技术的迅猛发展，成就非凡，推动着科学的进步，促进着经济的发展，改变着人类的生活与思维，影响着人类社会的发展进程。现代生物技术的成果越来越广泛地应用于医药、食品、能源、化工、轻工和环境保护等诸多领域。生物技术是21世纪高新技术革命的核心内容，具有巨大的经济效益及潜在的生产力。专家预测，到2010～2020年，生物技术产业将逐步成为世界经济体系的支柱产业之一。生物技术是以生命科学为基础，利用生物机体、生物系统创造新物种，并与工程原理相结合加工生产生物制品的综合性科学技术。现代生物技术则包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等领域。在我国的食品工业中，生物技术工业化产品占有相当大的比重;近年，酒类和新型发酵产品以及酿造产品的产值占食品工业总产值的17%。现代生物技术在食品发酵领域中有广阔市场和发展前景，本文主要阐述现代生物技术在食品发酵生产中的应用。
一、基因工程技术在食品发酵生产中的应用
基因工程技术是现代生物技术的核心内容，采用类似工程设计的方法，按照人类的特殊需要将具有遗传性的目的基因在离体条件下进行剪切、组合、拼接，再将人工重组的基因通过载体导入受体细胞，进行无性繁殖，并使目的基因在受体细胞中高速表达，产生出人类所需要的产品或组建成新的生物类型。
发酵工业的关键是优良菌株的获取，除选用常用的诱变、杂交和原生质体融合等传统方法外，还可与基因工程结合，进行改造生产菌种。
(一)改良面包酵母菌的性能
面包酵母是最早采用基因工程改造的食品微生物。将优良酶基因转入面包酵母菌中后，其含有的麦芽糖透性酶及麦芽糖的含量比普通面包酵母显著提高，面包加工中产生二氧化碳气体量提高，应用改良后的酵母菌种可生产出膨润松软的面包。
(二)改良酿酒酵母菌的性能
利用基因工程技术培育出新的酿酒酵母菌株，用以改进传统的酿酒工艺，并使之多样化。采用基因工程技术将大麦中的淀粉酶基因转入啤酒酵母中后，即可直接利用淀粉发酵，使生产流程缩短，工序简化，革新啤酒生产工艺。目前，已成功地选育出分解β-葡聚糖和分解糊精的啤酒酵母菌株、嗜杀啤酒酵母菌株，提高生香物质含量的啤酒酵母菌株。
(三) 改良乳酸菌发酵剂的性能
乳酸菌是一类能代谢产生乳酸，降低发酵产品pH值的一类微生物。乳酸菌基因表达系统分为组成型表达和受控表达两种类型，其中受控表达系统包括糖诱导系统、Nisin诱导系统、pH 诱导系统和噬菌体衍生系统。相对于乳酸乳球菌和嗜热链球菌而言，德氏乳杆菌的基因研究比较缺乏，但是已经发现质粒pN42和PJBL2用于构建德氏乳杆菌的克隆载体。有研究发现乳酸菌基因突变有2种方法:第一种方法涉及(同源或异源的)可独立复制的转座子，第二种方法是依赖于克隆的基因组DNA 片断和染色体上的同源部位的重组整合而获得。通过基因工程得到的乳酸菌发酵剂具有优良的发酵性能，产双乙酰能力、蛋白水解能力、胞外多糖的稳定形成能力、抗杂菌和病原菌的能力较强。
二、细胞工程技术在食品发酵生产中的应用
细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80 年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞工程主要有细胞培养、细胞融合及细胞代谢物的生产等。细胞融合是在外力(诱导剂或促融剂)作用下，使两个或两个以上的异源(种、属间) 细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术是一种改良微生物发酵菌种的有效方法，主要用于改良微生物菌种特性、提高目的产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新产物等。与基因工程技术结合，使对遗传物质进一步修饰提供了多样的可能性。例如日本味之素公司应用细胞融合技术使产生氨基酸的短杆菌杂交，获得比原产量高3倍的赖氨酸产生菌和苏氨酸高产新菌株。酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交，分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。日本国税厅酿造试验所用该技术获得了优良的高性能谢利酵母来酿制西班牙谢利白葡萄酒获得了成功。目前，微生物细胞融合的对象已扩展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间，不断培育出用于各种领域的新菌种。
三、酶工程技术在食品发酵生产中的应用
酶是活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊生物催化剂。酶工程是现代生物技术的一个重要组成部分，酶工程又称酶反应技术，是在一定的生物反应器内，利用生物酶作为催化剂，使某些物质定向转化的工艺技术，包括酶的研制与生产，酶和细胞或细胞器的固定化技术，酶分子的修饰改造，以及生物传感器等。酶工程技术在发酵生产中主要用于两个方面，一是用酶技术处理发酵原料，有利于发酵过程的进行。如啤酒酿制过程，主要原料麦芽的质量欠佳或大麦、大米等辅助原料使用量较大时，会造成淀粉酶、俘一葡聚糖酶、纤维素酶的活力不足，使糖化不充分、蛋白质降解不足，从而减慢发酵速度，影响啤酒的风味和收率。使用微生物淀粉酶、蛋白酶、一葡聚糖酶等制剂，可补充麦芽中酶活力不足的缺陷，提高麦汁的可发酵度和麦汁糖化的组分，缩短糖化时间，减少麦皮中色素、单宁等不良杂质在糖化过程中浸出，从而降低麦汁色泽。二是用酶来处理发酵菌种的代谢产物，缩短发酵过程，促进发酵风味的形成。啤酒中的双乙酰是影响啤酒风味的主要因素，是判断啤酒成熟的主要指标。当啤酒中双乙酰的浓度超过阈值时，就会产生一种不愉快的馊酸味。双乙酰是由酵母繁殖时生成的α-乙酰乳酸和α-乙酰羟基丁酸氧化脱羧而成的，一般在啤酒发酵后期还原双乙酰需要约5～10d 的时间。崔进梅等报道，发酵罐中加入α-乙酰乳酸脱羧酶能催化α-乙酰乳酸直接形成羧基丁酮，可缩短发酵周期，减少双乙酰含量。
四、小结
在食品发酵生产中应用生物技术可以提高发酵剂的性能，缩短发酵周期，丰富发酵制品的种类。不仅提高了产品档次和附加值，生产出符合不同消费者需要的保健制品，而且在有利于加速食品加工业的发展。随着生化技术的日益发展，相信会开发出更多物美价廉的发酵制品，使生物加工技术在食品发酵工业中的应用更加广泛。
参考文献
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[3]徐成勇，郭本恒等.酸奶发酵剂和乳酸菌生物技术育种[J].中国生物工程杂志.2004，(7):27.
第6篇
关键词:生物技术;基因工程;细胞工程
现代生物技术的迅猛发展,成就非凡,推动着科学的进步,促进着经济的发展,改变着人类的生活与思维,影响着人类社会的发展进程。现代生物技术的成果越来越广泛地应用于医药、食品、能源、化工、轻工和环境保护等诸多领域。生物技术是21世纪高新技术革命的核心内容,具有巨大的经济效益及潜在的生产力。专家预测,到2010～2020年,生物技术产业将逐步成为世界经济体系的支柱产业之一。生物技术是以生命科学为基础,利用生物机体、生物系统创造新物种,并与工程原理相结合加工生产生物制品的综合性科学技术。现代生物技术则包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等领域。在我国的食品工业中,生物技术工业化产品占有相当大的比重;近年,酒类和新型发酵产品以及酿造产品的产值占食品工业总产值的17%。现代生物技术在食品发酵领域中有广阔市场和发展前景,本文主要阐述现代生物技术在食品发酵生产中的应用。
一、基因工程技术在食品发酵生产中的应用
基因工程技术是现代生物技术的核心内容,采用类似工程设计的方法,按照人类的特殊需要将具有遗传性的目的基因在离体条件下进行剪切、组合、拼接,再将人工重组的基因通过载体导入受体细胞,进行无性繁殖,并使目的基因在受体细胞中高速表达,产生出人类所需要的产品或组建成新的生物类型。
发酵工业的关键是优良菌株的获取,除选用常用的诱变、杂交和原生质体融合等传统方法外,还可与基因工程结合,进行改造生产菌种。
(一)改良面包酵母菌的性能
面包酵母是最早采用基因工程改造的食品微生物。将优良酶基因转入面包酵母菌中后,其含有的麦芽糖透性酶及麦芽糖的含量比普通面包酵母显著提高,面包加工中产生二氧化碳气体量提高,应用改良后的酵母菌种可生产出膨润松软的面包。
(二)改良酿酒酵母菌的性能
利用基因工程技术培育出新的酿酒酵母菌株,用以改进传统的酿酒工艺,并使之多样化。采用基因工程技术将大麦中的淀粉酶基因转入啤酒酵母中后,即可直接利用淀粉发酵,使生产流程缩短,工序简化,革新啤酒生产工艺。目前,已成功地选育出分解β-葡聚糖和分解糊精的啤酒酵母菌株、嗜杀啤酒酵母菌株,提高生香物质含量的啤酒酵母菌株。
(三) 改良乳酸菌发酵剂的性能
乳酸菌是一类能代谢产生乳酸,降低发酵产品pH值的一类微生物。乳酸菌基因表达系统分为组成型表达和受控表达两种类型,其中受控表达系统包括糖诱导系统、Nisin诱导系统、pH 诱导系统和噬菌体衍生系统。相对于乳酸乳球菌和嗜热链球菌而言,德氏乳杆菌的基因研究比较缺乏,但是已经发现质粒pN42和PJBL2用于构建德氏乳杆菌的克隆载体。有研究发现乳酸菌基因突变有2种方法:第一种方法涉及(同源或异源的)可独立复制的转座子,第二种方法是依赖于克隆的基因组DNA 片断和染色体上的同源部位的重组整合而获得。通过基因工程得到的乳酸菌发酵剂具有优良的发酵性能,产双乙酰能力、蛋白水解能力、胞外多糖的稳定形成能力、抗杂菌和病原菌的能力较强。
二、细胞工程技术在食品发酵生产中的应用
细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80 年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞工程主要有细胞培养、细胞融合及细胞代谢物的生产等。细胞融合是在外力(诱导剂或促融剂)作用下,使两个或两个以上的异源(种、属间) 细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术是一种改良微生物发酵菌种的有效方法,主要用于改良微生物菌种特性、提高目的产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新产物等。与基因工程技术结合,使对遗传物质进一步修饰提供了多样的可能性。例如日本味之素公司应用细胞融合技术使产生氨基酸的短杆菌杂交,获得比原产量高3倍的赖氨酸产生菌和苏氨酸高产新菌株。酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交,分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。日本国税厅酿造试验所用该技术获得了优良的高性能谢利酵母来酿制西班牙谢利白葡萄酒获得了成功。目前,微生物细胞融合的对象已扩展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,不断培育出用于各种领域的新菌种。
三、酶工程技术在食品发酵生产中的应用
酶是活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊生物催化剂。酶工程是现代生物技术的一个重要组成部分,酶工程又称酶反应技术,是在一定的生物反应器内,利用生物酶作为催化剂,使某些物质定向转化的工艺技术,包括酶的研制与生产,酶和细胞或细胞器的固定化技术,酶分子的修饰改造,以及生物传感器等。酶工程技术在发酵生产中主要用于两个方面,一是用酶技术处理发酵原料,有利于发酵过程的进行。如啤酒酿制过程,主要原料麦芽的质量欠佳或大麦、大米等辅助原料使用量较大时,会造成淀粉酶、俘一葡聚糖酶、纤维素酶的活力不足,使糖化不充分、蛋白质降解不足,从而减慢发酵速度,影响啤酒的风味和收率。使用微生物淀粉酶、蛋白酶、一葡聚糖酶等制剂,可补充麦芽中酶活力不足的缺陷,提高麦汁的可发酵度和麦汁糖化的组分,缩短糖化时间,减少麦皮中色素、单宁等不良杂质在糖化过程中浸出,从而降低麦汁色泽。二是用酶来处理发酵菌种的代谢产物,缩短发酵过程,促进发酵风味的形成。啤酒中的双乙酰是影响啤酒风味的主要因素,是判断啤酒成熟的主要指标。当啤酒中双乙酰的浓度超过阈值时,就会产生一种不愉快的馊酸味。双乙酰是由酵母繁殖时生成的α-乙酰乳酸和α-乙酰羟基丁酸氧化脱羧而成的,一般在啤酒发酵后期还原双乙酰需要约5～10d 的时间。崔进梅等报道,发酵罐中加入α-乙酰乳酸脱羧酶能催化α-乙酰乳酸直接形成羧基丁酮,可缩短发酵周期,减少双乙酰含量。
四、小结
在食品发酵生产中应用生物技术可以提高发酵剂的性能,缩短发酵周期,丰富发酵制品的种类。不仅提高了产品档次和附加值,生产出符合不同消费者需要的保健制品,而且在有利于加速食品加工业的发展。随着生化技术的日益发展,相信会开发出更多物美价廉的发酵制品,使生物加工技术在食品发酵工业中的应用更加广泛。
参考文献
[1]赵志华,岳田利等.现代生物技术在乳品工业中的应用研究[J].生物技术通报.2006,04:78-80.
