大一学习计划书范文
前言：我们精心挑选了数篇优质大一学习计划书文章，供您阅读参考。期待这些文章能为您带来启发，助您在写作的道路上更上一层楼。
第1篇
为学生提供多元智能的学习，相信每个人的能力是多样化及可以培养的，通过形式多样的音乐技能学习，使学生的各方面智能得以发展。在学习过程中他们可以体会欣赏与合作的乐趣，学生的耐力、专注和毅力也能逐步确立，情绪发展也能更均衡及健康。
声乐班以提高学生的音乐综合素质与兴趣为目的，通过形象生动的教学形式，使学员了解歌唱基本原理，掌握一定的音乐基础知识和歌唱的基本技能，激发学员热爱音乐艺术，培养学员正确的审美意识与积极、健康、活泼、向上的审美情趣。教学内容包括基本歌唱发声技巧、视唱练耳、基本乐理、歌唱表演，歌唱姿态与舞台风度。
二、 辅导方法：
统一视唱练耳练习：每周一中午12点40，教学楼108教室，由王老师统一带领练习；或由器乐组同学帮助在饭堂三楼琴房练习。
声乐组成员自主练习时间：每周2晚7点在饭堂三楼琴房（成员也可以根据自己的实际情况在课外活动时间练习）。
训练统一发音位置，练习合理呼吸，咬字吐字清晰，声音独立稳定。练习曲以简到难，有小到大，循序渐进。
三、小组成员的考核：
按小组成员在活动中出勤，练习时的态度，按成绩等级进行综合评价，把考核分等记入音乐活动小组的考核记录表。
第2篇
憧憬大学，我们来到了大学，转眼间，大学的时光将过四分之一，回想入学之初，再自省现在的自己，又有何感慨呢
现在你还为你的大学学习没有方向感到茫然么？你为你的大学学习没有动力感到无助么？你担心过你的学习会挂科么？你害怕你的学位证拿不到么？不必茫然，不必无助，不必担心，不必害怕。在大学的校园里，我们可以做主，我们可以为我们的学习负责。我向全体同学倡议，把握时间，自主学习。
首先，先分析下现在大学生自主学习的状况，请允许我指出不足，也许这些缺点会在你的身上正在发扬哦。目前，我国高校大学生自主性学习能力总体上是比较强的，但是也存在一些问题，主要表现在以下几个方面：一是学习目的
不明确学习态度不认真；二是慵懒、闲散的生活状态是缺乏进取心、畏难情绪严重；四是环境适应能力不强；五是一些大学生沉溺于网络不能自拔。静下心来分析下原因，主要有以下几方面，一是学生缺乏自主学习的动力；二是缺少本专业的学习兴趣；是专业实践动手能力和参与科研能力不强。四是目标不明确，没有社会压力和时代紧迫感。基于此，提出以下几点建议：
1.立志----坚信自己一定能行，有毅力攻克学习苦难，不甘于平庸。在此提出的“立志”问题。“立志”不仅是有志向、有理想，更具有为高尚的志向、理想而奋斗的毅力和决心。这种意志和决心是自主学习的源动力，它是解决“为什么要学习”、“为什么而学习”、“变要我学为我要学”这样一个根本问题。自主学习有没有这种源动力，效果截然不同。
2.知止----确定学习目标，立志自主学习。
因材施教，培养自学能力。志向解决了自主学习的动力问题，知止是解决自主学习的目标问题。一个自主学习者深有体会的说：“一个想自主学习但学无目标的人，也是不可能学得好”，“学习态度决定你学不学”，“学习目标指明你的学习方向。。确立适当的学习目标是自主学习的重要前提。
3.亲知----实践与课本结合，培养实践思维能力。从实践中获取知识，从实践中获取知识，强调将学习知识、融汇知识、实践知识有机地结合，进而形成实践思维，也就是将学习过程当做一种刨造性劳动的过程，实践学习是自主学习的最高境界。
4.乐学----提高学习兴趣，养成自主学习习惯。