[2]王春荣,王兴国等.现代生物技术与食品工业[J].山东食品科技.2004,07:31.
第7篇
关键词：植物疫苗；基因工程；表达系统；安全性
1 植物疫苗的免疫原理
植物疫苗可诱导粘膜免疫反应，小肠淋巴组织的粘膜上有一种特殊的细胞叫做膜细胞（M 细胞）。粘膜免疫应答就是由M 细胞识别抗原开始的。M细胞识别抗原并将其传递给巨噬细胞，巨噬细胞和其它抗原呈递细胞，再将抗原展示给辅T细胞，辅T细胞识别外源蛋白质片段后就会刺激B细胞制造和释放能中和抗原的抗体，当疾病因子出现时，记忆辅T细胞刺激胞毒T 细胞攻击受感染的细胞，同时它迅速刺激记忆B 细胞分泌中和抗体消灭入侵的病原体。总的来说，转基因植物疫苗可以诱导相应的血清型的IgA 和IgG 反应。
2 植物疫苗的特点
2.1 安全性高
植物是人类食物来源之一，除个别人群对某些特定的植物过敏外，其安全性高。用动物细胞生产疫苗，可能有动物病毒的污染，对人类存在潜在危害。而植物病毒不会感染人类，比较安全，同时也可避免微生物生产疫苗带来的有害产物。
2.2 成本低
植物种植系统简单易行，植物细胞培养条件简单，便于进行遗传操作，可通过大面积栽培获得廉价的疫苗，且不需要技术、设备和种植条件等巨大投资。农作物可以当地生产，还易于储藏和运输，而且经过长期种植，植物栽培、收获、贮藏、加工程序已经形成工业化。与植物生物反应器相比，原核生物反应器与动物生物反应器生产时需要昂贵的技术设备、大量的人力物力。
2.3 植物具有完整的真核表达系统
具有与动物相同的真核加工修饰系统。可以对重组蛋白进行糖基化、磷酸化、酰胺化、亚基正确装配等。微生物系统不能对真核生物蛋白进行正确的翻译后加工。
2.4 转基因植物中的外源基因可重组
通过植物杂交的方法进行基因重组，进而在植物体内积累多种病原体的抗原基因，生产出方便高效的多联疫苗。
3 植物基因工程疫苗外源基因的表达系统
3.1 瞬时表达系统
主要采用植物病毒作为载体，而外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒感染植株，从而将外源基因导入植物细胞内，采用这种转化方式，外源基因并不整合至植物基因组中，只是利用寄主细胞在细胞质中进行复制，以高拷贝的形式游离于植物中，并进行高效的表达，因此可在短时间内在植物细胞内积累大量的外源蛋白。采用农杆菌介导的转化，外源基因蛋白的产量一般要低于细胞内可溶性蛋白总量的1%；而采用这种瞬时表达系统,外源基因蛋白总量会远大于1%。
3.2 稳定整合系统
3.2.1 土壤农杆菌介导的遗传转化。目前根癌农杆菌主要用于双子叶植物的遗传转化，其转化植物的机制已从分子水平上基本得到解释。而发根农杆菌，由于对Ri 质粒了解得还不充分，所以对这种转化系统的研究主要集中在以生产次生代谢产物为目的的根组织培养和根的发育。采用农杆菌介导的植物转化最常采用共培养法，即使用农杆菌菌液与叶盘、愈伤组织、悬浮培养细胞、茎段、下胚轴段、子叶切片等部分进行共培养，从而达到转化的目的。
3.2.2 外源DNA 直接导入法。主要包括基因枪法、电激发、PEG诱导法、激光穿孔法、脂质体法、超声波法，其中最常用的是基因枪法。它是将带有外源基因的质粒用亚精胺包裹为直径1μm 左右的金弹或钨弹，再用高压氦气、火药爆炸力、高压放电气体作为动力加速子弹，使它们穿过植物细胞壁和细胞膜，将外源基因带入具有再生能力的植物组织，这样可以在很大程度上缩短再生的时间，从而避免体细胞变异的发生。
4 以植物为载体的免疫技术
4.1 植物疫苗免疫原性和免疫保护作用
由于植物疫苗一般是通过食用来被人体利用。所以如何避免消化酶的影响来保护抗原就是一个重要的研究课题。目前，避免消化酶的影响来保护抗原可分为2类方法：①用沙门氏菌和弧状霍乱杆菌作为载体；②用保护性的包被对抗原进行包装。
用减毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面，有利于粘膜免疫系统摄取所表达的抗原。但是基于减毒菌株的方法具有潜在安全缺陷，而后者可通过生物降解的多聚物、脂质体、蛋白质体或者表达抗原的转基因植物来实现。许多研究表明，植物材料可潜在地保护所选定的抗原。特别在种子中，植物可为亚单位疫苗提供一个富含蛋白酶抑制物的糖类聚合物基质环境。其它的抗原包装方法需要烦琐的处理步骤；而通过植物种子来进行生物包装不需要任何额外的代价，就可以为这些抗原提供保护。在有关转基因马铃薯的研究中，从轮状病毒和产肠毒素大肠杆菌中所选的抗原分别与霍乱毒素的B和A2亚单位融合，抗原的免疫反应显示出对Th1的偏爱性，并可诱导白细胞介素2和干扰素γ，CD4 + 水平也相应增加。Th1的偏爱性很可能是抗原或者载体的选择结果。在佐剂的帮助下，亚单位疫苗的释放能增加免疫反应量。霍乱毒素和大肠杆菌的热不稳定毒素，它们与抗原共表达，有利于诱导保护性的免疫产生，改变口服免疫低效率递呈。另外，有人证实了转基因植物疫苗的粘膜传输中所诱发的免疫应答所具有的黏膜佐剂的特征，这给口服免疫可不需佐剂提供了依据，同时也提高了其安全性。
在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候选的亚单位疫苗也具有较好的保护作用。马铃薯块茎或谷物种子中表达的热不稳定毒素的B 亚基和马铃薯中表达的霍乱毒素B 亚基用于小鼠口服免疫，可以保护老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物种子表达的传播性肠炎病毒的S2糖蛋白，对乳猪能够起到很好的保护作用。目前，通过植物递送系统来生产B 型肝炎的疫苗也逐渐成熟。
4.2 提高抗原在植物中的表达水平
利用植物进行疫苗开发，首要的问题是，植物能否表达相关的蛋白？目前为止，许多亚单位候选抗原在转基因植物中成功表达，这些抗原主要包括感染人类、家畜、野生动物的细菌和病毒抗原。表达水平很大程度上取决于表达的蛋白和用于表达的植物种类，同时，构建的表达系统也影响抗原的表达水平，比如用于表达的细胞器基因组(核和质粒)、启动子的强度和组织专一性、非翻译前导序列和信号序列的选择和表达蛋白的靶细胞器的定位等均对表达产生影响。一般而言，利用上述策略可以实现抗原高水平表达。然而，很难对表达系统进行比较，因为特定抗原对植物表达系统的选择很重要，在不同的系统中其表达效果是不一样的。近来，研究人员利用内质网滞留信号可提高外源基因的表达量，Mason等利用一个核表达系统，把蛋白定位于内质网滞留信号之后，热不稳定毒素B亚单位在马玲薯块茎中表达量可达总可溶性蛋白质的0.2% ；在谷物种子中的表达量约占总可溶蛋白的4%或12% ，这些都依赖于所用的调节序列。另外，霍乱毒素（B）亚单位在利用内质网滞留信号时在烟草叶片中的表达量约占总可溶蛋白的4%。膜蛋白比可溶性蛋白更难于在转基因植物中表达，大量研究表明，膜蛋白在植物中的表达量远不及可溶性蛋白，这就需要优化表达系统以提高表达水平。
目前，转基因马玲薯表达B型肝炎的表面抗原水平已由马玲薯大约1mg/g增加到马玲薯大约16mg/g抗原，这样可以大大减少口服剂量。目前许多研究表明，所欲表达的抗原在植物中能够表达并装配成四级结构。糖基化修饰的蛋白也可在植物中进行糖基化，尽管糖基化模式很可能存在着差别。在植物系统中表达的热不稳定蛋白毒素的B亚单位和霍乱毒素的B亚单位，均有GM1受体结合活性，B型肝炎表面抗原和诺沃克病毒衣壳蛋白可形成类病毒颗粒，类病毒颗粒的形成，可认为有利于诱导免疫反应。
5 植物基因工程疫苗研究进展
5.1 反转录病毒载体
反转录病毒作为载体是在进行动物基因工程中发现的，许多研究人员认为它同样适于植物基因工程，但目前研究的不多。
5.2 单链RNA植物病毒
单链RNA 植物病毒，即病毒RNA可直接作为mRNA的植物病毒，主要包括苜蓿花叶病毒(ALMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、烟草花叶病毒(TMV)等。它们作为外源基因载体主要通过以下步骤感染植物：病毒RNA 首先反转录为一条单链cDNA，在DNA聚合酶作用下形成双链DNA，将其克隆入细菌质粒中，将外源基因插入质粒的cDNA中，最后通过体外转录，用带有外源基因的RNA病毒感染植物，将其转入植物细胞。
5.3单链DNA植物病毒载体
在单链DNA 植物病毒载体中，研究最多的是Geminiviruses(简称GeNV) ，又叫做双粒病毒或双联体病毒。它一般含有2个成对并存的病毒颗粒，大小约为18～20nm，遗传物质是单链DNA ,每2个颗粒中包含1～2个、2. 5～3.0 kb的环状DNA分子。该病毒寄主广泛，单子叶植物和双子叶植物均可被感染，但感染部位仅限于植物的维管组织，且其传播媒介主要是昆虫，不能通过机械接种。
5.4 双链DNA植物病毒载体
双链DNA植物病毒载体中最典型的是花椰菜花叶病毒，它的基因组长约8kb，主要感染花椰菜、油菜、拟南芥等，主要寄主是芸苔属植物，目前尚未发现可感染豆科和单子叶植物。
6 植物疫苗的安全性
6.1 对环境的影响
由于在植物疫苗中包含了病原体的DN段，因而花粉和种子的散播造成的基因逃逸可能给人类带来新的病原、毒素、过敏原等，因此对可能引起的基因渐渗现象必须做出充分的安全性评价,并规范植物疫苗的利用和管理，同时寻求技术方法。如可恢复阻塞(RBF)技术，它能使自然界中因渐渗而携带RBF 的杂种或近缘系植物死亡或不育或利用叶绿体转化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系，这样就可避免花粉传播而带来的潜在威胁，转基因植物疫苗有着传统疫苗无法比拟的优越性，已经成为一个研究热点了。未来的研究应着眼于生产出作为医药商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。转基因植物疫苗应用最大的限制就是表达量低。现在的研究表明：可以通过叶绿体转化、植物育种和利用食品加工技术来提高表达水平，而且研究还指出，运用携带蛋白和辅助蛋白可以增加抗原被免疫系统识别的能力。这些研究都使我们越来越接近生产出廉价“安全口服的商品植物疫苗”，这样的疫苗将可以帮助人们预防疾病的传播。
6.2对人类和动物的影响
抗生素抗性基因是筛选转基因植物常用的标记基因。长期食用这类转基因疫苗是否会对人体或动物造成抗生素医疗无效。转基因植物中的新基因会不会传递给人畜肠道的正常微生物，引起菌群和数量的变化或插入并表达，从而危害人畜健康？这些问题目前都无法解答，仍需大量学者继续研究论证。
7 展望
利用植物来表达和递送疫苗技术的发展给免疫研究注入了新的内容。以往的研究中,在植物中表达了包括过滤性病毒、细菌、肠道和非肠道的病原体等各种不同的抗原，并做了相应免疫学研究。但植物疫苗面临的最大问题是抗原蛋白在植物细胞表达量不高，低剂量抗原蛋白往往不能激发足够的免疫反应，这不能仅靠增加植物组织摄取量得以解决，因为低剂量的重复免疫可能会导致机体的免疫耐受，导致机体对此抗原免疫反应保持“低调”，即使以后增加抗原蛋白的剂量也不能改变。另外，机体每天对植物组织的摄取量是一定的，不可能无限增加。因此，未来研究的重点之一是提高植物疫苗中抗原蛋白的表达量。随着生物技术的发展和植物基因工程研究的深入，基于植物的疫苗递送系统将更具吸引力，并呈现出广阔的应用前景。
参考文献
1 余祖华，王红宁.用植物生物反应器研制基因工程疫苗的进展[J].生
物技术，2004（8）
第8篇
1叶绿体基因工程概述
1.1叶绿体简介
叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状DNA。叶绿体DNA分子一般长120~160kb。叶绿体DNA有IRA和IRB2个反向重复序列(分别位于A链和B链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。
1.2叶绿体基因组转化优点
叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。
1.3叶绿体转化的主要过程
叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物。
1.4叶绿体转化的主要方法
依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株。二是农杆菌T-DNA介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的Ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是PEG处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的PEG浓度下与植物原生质体共培养。
2叶绿体基因工程的应用
2.1提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于Rubisco酶的丰富度。Rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制CO2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量。很多科学家正试图通过提高Rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突破,证明叶绿体基因工程是生产高光合效率作物植物的最有价值的方法。
2.2合成有机物质
由于叶绿体型转基因植物具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点,已被越来越多的人关注,并成为工业化生产特定有机物质的可靠场所。例如,有科学家已发明了用叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因的方法。聚3-羟基丁酸酯及其他类型的聚3-羟基链烷酸酯同属于聚酯类物质,是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。具有生物可降解性,如取代化学合成塑料将能从源头解决塑料废弃物引起的“白色污染”。其通过构建了含phbB、phM、phbC和aadA基因表达盒的叶绿体整合及表达载体,通过基因枪轰击法转化烟草。Northem点杂交、RT-PCR分析结果表明,叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因。
2.3生产疫苗
人类治疗用蛋白质可以在叶绿体中实现表达,表达效率取决于外源基因的整合位点,增强转录和翻译的调控元件以及外源蛋白的稳定性等。人类已经在用叶绿体基因生产疫苗方面开展了卓有成效的工作。例如,范国昌等将甲型肝炎病毒VP3P1区和丙型肝炎病毒C区融合,并导入到衣藻叶绿体基因组中,融合蛋白得到高效表达,且具有双抗原活性。而霍乱病毒蛋白B(CTB)抗原CTB已经在叶绿体中转化成功,预示着转基因植物疫苗的可商业化前景。Tregoning等将TetC基因在烟草叶绿体基因组进行表达,为了增加mRNA的稳定性及在烟草叶片内表达的可行性,他们将基因进行了密码子优化,分别表达了未经改造的富含AT(72.3%AT)和人工合成的富含GC(52.5%AT)的基因,TetC-AT和TetC-GC的表达量分别为总可溶蛋白的25%和10%。
2.4在植物抗性方面的研究
在抗虫性方面,Kota和Cosa分别于1999年、2001年将BTCryZAaZ基因转入烟草叶绿体,前者可100%杀死4000多倍抗性的抗性虫,后者报道BT表达量达46.1%。在抗逆性方面,人们通过编码SOD、APx等酶的基因已经转入到烟草、苜蓿、马铃薯、棉花的叶绿体中,提高了植物的耐氧化能力,从而提高了植物对环境胁迫的耐受能力。
2.5叶绿体基因组在系统发育学上的应用
叶绿体在系统发育学上的优点:一是叶绿体基因组是仅次于核基因组的第二大基因组,为比较研究提供了一个较大的数据基础;二是叶绿体DNA的核酸置换率适中,在应用上很有价值。然而,用叶绿体DNA研究系统发育也存在着明显的不足:一是叶绿体基因组是母性遗传的,因此并不能单靠叶绿体基因组来解释居群间的杂交现象;二是虽然有越来越多的叶绿体DNA被用作分子标记来研究类群间的系统发育关系,但只有将这些分子片段提供的信息与其他的分子片段信息、传统的形态及生理特征结合起来获得更多的信息,才能更接近系统发育的本来面目。
2.6叶绿体基因在消除环境忧虑问题上的前景
当今最为普遍的问题就是外源基因从转基因作物到杂草的逃逸,这一逃逸主要是通过花粉的扩散,产生超级杂草或产生和其他作物之间的基因污染,对环境极为不利。叶绿体基因工程产生的基因逃逸现象的风险远远低于核转化作物,因为大多数作物中的质体DNA都是母系遗传,这样就可以避免作物和作物、作物和杂草之间的杂交,消除人们对基因污染的忧虑。
3叶绿体基因工程存在的问题
3.1叶绿体基因转化在杂合体上的稳定性问题
由于高等植物的每个细胞中有10~100个叶绿体,每个叶绿体内有10~100个叶绿体基因组拷贝,因此转化的叶绿体和未转化的野生型叶绿体同时存在于转基因植株中,造成这种杂合体在遗传上是不稳定的。在转化外源基因之前,目前可采用降低叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变体作为外源基因的受体等方法使转基因植株易于同质化。
3.2植物的种类有待扩展
可能是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚,因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。目前,已成功转化的植物种类很少,只有番茄和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定遗传,而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积累的可食用果实的植物。
第9篇
什么是转基因
基因是染色体上的DN段。DNA又称脱氧核糖核酸，形状像两股螺旋的楼梯，它是生物体遗传信息的载体，决定着生物体的性状，并把遗传信息传递给下一代。
基因转移在自然界中广泛存在，植物界的异花授粉是物种内基因转移的典型现象。这种种内基因交流现象便是杂交育种的生物学基础，人们通过干预植物的授粉活动，将需要的性状的基因组合到一起，并通过一代代的人工选择，使杂交得到的性状组合得以稳定遗传，形成新的品种。
除了种内的基因转移外，自然界还存在一种特殊的物种间的基因转移。这种基因转移多由病毒或者细菌感染产生。病毒可以插入宿主细胞的DNA链中，并正常表达，一些细菌的质粒也具有类似病毒的功能。农杆菌侵染植物伤口的过程就是物种间基因转移的典型案例。
转基因技术便模仿这种自然界的物种间基因转移，利用基因工程的手段，人为的把外源基因（可以是同种不同植株中的基因，也可以是种外基因）整合到目标生物体中，使后者获得新的性状，并能把这些性状遗传下去。例如，转基因抗虫棉，是把微生物体内的抗虫基因转移到普通棉花中，使棉花可以产生一种针对棉铃虫的蛋白质，避免植株叶片被虫子啃噬，从而达到抗虫的效果。
与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势：拓宽可利用的基因资源，为培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径，可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择，可以大大提高选择效率，加快育种进程，此外，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。
如何实现转基因
一个转基因作物的诞生一般要经过以下流程：
首先要选择需要的性状，并找到相关性状的基因编码。然后将需要的基因分离出来，建构到合适的载体上。然后通过中间介质或物理方式导入目标体，进行转化，形成转化体。再通过用作标记的抗性性状筛选，选出成功表达外源基因的植株。
载体介导转移系统是最常见的转基因方法：将外源基因重组到合适的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。农杆菌Ti质粒或Ri质粒介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清晰、最理想的载体转移方法。农杆菌细胞Ti质粒上有段T-DNA，农杆菌侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入植物基因中。人们将目的基因放入经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合。除了使用中介外，外源基因还可以通过物理方法直接进入植物细胞。基因枪是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒）射进植物细胞，获得转基因植株。
利用植物开花、授精过程中形成的花粉管通道，在授粉后向子房注射目的基因的DNA溶液，也可将外源DNA导入受精卵细胞。
在将外源基因导入目标植物细胞后，还需要确定细胞是否能正确表达外源基因并将其稳定遗传。只有少部分细胞能将外源基因整合到核基因组，而整合后能够成功表达的细胞更是少数。因此在转基因操作中，常使用特异性选择标记基因进行标记，以便有效地选择出真正的转化体。抗生素抗性基因与除草剂抗性基因常用作选择标记基因，与目标基因在同一载体上标记转化体。标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来，非转化细胞则被抑制，杀死。
有了合适的转化体，就可以进入安全性评估和育种试验。通过转基因的方法往往难以直接获得理想的品种，转基因个体面临着外源基因失活、纯合致死、花粉致死、其他性状变化等问题。因此人们往往结合杂交等常规育种手段进一步筛选，最终选出综合性状优良的转基因品种。
转入的外源基因有何功能
2000年，已获得转基因植株的物种达上百种，其中包括重要的粮食作物如水稻、小麦、玉米、大豆和马铃薯等；经济作物如棉花、油菜、向日葵和亚麻等；另外还有重要的蔬菜、牧草、花卉和部分木本植物（2000年数据）。在建立转化体系的基础上，人们已将许多具有重要价值的目的基因转入植物。以下是转基因植物育种的几个主要方面。
抗病毒基因工程：抗病毒是植物基因工程早期比较成功的研究领域之一。20世纪90年代末起，转基因抗病毒产品西葫芦和番木瓜等多种作物被培育出来，并获得商品化生产许可，其中抗病毒型番木瓜在美国广泛种植。
抗虫性基因工程：1996年，转Bt基因（一种源自苏云杆菌，被广泛使用的生物杀虫剂）的棉花、玉米和马铃薯已在美国获得批准进行商品化生产，抗虫玉米和抗虫棉是推广面积仅次于抗除草剂大豆的两种转基因作物。
抗除草剂基因工程：抗除草剂转基因植物的研究在北美很受重视。在新大陆的几个农业大国中，抗除草剂作物被大面积种植。抗除草剂作物的出现是为了适应大规模机械化农业生产，使生产者能以简单、高效的方式进行除草作业，并减少除草剂的使用种类和使用量。抗除草剂植物中转入了抗特定除草剂的基因，理想状态，生产者在除草作业时只需要用相应的除草剂即可完成除草作业，不需要多种除草剂混合使用，或人工除草，节省了大量的人力。代表性作物为抗除草剂大豆、玉米和油菜。
第10篇
1、基因工程中重组DNA分子的筛选
基因工程的第一步是提取目的基因，第二步是将目的基因与运载体结合，即把用同一种限制性核酸内切酶处理的目的基因与运载体混合，再加入DNA连接酶，使DN段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些DNA有相同的黏性末端，所以在DNA连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状的DNA。这些环状的DNA有的是由一个DN段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个DN段形成的，共有三种，即目的基因―载体连接物、载体―载体连接物 、目的基因―目的基因连接物。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离纯化。常用的方法有抗药性标记选择法（插入失活法），即将目的基因插入带ampR和tctR基因载体的tctR基因（或ampR基因）中，则tctR基因（或ampR基因）失活，再在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养，进行筛选。
[例1]：(2008海南高考题) 右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。
（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DN段之间连接形成的产物有__________、__________、__________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行__________。
（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是____________________。
（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是______________________________。
（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时 。
[解析]：考查基因工程重组DNA的构建与筛选，以及基因结构与表达调控。
(1)考虑载体的自连接、目的基因的自连接及载体和目的基因的相互连接。
(2)载体―载体连接物含有ampR(青霉素抗性基因)和tctR(四环素抗性基因)，其宿主细胞接种到含四环素、青霉素的培养基中均能生长。由于目的基因插入tctR四环素抗性基因位置，使得该四环素抗性基因完整性破坏而不能表达，但因含有tctR(四环素抗性基因)，所以将相应宿主细胞接种到含四环素的培养基中不能生长，接种到含青霉素的培养基中能生长。
(3)目的基因表达时,RNA聚合酶识别和结合位点是启动子，作为转录起始信号，其合成产物是mRNA。
(4)质粒包括EcoRI、BamHI酶切位点，目的基因的两端分别有EcoRI、BamHI酶切位点,若用该两种酶同时处理质粒、目的基因会得到相同黏性末端，其目的基因――载体连接物就只能有一种。当然还有若干载体――载体连接物、目的基因-目的基因连接物。
[答案]：
（1）目的基因―载体连接物 载体―载体连接物 目的基因―目的基因连接物 分离纯化 （2）载体-―载体连接物；目的基因-―载体连接物、载体―载体连接物 （3）启动子 mRNA （4）EcoRI和BamHI
[例2]：科学家利用基因工程成功地将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内生产出人的胰岛素。在该过程中采用质粒作为运载体，已知质粒上含有抗氨苄青霉素（简称氨苄）和抗四环素的基因（位于不同区段），目的基因与质粒的结合位点刚好位于抗氨苄青霉素基因结构内，且受体大肠杆菌体内不含质粒，也不含质粒上的抗药基因。导入完成后，在得到的大肠杆菌中，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒，只有少数导入的是重组质粒。某科研机构想从培养基上筛选出含重组质粒的大肠杆菌（即“目的菌种”），他们设计了如下实验方案：
第一步：将得到的大肠杆菌接种在含的培养基上，筛选出含有质粒的大肠杆菌。
第二步：为选出“目的菌种”，将第一步筛选出的大肠杆菌中选用“印影法”分离。
①采用涂布平板法，将第一步筛选的大肠杆菌以合适的稀释度涂布_______________________上，经培养后形成单菌落，如图1B所示。
②通过一消毒的“印章”（如图1A所示），将培养基上的菌落分别按原位印迹到图1所示的非选择培养基__________和选择培养基__________上（顺序不能颠倒，C培养基成分与B相同，D上含有氨苄青霉素，含重组质粒的大肠杆菌不能生长）。
③培养后对照观察C、D培养基上的单菌落。
④在C培养基上挑取D培养基上不生菌落的位置上的单菌落，从而获得含重组质粒的大肠杆菌，即“目的菌种”。
⑤实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的的目的是____________________
[答案]：四环素 到含普通质粒的大肠杆菌和含重组质粒的大肠杆菌都能生长的培养基 C D防止污染环境
2、细胞工程中杂种细胞的筛选
2.1植物体细胞杂交中融合体的类型和杂种细胞的筛选
植物体细胞杂交中融合体的类型有以下三种：①未融合细胞：再生植株与亲本相同；②自体融合：融合结果得到“同核体”； ③异体融合：融合结果得到“异核体”。例如，在一定的技术手段（物理法、化学法）协助下进行植物A、B细胞的人工诱导融合，先进行膜的融合，再进行核的融合，最后形成杂种细胞，杂种细胞有三种：AA型、BB型、AB型，只有AB型才是我们所需要的杂种细胞，所以需要进行筛选，再通过植物组织培养技术，培育成杂种植株。杂种细胞的筛选方法有以下几种：①利用双亲细胞形态和色泽上的差异识别杂种细胞，这是最简单的选择方法。②遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常的等位基因，纠正另一亲本的缺陷，从而使杂种细胞表现出正常功能的原理选择杂种细胞；③抗性互补筛选法：利用亲本原生质体对抗生素、除草剂及其他毒性物质抗性差异来选择杂种细胞；④生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。例如，常用IOA（核失活―碘乙酰胺）处理与培养基相结合进行选择：A亲本用IOA处理，使细胞质不活化，这样A原生质体不能分裂；使用的培养基是不利于B亲本再生的培养基，这样B原生质体也不能再生，最后能再生的只能是A + B 体细胞杂种；⑤物理特性筛选法：利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种细胞；
[例3]：（2001上海高考题）现有甲、乙两个烟草品种(2N=48)，其基因型分别为aaBB和AAbb，这两对基因位于非同源染色体上，且在光照强度大于800勒克斯时，都不能生长，这是由于它们中的一对隐性纯合基因(aa或bb)作用的结果。取甲乙两品种的花粉分别按图示操作培养成植株，将它们的叶肉细胞制成原生质体，并将两者相混，使之融合，诱导产生细胞团。然后，放到大于800勒克斯光照下培养，结果有的细胞团不能分化，有的能分化发育成植株。
（1）在大于800勒克斯光照下培养，有_______种细胞团不能分化。
（2）能分化的细胞团是由__________的原生质体融合来的(这里只考虑2个原生质体的相互融合)。
（3）由该细胞团分化发育成的植株，其染色体数是_______，基因型是_________。
（4）该植株自交后代中，在大于800勒克斯光照下，出现不能生长的植株的概率是_________
[解析]：根据题意，基因型aaBB和AAbb的个体在光照强度大于800勒克斯时都不能生长，这是由于它们中的一对隐性纯合基因(aa或bb)作用的结果，我们可推测出：能生长的植株一定同时含A、B基因。本题可用遗传互补筛选法解题，见右图所示。甲品种aaBB产生的花粉aB，花药离体培养成的植株为aB，乙品种AAbb产生的花粉Ab，花药离体培养成的植株为Ab，它们的叶肉细胞制成原生质体，将两者相混融合，诱导产生细胞团有aaBB、AAbb 、AaBb，只有AaBb在光照强度大于800勒克斯下能生长。AaBb的个体自交后代中出现不能生长的植株的基因型aa___或___bb的个体，能生长的植株基因型是AABB、AaBb、AABb、AaBB，由于AaBb的个体能产生四种配子其比例相等，其后代产生AABB的比例为1/4×1/4=1/16、AaBb为l/2×1/2=1/4、AABb为l/4×1/2=1/8、AaBB为l/2×1/4=1/8，这些个体之和为9/16，其余为能生长的个体，其比例为7/16。
[答案]：（1）2 （2）甲乙两品种 （3）48 AaBb （4）7/16
2.2单克隆抗体的制备中杂交瘤细胞的筛选
2.2.1杂交瘤细胞的第一次筛选
B淋巴细胞与骨髓细胞的融合随机性很大，因此，细胞融合过程中将会形成多种细胞的混合体，包括B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、B―B融合细胞、骨髓瘤―骨髓瘤融合细胞、B―骨髓瘤融合细胞（即杂交瘤细胞）和细胞多聚体（容易死亡，无需筛选）。在细胞混合体中，只有B淋巴细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞才有意义，所以必须从不同种类的细胞中筛选出杂交瘤细胞。目前常采用HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞，其原理是：DNA的合成有D和S两种途径。B淋巴细胞具有D和S两种DNA合成途径，但一般不分裂增殖；骨髓瘤细胞只有一种DNA合成途径，即D途径，可无限增殖；杂交瘤细胞具有D和S两种DNA合成途径，它利用其中任何一个途径都可无限增殖。由于HAT选择培养基是在普通培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质配制而成，由于氨基喋呤可阻断D途径，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，而且B淋巴细胞一般不增殖，淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤细胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。所以多种不同形式细胞的混合体在HAT选择培养液中，只有杂交瘤细胞能存活下来并不断增殖。
2.2.2杂交瘤细胞的第二次筛选
由于实验小鼠在注射目标抗原前，其体内已存在大量的病原体，因此小鼠体内会存在大量的针对不同种类抗原的免疫B淋巴细胞。所以在细胞融合时产生的杂交瘤细胞的种类也很多，但是只有与目标抗原有特异性的免疫B淋巴细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞才是所需要的。第二次筛选的常用方法：①放射性免疫测定：用于可溶性抗原细胞的单克隆抗体的检测；②酶联免疫吸附试验：用于可溶性抗原、细胞和病毒等的单克隆抗体的检测；③免疫荧光试验：用于细胞表面抗原的单克隆抗体的检测。利用上述方法选出针对目标抗原的抗体的阳性杂交瘤细胞。
[例4]：1975年科学家首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。请观察下图，回答问题：
（1）1984年以来，科学家针对如右图所示的单克隆抗体来自_________，应用于人体，会作为__________产生___________，加速排斥反应，以及完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透肿瘤组织，达不到有效治疗的浓度等问题，制备出可用于肿瘤治疗的相对分子质量小的单克隆抗体。
（2）制备单克隆抗体的B淋巴细胞一般从 _______（器官）中采集。从下表看，用于筛选杂交瘤细胞的是特定的__________培养基。
第11篇
摘要：近年来，基因工程技术广泛应用于马铃薯抗病、抗菌、抗虫、抗除草剂、品质改良及生物反应器的研究中并取得了一定进展。本文综述了近20年国内外基因工程在马铃薯育种上的应用现状，为马铃薯产业的大力发展提供了理论依据。
关键词：基因工程；马铃薯育种；应用现状
中图分类号：S532.035.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）06-0130-04
马铃薯（Solanum tuberosum）是世界上广为种植的粮、菜、饲兼用型作物，也是我国干旱和半干旱地区重要的经济作物，可以加工制成各种产品[1]，其栽培面积仅次于小麦、水稻和玉米。全世界每年的总产量将近3×108 t，中国占了其中的18%，居世界第一位[2]。马铃薯以其独特的经济价值受到了国内外的广泛关注，尤其近年来随着生物能源的兴起与开发，马铃薯也被视为一种新型的能源材料，从而掀起了对马铃薯生物学性状及应用的研究热潮[3]。
马铃薯为同源四倍体作物，其遗传分离复杂、后代筛选繁琐，用常规育种方法改良品种难度极大。尽管已培育出许多食用加工的优良品种，但至今许多优良栽培品种仍受到多种病虫害等的严重危害。近些年发展起来的植物基因工程技术，可以将各种来源的基因导入马铃薯，使马铃薯基因工程取得了许多突破，显示出诱人的前景。
1 马铃薯抗病基因工程
11 马铃薯抗病毒病基因工程
病毒病是马铃薯的主要病害之一，也是造成马铃薯退化的主要原因，严重危害着我国马铃薯的生产。随着病毒检测技术的发展，人们发现几乎所有马铃薯品种都受到一种或几种病毒的侵染[4]。目前已报道的侵染马铃薯的病毒有40余种[5]，国内发现的专门寄生于马铃薯的就有9种，即马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）以及马铃薯卷叶病毒（PLRV）[6]。其中马铃薯Y 病毒和马铃薯卷叶病毒是最主要的马铃薯病毒[7]。而且PVY+PVX或PVY+PLRV混合侵染带来的损失远远大于各病毒单独侵染。
马铃薯抗病毒基因工程主要有病毒外壳蛋白（CP）基因的交叉保护作用，RNA和反义RNA介导的抗性，核酶、缺损的复制酶基因介导的抗性以及干扰运动蛋白等[8]。在以上技术中， 利用病毒外壳蛋白基因介导植物产生抗病性是目前马铃薯抗病毒基因工程的热点之一。近十多年来，应用生物工程技术将病毒外壳蛋白（CP） 基因导入马铃薯的研究工作已取得重要进展[9]，有些学者鉴定了表达PVX+PVY双价CP基因转基因马铃薯的抗病性，结果表明转基因马铃薯对PVX+PVY复合感染产生不同程度的抗性[10]。利用反义RNA技术，有些学者用非翻译的序列转化植株也能产生抗性，RNA与反义RNA转化阻碍翻译的进行，导致基因产物减少[11]。马铃薯抗病毒基因工程的成果还有很多，随着对病毒与植物相互作用机理的深入研究，抗病毒基因工程在育种上将会发挥更大的作用。
12 马铃薯抗真菌病基因工程
真菌性病害也是限制马铃薯产量和品质的主要病害之一，马铃薯真菌病害种类繁多，其中最主要的是晚疫病菌（Phytophthora infestans），往往造成马铃薯大幅度减产。近年来通过基因工程技术在马铃薯抗真菌病方面取得一定的进展。在马铃薯抗真菌病基因工程育种中大量使用的主要有植物病程相关蛋白、水解酶——几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶、抗真菌蛋白（肽）、抑制病原菌毒性因子的蛋白等等。付道林等[12]将携带有Ⅰ型烟草β-1，3-葡聚糖酶基因和Ⅰ型菜豆几丁质酶基因的pBLGC质粒导入津引8号马铃薯品种中，获得了抗病转基因品种。Ali等[13]将人工合成的4种阳离子肽基因导入马铃薯并对马铃薯病原真菌和细菌的抗菌活性进行了测试，所获得的转基因植株对相应病原菌的抗性都得到一定程度的增强。
13 马铃薯抗细菌病基因工程
近年来植物抗细菌病基因工程研究取得的进展，主要表现在阻断病原细菌的致病途径，强化植物抗病反应及其信号转导途径，植物防御基因的表达，利用非植物源抗菌蛋白和利用细胞凋亡反应控制病害的发生等方面。Dong等[14]将克隆于芽孢杆菌的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）水解酶基因aiiA转入烟草和马铃薯，转基因烟草和马铃薯对软腐病菌（Erwinia carotovora）的抗性显著提高。贾士荣等[15]将人工合成的Cecropin B及Shiva A基因转入我国7个马铃薯主栽品种中，经温室和田间接种试验鉴定，部分转基因材料对青枯病的抗性比对照提高1～3级。
2 马铃薯抗虫基因工程
在马铃薯的整个生育期，常常遭受各种害虫的侵袭，如蚜虫、马铃薯块茎夜蛾、蛴螬等，直接危害地上与地下部分，造成产量和品质下降，甚至导致死亡。迄今为止，各国研究人员已经利用基因工程技术分离得到了不同来源的抗虫基因，其中用于提高植物抗虫性的主要有两类：一类是从细菌中分离出来的抗虫基因，如苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因（Bt基因）；另一类是从植物中分离出来的抗虫基因，如蛋白酶抑制剂基因（PI基因）、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因等。其中，Bt基因和PI基因在农业上应用最广[16]。Arpaia等[17]的研究结果表明，雌性科罗拉多甲虫取食了含有cry3B的转基因马铃薯后，生殖能力受到了严重损害，不能产生后代。Marchetti等[18]从大豆中分离得到了几种蛋白酶抑制剂基因（KTi3、C-Ⅱand PⅠ-Ⅳ），并将其导入马铃薯中，经检测在表达足够数量抑制剂的情况下，幼虫重量的增加降低50%。
3 马铃薯抗除草剂基因工程
通过化学方法控制杂草已成为现代化农业生产中不可缺少的一部分，但除草剂在杀死杂草的同时不仅污染环境，有的还会对农作物的生长产生伤害。而通过基因工程技术将耐除草剂基因导入作物，增加了对除草剂的选择性和安全性[19]。耐除草剂基因工程主要从两个方面解决问题，一是修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感，或使其过量表达让植物吸收除草剂以后仍能进行正常代谢；二是引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前降解或解毒。如比利时植物遗传部门的研究人员把编码乙酰CoA转移酶的Bar基因导入马铃薯，获得耐除草剂的转基因植株。
4 马铃薯抗逆基因工程
干旱、高温、低温、盐胁迫等逆境条件影响马铃薯生长，严重时甚至导致死亡。随着分子生物学的发展，研究者从基因组成、表达调控及信号传导等方面进行深入研究，明确植物对逆境胁迫的耐（抗）性机理，将相关基因导入马铃薯以改良胁迫抗性。例如，Goddijn等[20]成功地将大肠杆菌海藻糖合成酶基因复合体otsAB基因导入马铃薯，明显提高了转基因植株的抗旱性。赵映琴[21]将AtNHX1基因转入马铃薯株系中，在相同盐浓度胁迫下，转基因马铃薯的株高明显高于对照，尤其是在高盐条件下胁迫90 d时，大部分转基因株系的株高均显著高于对照。
5 马铃薯加工品质改善基因工程
51 马铃薯淀粉品质改良基因工程
在淀粉的生物合成过程中，影响淀粉品质的关键酶是淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase），它们共同作用影响淀粉颗粒的结构和特性。利用基因工程手段改变这些酶在植物中的表达，从而获得具有独特性质、新型的马铃薯淀粉用于食品加工或其它工业生产之中。宋波涛等[22]通过根癌农杆菌介导法将CaMV35S驱动的正/反义sAGP基因导入马铃薯后，转正义sAGP基因的淀粉含量增加5%～6%，而转反义sAGP基因淀粉含量下降达27%。在马铃薯中，AGPase水平降低时，直链淀粉含量显著降低，而支链淀粉含量升高[23]。
52 马铃薯块茎抗褐变基因工程
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是产生褐变现象的主要原因。许多研究者运用反义RNA技术特异抑制PPO的表达，从而达到抑制马铃薯褐化的目的。如Bachem等[24]将反义多酚氧化酶基因导入马铃薯，能够有效增强块茎的抗褐变能力。
53 马铃薯块茎抗低温糖化基因工程
据资料介绍，块茎在低温贮藏条件下的低温糖化给马铃薯加工产业带来的损失高达数千万美元。于是，人们借助基因工程技术来解决这一难题。张金文[25]克隆了马铃薯栽培品种“甘农薯1号”的酸性转化酶基因，构建了反义植物表达载体，获得了转基因植株。除了运用反义RNA技术外，还可通过表达自身或外源的酸性转化酶抑制因子来改善马铃薯低温糖化。如超量表达烟草酸性转化酶抑制子的马铃薯在4℃低温贮藏后块茎中的还原糖含量与液泡酸性转化酶的活性都显著降低，两者呈正相关[26]。张琼[27]用低温诱导块茎特异表达融合启动子pCL与pCLMlb的反义转基因株系，结果酸性转化酶的活性显著降低，进而引起还原糖含量不同程度的下降。
6 马铃薯生物反应器基因工程
马铃薯作为生物反应器的基因工程主要有：利用马铃薯生产疫苗、植物抗体、蛋白质多肽药物、糖类物质、工业可降解塑料的原料及可降解生物塑料等。Zhang等[28]利用农杆菌介导将人免疫缺陷Ⅰ型病毒 HIV-1p24蛋白插入马铃薯基因组，叶片中的表达量为35 mg/g。李晋涛等[29]报道，将人源轮状病毒（RV）转入马铃薯，并用小鼠口服该转基因植株进行免疫应答研究，结果显示，人源轮状病毒转基因植物疫苗联合黏膜佐剂免疫动物可诱导特异的系统与黏膜免疫应答，且黏膜免疫强度略高于系统免疫。谢安勇等[30]利用聚合酶链式反应（PCR）技术，从真养产碱杆菌H16染色体DNA中扩增并克隆了调控PHB生物合成的phbB和phbC基因；雍伟东等[31]将多聚β-羟基丁酸酯（PHB）合成过程中所需的2种酶phbB和phbC的编码基因转入到马铃薯体内，并采用特定的启动子使这些基因的编码蛋白最后定位在细胞的叶绿体中，结果表明，转基因马铃薯叶片中PHB干物质的含量可以达到0025～1800 g/kg，并且这些外源基因的表达并不影响马铃薯的生长和育性。
7 前景展望
马铃薯基因工程育种在短短十几年中已取得了丰硕成果，其在抗虫、抗病、抗逆等方面具有传统育种和生产无法比拟的优越性，提高了对病虫的抵抗和防御能力，增强了对干旱高盐的适应性，并能减少化学农药的使用量及保护生态环境，为培育马铃薯优良品系开辟了一条崭新的道路。同时，作为生物反应器，生产人们所需要的大量疫苗和药物，可供人类和家畜直接使用，便捷可靠。但是，目前马铃薯基因工程还受许多因素的制约，如转基因效率低和转基因生物安全性等问题。为了更好地发展和应用这项技术，在今后的研究中应着重解决以下问题：首先继续发现新型、高效基因，并研究其机制；其次应加强研究目的基因在转基因植株后代中的遗传、表达稳定性；且深入研究基因抗性的机制并制定确实有效的反抗性措施。尽管还存在许多有待进一步解决的问题，但应该看到，马铃薯基因工程的发展速度是非常快的，其应用前景十分广阔。参 考 文 献：
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第12篇
文/张敏杰
转基因技术通常也称为基因工程技术，是指利用载体系统的重组DNA技术以及通过物理、化学和生物学等方法，将重组DNA导入有机体的技术。转基因技术是首先在体外进行基因操作，然后转入受体细胞表达。外源基因在受体细胞中的表达可进行人为调控，克服了生物物种之间生殖隔离的自然屏障，可按照人们的意志创造出自然界中原来并不存在的新的生物功能和类型。
1 转基因植物
转基因作物的研究规模已达到了空前的水平。自1983年世界上第一例转基因抗病毒植物诞生以来，转基因作物的研制、中间试验、田间释放和商业化种植得到了迅速的发展，到1997年底，转基因植物已达几百种；转基因作物于1986年在美国和法国首次进入大田试验，到1997年底全世界转基因作物的田间试验已达25000多例；1994年，美国批准了转基因延熟番茄的商业化生产，到1997年底，全世界共有51种转基因植物产品被正式投入商品化生产。
转基因作物的种植面积正在迅速扩大。全世界转基因作物的种植面积在1995年仅为1．2×106hm2，1996年为2．84×106hm2，1997年为1．25×107hm2，1998年为2．78×107hm2，1999年增至3．99×107hm2。2000年进一步增至4．42×107hm2，2001年已达5．26×107hm2。2001年全球转基因作物按作物种类统计为：大豆占46%，棉花占20%，油菜占11%，玉米占7%；按国家统计：美国占70%（面积，下同）、阿根廷占22%、加拿大占6%、中国占1%～3％，上述4国占全球转基因作物种植面积的99%；按目标性状分类：抗除草剂转基因作物占77%，抗虫转基因作物占15%。据统计，1999年美国转基因大豆、棉花和玉米的种植面积，分别占该国相应作物种植面积的55%、50%和30%。
转基因作物具有巨大的经济效益，1997年美国转基因抗虫棉种植面积为1×106hm2，平均增产70%，每公顷抗虫棉可增加净收益83美元，直接经济效益近1亿美元；1998年美国种植转基因抗虫玉米达5×106hm2，平均增产9%，其净收益为68．1美元／hm2，可产生直接经济效益3．4亿美元。1995年全球转基因作物的销售额仅为0．75亿美元，1998年达到12亿美元～15亿美元，2000年已达30亿美元，5年间增加了40倍。预计2005年将达60亿美元，2010年将达到200亿美元。
2 植物用转基因微生物
自上世纪80年代以来，重组农业微生物工程研究取得了突破性进展，其中新型重组固氮微生物研究已进入田间试验，一些杀虫、防病遗传工程微生物进入田间试验或商业化生产。防冻害基因工程菌株已于1987年进入田间试验，防治果树根癌病工程菌株也于1991年和1992年先后在澳大利亚和美国获准登记，目前已在澳大利亚、美国、加拿大和西欧一些国家销售，这是世界上首例商品化生产的植病生防基因工程细菌制剂。具有杀虫活性的转B．t基因工程细菌，自1991年起已有多个产品进入市场。在高铵条件下仍保持良好固氮能力的耐铵工程菌株，也进入田间试验。
3 转基因动物
转基因动物主要应用于以下几个方面：改良动物品种和生产性能；生产人药用蛋白和营养保健蛋白；生产人用器官移植的异种供体；建立疾病和药物筛选模型；生产新型生物材料等。1998年全球动物生物技术产品总销售额约为6．2亿美元，预计2010年总销售额将达到110亿美元，其中75亿美元是转基因动物产品。
4 兽用基因工程生物制品
兽用基因工程生物制品是指利用重组DNA技术生产的兽用免疫制剂。主要包括：单克隆抗体等诊断试剂，目前国内外正在研究、开发或已应用的单克隆抗体诊断试剂已达1000多种；基因工程疫苗，已有44例获准进行商品化生产，其中重组亚单位疫苗30例，基因缺失活疫苗12例，基因重组活疫苗2例。此外，还有DNA疫苗和兽用基因植物源生物制品等。
5 转基因水生生物
迄今为止，全世界研究的转基因水生生物达20余种，已有8种进入中间试验，其中我国有一种两例，仅有大西洋鲑1种可能已开始小规模商品化生产。
6 我国农业转基因生物研发现状与产业化概况
我国转基因植物的研究开发始于20世纪80年代，1986年启动的863高新技术计划起到了关键性的导向、带动和辐射作用。据1996年统计，国内正在研究和开发的转基因植物约47种，涉及各类基因103种。1997年～1999年，有26例转基因植物获准进行商业化生产。按转基因性状分：抗虫16例，抗病毒9例，改良品质1例。按作物划分：棉16例，番茄5例，甜椒4例，矮牵牛1例。
转基因抗虫棉是国内植物基因工程应用于农业生产的第一个成功范例，使我国成为继美国之后独立研制成抗虫棉，并具有自主知识产权的第二个国家。1998年～2001年4年累计种植逾1．3×106hm2，减少农药使用量70%以上，产生了巨大的社会、经济和生态效益。由于其伞形辐射的带动作用，抗虫转基因水稻、玉米、杨树等一批后继转基因产品正在进行田间试验，蓄势待发。转基因技术将使农业产业发生深刻的结构变化，向农业与医药、农业与食品、农业与加工结合的方向发展。
我国植物用转基因微生物研究已取得长足进展，正在研发的防病杀虫微生物13种，涉及基因16种；固氮微生物8种，涉及基因12种，大多已进入中间试验和环境释放试验。我国兽用基因工程生物制品研究与产业化进展迅速，已有近70种单克隆抗体等诊断试剂投放市场，2例基因工程疫苗获准进行商品化生产，其中重组亚单位疫苗1例，基因重组活疫苗1例。
我国转基因水生生物研究取得了举世注目的成就，1985年，我国培育出世界首批转基因鱼。此后，培育出比正常生长速度快3倍～4．6倍的转基因泥鳅。目前，转生长激素基因鲤、转大麻哈鱼生长激素基因鲤均进入中试阶段。此外，我国还开展了藻类、贝类等其他水生生物的转基因研究。我国转基因动物研究成绩斐然，生长速度快、瘦肉率高、对某些病毒有一定抗性的转基因猪培育成功，乳腺组织能够表达人药用蛋白凝血因子IX、人生长激素、人红细胞生成素的转基因羊已进入中试和安全性评价阶段，此外，还成功地培育了转基因牛。
第13篇
【摘要】
目的: 制备和鉴定抗His标签单克隆抗体（mAb）， 初步建立检测和纯化带His标签融合蛋白的方法。方法: 用碳化二亚胺法合成His-tag完全抗原， 免疫BALB/c小鼠， 采用杂交瘤技术进行细胞融合， 通过有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水， 用辛酸-硫酸铵法纯化， 并对纯化的mAb进行特异性鉴定。结果: His-tag完全抗原偶联成功， 经细胞融合、 筛选及克隆化， 成功获得1株分泌His标签mAb的杂交瘤细胞株。制备腹水测得腹水效价高于 1∶106， 且此株mAb与其他融合蛋白标签无交叉反应， 并在含His标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果。结论: 成功制备了1株His标签mAb， 为带His标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具。
【关键词】 His标签 单克隆抗体 蛋白印迹
His-tag是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)组成的短肽，专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化， His-tag 融合标签与其他标签相比有很多明显优势， 是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种［1］。利用 His标签可以建立一个基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。目前商品化His-tag的单克隆抗体(mAb)种类不多， 且价格也十分昂贵。因此， 研制出 His-tag的mAb， 在融合蛋白质的研究中具有非常广泛的应用前景。
1 材料和方法
1.1 材料 His六肽为西安蓝晶生物科技有限公司合成; 卵清白蛋白 (OVA)、 牛血清白蛋白（BSA）、 兔抗小鼠 IgA、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3和IgM抗体均购自Sigma公司; HRP标记的羊抗鼠 IgG由河南省生物工程技术研究中心提供; MULTISKAN MK3酶标仪购自Thermo公司; 3326型CO2培养箱购自Forma公司; 硝酸纤维素膜（NC膜）购自Amersham公司; SDS-PAGE电泳仪购自BIO-RAD公司; BALB/c纯系雄性小鼠（鼠龄6～8周， 体质量18～22 g）购自中国医学科学院动物研究所。
1.2 方法
1.2.1 人工抗原的合成 （1）免疫原的合成: 称取4.4 mg His-tag和5 mg OVA溶于1 mL PB（0.05 mol/L， pH7.0）中， 充分溶解后， 将200 μL含有2.2 mg EDC的PB溶液逐滴加入， 边滴入边混匀， 摇床100 r/min反应4 h， 4℃静置过夜， 用 0.01 mol/L， pH7.0 PBS透析 72 h， 存储于-20℃备用。（2）包被抗原的合成: 合成方法同免疫抗原的合成，载体蛋白为 BSA。
1.2.2 杂交瘤细胞株的建立 按本室常规方法免疫BALB/c小鼠（20～30 μg /只）， 末次免疫后免疫小鼠血清效价达到 1∶10 000以上， 进行细胞融合， 并以间接ELISA法筛选分泌抗 His-tag的阳性克隆。克隆化及腹水制备， 均按实验室常规方法进行。
1.2.3 mAb特性鉴定 （1）效价测定: 以 BSA-His-tag（100 ng/孔）包被 ELISA 板， 腹水从 1∶10 00 开始作10倍稀释。用间接 ELISA法进行测定。（2）mAb特异性鉴定: 用于抗体交叉反应性研究的为常用蛋白标签， c-myc、 多聚精氨酸、 FLAG、 钙调蛋白结合多肽、 β-actin、 谷胱甘肽S转移酶 (GST)、 葡萄球菌蛋白A(SPA)、 麦芽糖结合蛋白、 硫氧化还原蛋白及 Ig的 Fc段， 用间接 ELISA法测定。（3）抗体蛋白纯度测定: 抗体纯度测定采用 SDS-PAGE凝胶电泳分析。（4）Ig类和亚类的鉴定: mAb类型及亚类鉴定采用双向琼脂扩散试验［2］和用兔抗小鼠 IgA、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3和 IgM酶标抗体的间接 ELISA试验检测。
1.2.4 mAb在检测带His-tag的融合蛋白中的初步应用 （1）酶标抗体的制备及活性测定: 酶标抗体的制备采用改良过碘酸钠法［3］。酶标抗体活性测定方法: 将包被抗原用包被液稀释成100 ng/孔包被96孔酶标板， 4℃过夜， 洗涤后分别加入梯度稀释的酶标抗体， 37℃温育 30 min， 洗涤; 加底物显色 20 min， 加终止液终止反应， 用酶标仪测吸光值。取A值为1.0左右时所对应的酶标抗体稀释倍数为其效价。（2）融合蛋白的检测: 采用蛋白印迹法对本基因工程实验室所纯化的带His-tag的基因工程蛋白进行检测［4］。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立及mAb的特性鉴定 获得1株高亲和力、 高特异性杂交瘤细胞， 命名为 3A-3。此株细胞经过多次传代、 3次冻存及复苏， 杂交瘤细胞分泌抗体稳定。此株mAb经检测， 腹水效价达到 2×10-6 ; mAb经双向琼脂扩散试验和间接ELISA法检测为: IgG1; 各种融合蛋白标签与His-tag mAb均无交叉反应性; SDS-PAGE电泳结果显示: 抗体纯度≥90%。
2.2 酶标抗体活性测定结果 由酶标仪（双波长450 nm和630 nm）检测A值， 测得酶标抗体活性达106。
2.3 带His-tag的融合蛋白检测结果 Western blot结果显示， 制备的mAb与带His-tag的融合蛋白有较强的特异性反应（图1）。
图1 带His-tag的融合蛋白检测结果（略）
A， C: SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;
B， D: Western blot检测结果.
图1B和图1D分别是图1A和图1C的对应。其中11是不带His-tag的阴性对照， 其余所用的12种蛋白均为本实验室纯化的带His-tag的基因工程蛋白。其中1、 10中His6-tag与 RGS—相连， 位于基因工程蛋白N端， 2、 4、 5、 6、 8、 12、 13中His-tag位于基因工程蛋白内部， 3、 7、 9中His-tag位于基因工程蛋白C端。结果表明， 此株mAb与河南省生物工程技术研究中心基因工程实验室所有带His-tag的基因工程蛋白反应均呈阳性， 与不带His-tag的基因工程蛋白无反应， 故此株mAb可以用于检测带His-tag的基因工程融合蛋白。
3 讨论
融合标签根据其相对分子质量(Mr)大小可以分为两大类: 大的蛋白质分子(或蛋白质结构域及其衍生物)和小的多肽片段（His-tag等）。虽然有些作用机制尚不明确， 但已证实融合标签的使用可以简化蛋白质的纯化过程、 控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、 使体内生物事件可视化、 提高重组蛋白质的产量、 增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等［5］。标签融合蛋白所具有的上述优越性， 使之成为后基因组时代的重要研究工具， 而抗标签蛋白的mAb也将成为研究相应融合蛋白的主要方法之一。 His6-tag由于其Mr小， 单独不具备免疫原性， 故需将其连接到蛋白质大分子上， 从而借助大分子的T细胞表位， 刺激机体产生特异性抗体免疫应答。本试验采用碳化二亚胺法制备出了人工抗原。从免疫效果来看， 该方法合成的His6全抗原免疫原性较好， 能使机体产生较强的免疫应答， 小鼠抗血清效价（ELISA）达到106以上。应用淋巴细胞杂交瘤技术获得的此株抗His6-tag的mAb， 经鉴定具有效价高、 特异性强、 亲和力高等特点。在含His6-tag融合蛋白的鉴定中， His6-tag的mAb与N端、 内部、 C端带His6-tag的基因工程蛋白均能发生反应， 取得预期效果。此将为后基因组时代大量涌现的新分子的结构和功能研究提供重要的工具， 有很高的实用价值。
目前纯化带His-tag的基因工程蛋白多采用固定化金属螯合层析， 利用过渡态金属离子与组氨酸侧链之间的相互作用进而分离目的蛋白。虽然用此法纯化His6-tag融合蛋白与其他标签融合蛋白相比有很多明显优势， 但此法也有其缺点: 在金属离子存在的情况下， 多聚组氨酸倾向于形成一种hem-like的结构， 这是一种疏水性的结构， 因而与某些蛋白质融合后， 有被埋藏在融合靶蛋白质内部的可能性［5］; 用咪唑洗脱会导致蛋白质的聚集。另外， 带His-tag的基因工程蛋白的纯化率还有一定上升空间， 能否通过His亲和层析柱在尽量低损失的情况下来有效填补空缺， 仍需要进一步的实验摸索。
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第14篇
论文摘要：介绍了当前大批量定制的特点与发展方向实施策略核心技术，分析了在技术驱动的大批量定制生产模式的环境下，结合产品基因工程与产品逆向工程，进行开发客户需求获取与分析技术的关键内容，并提出解决方案，建立了有效的产品族模型，并开发了一个系统原形，为以后的研究工作打下了一个良好的基础。
在目前众多针对大批量定制生产模式(MC)的研究中，绝大多数的研究均局限于客户驱动的MC模式(一言需求驱动)，例如在针对产品配置模型的研究中，认为“大批量定制是客户驱动的、以满足客户需求为定制条件的生产模式，客户要求是MC中产品配置设计的最初来源”。这些的研究过于强调客户的重要性，将客户需求渗透人产品生命周期的各个阶段中，甚至提出客户参与设计的概念。而笔者认为，客户驱动的MC模式仅仅是一种较为低级的，过渡性质的MC;其更高级的阶段，则是以先进技术为驱动力的，可称之为技术驱动型的大批量定制汀echnology driven Mass Customization )。目前TDMC已经出现了成功的例子，例如戴尔公司与摩托罗拉公司。从客户的角度看来，要生成满足需求的产品是如此容易，以至于只需在其定制网站上进行简单的选取即可生成令人满意的产品，并且在选取完成之后马上可以下达订单。究其内在原因，则是在先进技术的支持和驱动下形成其完善的产品族。因此，技术驱动模式将是大批量定制的发展方向。但是客户需求是产品存在的先决条件，在任何MC模式中都占据着极其重要的地位，没有需求就没有产品，本文将探讨客户需求在丁DMC的模式下，尤其是在产品的概念设计中，起到了怎样的作用。首先介绍需求分析技术所在的理论框架:产品基因工程。其次在产品基因工程平台上，介绍了对于需求分析极其重要的相关理论:产品逆向工程。然后在这个环境中建立需求模型和技术体系并加以分析，最后介绍一个系统原形。
1产品基因工程与产品逆向工程
1.1产品基因工程(Product Genetic Engineering)
近几十年在机械产品设计领域中，产生了大量的设计理论与设计方法，如公理化设计JRIZ设计理论等，并支持设计者进行研究和实践。然而，仍然缺乏有效的设计理论和可操作方法以支持真正自顶向下的、自动化产品设计。在经过进化设计和变参设计、基因算法和基因编程、产品信息基因的各发展阶段之后，基于产品快速增长和新物种产生的机制，产品基因工程(Product Genetic Engineering)的概念应运而生，并且相对于有机的产品/人工设计，引人了细胞分裂生长的机制。
1，1，1产品基因
产品基因的概念是仿照生物体而提出的，与生物基因类比，产品基因是产品的构成蓝图，是决定产品功能与结构的最小功能单元。并且具有与生物基因类似的性质:遗传性、自组织性和自适应性。产品基因有三种:功能基因((Function Genes， FGs)、控制基因(Control Genes， CGs)和结构基因(Structural Genes， SGs)。产品基因为产品全部信息的集成，贯穿于产品的整个生命周期之中，在产品的需求、设计、制造、装配和使用、维护、直至报废的整个生命周期中的不同阶段表现为不同的信息。详细分类包括需求基因、设计基因、制造基因、装配基因、商品基因、使用及维护基因和回收基因等等。总之，产品基因是一个完备的信息系统，不仅包括产品的结构、功能、制造、销售等产品生命周期各阶段的相关数据，还包含对产品生长各阶段进行控制的信息(全自动或半自动)，两部分共同来完成产品的生长过程。
1.1.2产品全生命周期基因工程系统框架
生物基因工程能够将基因从生物体内提取出来，在体外进行改造，再将重组基因导人到受体细胞中，以进行表达。生物系统的生长、进化与产品设计存在着相似性，将生物的有关遗传规律与产品设计理论有机地联系起来，对于机械产品来说，可以借鉴生物基因工程原理，提取产品的基因，并加以改造，重组出新的产品基因，并使其自动生长，生成新的机械产品，用于支持产品的创新设计。产品基因工程就是基因工程在机械领域的应用，它是提取现有产品基因、建立产品基因库、根据用户需求按照一定的法则进行基因重组、重组基因评价、在特定环境下进行基因表达和最终对新生成产品评价的过程，主要用于设计新产品以支持产品的创新设计。图1为产品全生命周期基因工程系统框架。
1.1.3产品基因工程与大批量定制
根据客户需求对企业生产活动影响程度的不同，即客户订单分离点在企业生产过程中位置的不同，可以将不同的大批量定制的生产方式方式分成按订单销售(Sale to order， STO)、按订单装配(Assemble to order， ATO)、按订单制造(Make to order， MTO)、按订单设计(Engineer to order， ETO)和按订单研制(Research to order， RTO)五种类型。大批量定制的技术核心是产品及零部件的标准化和模块化，而产品基因本身就代表着标准功能表面、标准模式、标准零部件和标准产品，因此我们可以基于Top-Down的风格将产品基因分为五个层次，分别是产品基因、模块基因、零件基因、模式基因和功能表面基因，利用产品基因工程方法，同样基于Top-Down的顺序将它们应用于产品的生长型设计之中，并且分别建立五个层次的基因库，分别与STO，ATO，MTO，ETO和RTO相对应，以支持不同定制深度的产品大规模定制设计。由此可知，产品基因工程正是实现大批量定制的良好解决方案。
1.2产品逆向工程(Product Reverse Engineering)
1.2.1产品逆向工程的产生与概念
反求技术在引进国外的先进产品、技术、生产线的消化和吸收中发挥了积极的作用，但却无法真正突破技术壁垒，打破经验的局限性，因为简单的模仿无法了解到最初的产品设计思想。
我们把产品逆向工程定义为:在产品基因工程理论指导下根据现有产品及其相关信息重新构造产品基因的创造性工程。其本质上就是还原出产品可行的设计过程，最大程度上吸收原有产品的设计思想及其关键技术，从而支持产品的创新设计、提高我们自主设计的能力。
产品逆向工程，将一个成熟产品输人值系统进行分析，分解至功能表面的层面上，然后进行重构，并在重构的过程中对其进行优化，包括模块化和标准化，使之在更深层面和更细粒度上符合大批量定制的生产要求。而在重构过程中，优化进行的依据则需要客户需求的获取分析结果作为参考。所以，只有准确把握市场动态和客户需求变动的前提下，产品的模块化才能在正确的方向上进行，才能真正使产品具有生命力和竞争力。
1.2.2产品逆向工程系统框架
如图2所示，首先，建立数字化三维产品库，包括整机、部件、零件等，对于其他CAD系统则通过S下EP中性文件转化方法集成;然后，建立产品概念结构模型;最后，通过机电产品基因获取模块，建立分层次基因库，包括产品族、整机、部件、零件、模式、功能表面等。其中的关键技术包括面向产品概念结构的快速三维造型、与现有CAD系统计称技术(S下EP文件读取、翻译、转化等)、逆向设计过程重建与产品基因获取等。
1.2.3产品逆向工程与产品基因库
建立结构合理，标准化和模块化的产品基因库，有利于生成具有良好结构的产品族模型，也是实现技术驱动型大批量定制的先决条件。产品逆向工程的结果，恰恰就是一个数字化、分层次的产品基因库，因此，我们可以利用产品逆向工程顺利实现技术驱动的大批量定制模式。
由以上分析可知:产品基因工程是大批量定制(Mass customization )得以实现的环境与条件;产品逆向工程，是技术驱动(technology-driven)的保证与实现手段。PRE与PGE从两个方面共同支持下DMC，从而为下DMC的发展提供了一条可行的道路。
2 PGE框架中的用户需求分析
当对产品概念模型的分解过程进行到完成功能表面的创建阶段时，就要依靠设计要求，选择合理的功能模式进行重构，基于产品基囚库选取相应基囚，组合称为符合客户需求的产品族模型，所以其中的设计需求与产品基因库均需要客户需求与分析系统的支持和参与才能建立和完成。
在PG E框架中的用户需求获取与分析的过程，也即客户需求基因(Customer Request Genes，CRGs)的获取、建立和应用的过程。产品基因是一个复杂庞大的信息集成，产品所有特征应当包含在产品基因系统中，这样才能在控制基因的影响下，逐步生成产品实体。而需求基因则可以说成是产品基因的“基因”，它是产品生命周期的源头，因此，类似于客户需求对于产品概念设计的重要性来讲，需求基因在整个产品生命周期的范围内，同样起着至关重要的决定性作用与影响。
2.1需求基因模型
2.1.1需求基因的定义与获取
产品生命周期最初是从市场对产品功能的需求开始的，通过对需求功能的整理、分析，得到对需求功能系统的认识，全面获得产品的功能要求，即客户对产品的需求，并按其重要性的程度制定出度量指标。我们把这些带权重的产品功能要求的信息集合，称为需求基因。
客户需求有多种来源:包括销售数据、问卷调查、网上信息的搜集、访问信息、用户反馈、市场调研，还包括竞争对手信息获取以及对新生科研成果等多方面的来源，每一种来源均有可能成为创新产品产生和发展的原动力。 客户需求获取技术:由于客户需求的模糊性、不确定性和不完整性等等特点，目前国内外学者对于客户需求的获取技术进行了大量的研究。其中包括利用网络环境的基于Web源的客户需求获取技术、基于数据挖掘的需求获取分析技术、基于Web的客户交流平台等许多技术。我们可以在PGE框架中应用这些优秀有效的思想方法与技术来实现客户需求的获取。
2.1.2需求基因的表达与应用
需求基因可表达为如下函数:
其中，Ψk(x)为第k阶基函数，ωk为相应权重，Ι为函数集的空间。
需求基因(CRGs)与功能基因(Functional Genes ， FGs)功能基因来源于功能需求，是市场需求的功能基元。FGs对应于各种类型的功能表面，经“转录”成为产品功能原型。通常地，我们通过对市场需求的分析整理，分解重构出一个个需求子功能，需求子功能对应着FGs，FGs可转录为具体功能表面，需求总功能对应着功能表面间的联系，它们相互作用，形成产品原型。由此我们可以看出，产品的功能基因来源于用户的需求功能，是以产品原型为载体，从产品原型中抽象、提取出的本质含义，虽然抽象但极具概括性。因此，在此基础上，设计产品的执行功能元件，使得各个元件随意组合，形成功能相同而形态各异的实际产品，因此功能基因可“转录”为单位作用面及其组合关系。
可以类比目前客户需求到产品工程特性的映射研究现状:客户需求到产品工程特性的映射普遍采用QFD分析法，HoQ质量屋和层次分析法得到。由产品工程特性到产品的零部件以及产品的结构之间的映射，并未得到良好的解决方案，逆向工程在对这个问题的探求土取得了一定成果。分解重构理论在深人研究产品结构的基础上，提出了“功能表面”的概念，将产品的功能和结构结合在一起，进行综合考虑，是一种创新性的理论，对于开发新产品具有深远的意义。客户需求的分析技术就是建立在分解重构理论和生长型设计理论的基础上进行开发研究的。
2.2产品基因工程框架中的产品族模型及应用
2.2.1产品族模型
我们建立了独具特色的设计自动化系统原型DARFAD系统。DARFAD系统提供了产品设计从无到有、零件从少到多、表面从初级到高级、结构从简单到复杂的进化模式及相应的设计工具。在一定转换机制的作用下，产品族模型将经历由需求分析而产生的功能模型、概念结构模型和实体模型的各个阶段，最终生成产品实体族及实体产品，同时可对产品族模型进行相应的运动学动力学分析和可制造性分析，如图3所示。
2.2.2关于产品基因与“环境”的讨论
产品族模型源于产品基因，由基因组成的产品族模型本身就是可定制化的，提供了广泛的可选择的参数，可称之为“环境”，也可映射到真正产品生长的环境所具有的特征，在这些特征的影响之下，产品基因得以生长为不同的，符合用户要求的产品实体，反过来讲，缺乏了具备了各种特征的“环境”，产品基因将无法生长。
环境特征分析，环境特征为外在的决定条件，不仅决定了产品基因将生长为具体哪一种产品，更能决定产品基因能否能够成功地成长为产品实体，因此可以得出如下结论:环境特征通过产品基因映射到产品实体的功能特征公式:
其中F1为客户需求映射函数，F2为环境特征映射函数，PF为生成的产品族模型。
分析公式应达到的三个目标:①环境特征的有效提取、资源的充分利用;②映射过程中有效降低成本和节省时间;③质量、性能优良的产品实体。
图4为产品基因生长为产品实体的流程:
3基于Web的用户需求获取与分析系统
基于前面的综合分析，给出一套在产品基因工程平台上基于Web的用户需求获取与分析系统框架。图5为产品基因工程平台的框架示意。
在具体实现方面，我们可以借用面向对象的思想，将产品基因中标准化的单元固定存储在数据库中，而转化为方程则成为面向对象思想中的类成员函数，通过借助这种强大的辅助工具将实现过程的封装，对于操作者而言，客户对于产品的需求即可分解为针对系统的特定参数的值，而系统的输出结果正式此定制产品的基因。系统分为几大模块:
(1)客户需求获取模块
功能:将多种渠道获取的客户信息，转换为统一的数据形式，并进行存储。
(2)客户需求分析模块
功能:对数据进行分析，对照现有的零件库，提出改进意见，交与设计人员或其他模块来完成。
(3)系统基础模块
第15篇
生物育种方法的运用是体现高考生物试题难度、区分度的良好命题素材。近年来高考对该知识点的考查发生了较大的变化。从命题的理念看，由传统的杂交育种转向太空育种（诱变育种）和生物工程（基因工程和细胞工程）育种；从命题素材看，由对某种方法的单一考查转向对多种育种方法的综合考查；从能力要求看，由理解能力转向综合运用和实验探究能力的考查。现就如何根据育种的目的，选择不同需求的育种方法及规范作答等作一探讨。
一、根据目的，选择育种方法
育种的根本目的是培育具有优良性状（抗逆性好、生命力强、产量高、品质优良）的新品种，以便更好地为人类服务。从基因组成上看，目标基因型可能是纯合体，可防止后生性状分离，便于制种和推广；也可能是杂合体，即利用杂种优势的原理，如杂交水稻的培育、玉米的制种等。
例1 粮食是人类生存的基本条件，提高单位面积粮食的产量、质量是解决粮食问题的主要途径之一。
（1）为提高农作物的产量，得到抗倒伏、抗锈病等优良性状，科学家往往采取多种育种方法来培育符合农业生产要求的新品种。根据下面提供的材料，设计育种方案，以便最快得到所需品种。非生物材料：可自选。生物材料有：
A.水稻的高秆（显性）抗锈病（显性）纯种
B.水稻的矮秆（隐性）不抗锈病（隐性）纯种
C.水稻的高秆（显性）不抗锈病（隐性）纯种
①要得到能直接应用于生产的具有抗倒伏、抗锈病等优良性状的品种，该品种应是 。
②所选择的生物材料： （填写代表生物材料的字母）。
③育种过程中运用的最常见的方法是 。
④预期产生这种结果（所需性状类型）的概率是 。如果从播种到获得种子需要一年，则获得该品种植株至少需要 年。
（2）随着科技的发展，许多新的育种方法已经出现并投入使用。
①用普通小麦和黑麦培育的八倍体小黑麦的原理是 。
②航天育种是目前的一个热门话题，如“神七”就搭载了萌发着的植物种子。那么利用这种方法是否一定能获得人们所期望的理想性状？为什么？ 。
③螟虫是危害水稻的主要害虫之一。科学家为了减少农药的使用，希望培育出具有抗螟虫性状的水稻新品种，最适合的育种方法是 ，其原理是 。
【解析】（1）①能直接应用于生产的品种要保持优良性状，其自交后代不发生性状分离，一般为纯合子。②杂交育种的原理是基因重组，将两个品种的优良性状（抗倒伏、抗锈病）组合到一起，选择A、B两个亲本可以达到这一目的。③最快的育种方法是单倍体育种，常用技术有杂交、花药离体培养、人工诱导染色体加倍等。④亲本杂交后的子代花药离体培养、人工诱导染色体加倍后得到4种纯合子，比例相同，因此抗倒伏抗锈病性状的概率为1/4。亲本杂交得到种子（子代）需要1年，子代花药离体培养、人工诱导染色体加倍后，得到纯合子需要1年。
（2） ①普通小麦为六倍体，黑麦为二倍体，两者杂交得到的个体有4个染色体组，人工诱导染色体加倍后为八倍体，属于染色体变异。②“神七”搭载萌发着的植物种子的主要目的是借助太空的紫外线诱导基因突变，由于基因突变是不定向的，所以不一定能获得人们所期望的理想性状。③抗虫性状的基因一般来自原核生物，运用转基因技术将抗虫基因移接到植物体，属于基因重组。
【答案】（1）①纯合子（纯种） ②A、B ③单倍体育种 ④1/4 2
（2）①染色体变异 ②不一定；因为基因突变是不定向的 ③基因工程育种 基因重组
【方法规律】在解答“育种”类试题时，需要根据提供的材料选择合适的亲本及育种方法，分析育种过程中出现的问题，推测育种结果，并得出相关结论。
育种方法的选用要求：一般作物育种可以选用杂交育种和单倍体育种。如果检测纯合子，则用测交或自交；若既要检测纯合子又要分离纯合子时，如果优良性状是显性性状则用连续自交，如果优良性状是隐性性状则直接分离；已知多对性状要获得纯合子，首选单倍体育种，然后才是自交。为了得到特殊性状，可以选择诱变育种或多倍体育种，如果将不同物种的性状组合在一起，可以选用基因工程等。方法小结：
（1）若要培育隐性性状个体，则可用自交或杂交，只要出现该性状即可。
（2）有些植物如小麦、水稻等，杂交实验较难操作，则选择自交方法最简便。
（3）若要快速获得纯种，则用单倍体育种方法。
（4）若实验植物为营养繁殖类如土豆、地瓜等，则只要出现所需性状即可，不需要培育出纯种。
（5）若要培育之前没有的性状，则可用诱变育种。
（6）提高营养物质含量可运用多倍体育种。
（7）将两个亲本的不同优良性状集中在一起，可利用杂交育种（含植物细胞的杂交）。
（8）若要定向地改造生物性状，则可用基因工程育种。
（9）在实际育种过程中，并非单一地运用某种育种方式，而是根据需要选择多种育种方式综合运用。
二、掌握策略，设计育种实验
例2 如图所示，科研小组用60Co照射棉花种子，诱变当代获得棕色（纤维颜色）新性状，诱变1代获得低酚（棉酚含量）新性状。已知棉花的纤维颜色由一对基因（A、a）控制，棉酚含量由另一对基因（B、b）控制，两对基因独立遗传。
（1）两个新性状中，棕色是 性状，低酚是 性状。
（2）诱变当代中，棕色、高酚的棉花植株基因型是 ，白色、高酚的棉花植株基因型是 。
（3）棕色棉抗虫能力强，低酚棉产量高。为获得抗虫高产棉花新品种，研究人员将诱变1代中棕色、高酚植株自交，每株自交后代种植在一个单独的区域，从 的区域中得到纯合棕色、高酚植株。请你利用该纯合体作为一个亲本，再从诱变1代中选择另一个亲本，设计一方案，尽快选育出抗虫高产（棕色、低酚）的纯合棉花新品种（用遗传图解和必要的文字表示）。
【解析】棕色、高酚自交后代是棕色、高酚和白色、高酚，因此棕色是显性，亲代白色、高酚自交后代是白色、低酚和白色、高酚，因此低酚是隐性。诱变当代中，棕色、高酚的棉花植株的基因型是AaBB，白色高酚的棉花植株基因型是aaBb，纯合体后代不发生性状分离，因此应从不发生性状分离（或全为棕色棉或没有出现白色棉）的区域中选择出纯合棕色、高酚植株。育种时间短应选择单倍体育种方案。
【答案】（1）显性 隐性 （2）AaBB aaBb （3）不发生性状分离或全为棕色棉或没有出现白色棉
【思维拓展】设计育种方案时，应该注意是“动物育种”还是“植物育种”。植物育种时，可以用连续自交的方法获得纯合子，这是由于植物中雌雄同体的物种较多。动物只能选相同性状的个体相互，待性状分离后筛选，然后用测交方法检测纯合子，这是由于动物大多是雌雄异体，不能“自交”。
育种年限的要求及计算方法：若需要获得植株，则比获得种子多一年，因为获得种子后，第二年才能获得植株。若需要获得跨年度的植物（如小麦），则比不跨年度的植物（如豌豆）要多一年。
生物工程技术育种的组合及其遗传性：
（1）转基因植物培育：基因工程+植物组织培养，具有两亲本的遗传性。
（2）转基因动物培育：基因工程+动物细胞培养+胚胎移植，具有两亲本的遗传性。
（3）核移植（克隆）动物培育：核移植+动物细胞培养+胚胎移植，具有两亲本的遗传性。
（4）胚胎移植：有性生殖+动物细胞培养+胚胎移植，具有两亲本的遗传性。
（5）植物体细胞杂交：酶工程+体细胞融合+植物组织培养，具有两亲本的遗传性。
（6）试管婴儿：体外受精+动物细胞培养+胚胎移植，具有两亲本的遗传性。
注：异源多倍体具有两亲本的遗传性；胚胎分割产生的后代遗传性相同，相当于无性繁殖。
例3 家蚕是二倍体生物，含56条染色体，ZZ为雄性，ZW为雌性。幼蚕体色中的有斑纹和无斑纹性状分别由Ⅱ号染色体上的A和a基因控制。雄蚕由于吐丝多，丝的质量好，更受蚕农青睐，但在幼蚕阶段，雌雄不易区分。于是，科学家采用下图所示的方法培育出了“限性斑纹雌蚕”来解决这个问题。请回答：
（1）家蚕的一个染色体组含有 条染色体。
（2）图中变异家蚕的“变异类型”属于染色体变异中的 。由变异家蚕培育出限性斑纹雌蚕所采用的育种方法是 。图中的限性斑纹雌蚕的基因型为 。
（3）在生产中，可利用限性斑纹雌蚕和无斑纹雄蚕培育出根据体色辨别幼蚕性别的后代。请用遗传图解和适当的文字，描述选育雄蚕的过程。
【解析】（1）家蚕是二倍体生物，其体细胞含56条染色体的二倍体生物，其生殖细胞含有28条染色体，因此一个染色体组有28条染色体。（2）由图可知，该家蚕的变异属于非同源染色体之间的易位，应属于染色体结构变异。由变异家蚕培育出限性斑纹雌蚕所采用的育种方法为杂交育种。限性斑纹雌蚕的Ⅱ号染色体有2个a基因，W性染色体上有1个A基因，故基因型为aaZWA。（3）用限性斑纹雌蚕和无斑纹雄蚕杂交，其后代中无斑纹的都是雄蚕，有斑纹的都是雌蚕。
【答案】（1）28 （2）结构变异 杂交育种 aaZWA （3）如图所示
（文字说明：后代中有斑纹的均为雌蚕，应淘汰；无斑纹的均为雄蚕，应该保留）
【应对策略】不同的育种方法所依据的原理不同，其适用的条件会有一定的差别。解答此类试题时，一定要认真审题，明确试题要求，结合各种育种方法的特点及其适用条件进行合理选择。如：
（1）集中不同亲本的优良性状选用杂交育种，集中优良性状且缩短育种年限选用单倍体育种。
（2）获得较大果实或大型植株或提高营养物质含量选用多倍体育种。
（3）提高变异频率，改良或直接改变现有性状，获得当前不存在的基因（性状）选择诱变育种。
（4）实现定向改变现有性状选用基因工程育种。
三、规范审题，精准解答育种类试题
例4 假设A、b代表玉米的优良基因，这两种基因是自由组合的。现有AABB，aabb两个品种，为培育出优良品种Aabb，可采用的方法如图所示。有关叙述不正确的是（ ）
A.由品种AABB、aabb经过①、②、③过程培育出新品种的育种方式称为杂交育种
B.基因型为Aabb的植株经过过程③，子代中AAbb与aabb的数量比是1：1
C.与过程“①②③”的育种方法相比，过程⑤⑥的优势是明显缩短了育种年限
D.过程④在完成目的基因和运载体结合时，必须用到的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶和运载体
【解析】首先规范审题，审出关键词或关键语句。如本题题干中包含如下信息：两种基因遗传遵循自由组合定律；将不同品种优良性状集中到一个个体上，应用杂交手段，育种方式为杂交育种（①②③过程）；⑤⑥利用花粉培育新品种，为单倍体育种；利用物理因素获取新品种（⑦过程）为诱变育种；利用转基因技术获取新品种（④过程）为基因工程育种。
依据审出的信息，作出精准判断。选项A，对杂交育种本质不理解会错选A项。选项B，题干确定亲本基因型为Aabb，其自交（③过程）的后代基因型及比例为AAbb∶Aabb∶aabb=1∶2∶1，即AAbb∶aabb=1∶1。选项C，该选项是“⑤⑥”单倍体育种与“①②③”杂交育种相比较，单倍体育种大大缩短了育种年限，若不了解单倍体育种的优势会错选C项。选项D，运载体不是酶，而是一种运输工具，所以D选项叙述错误。
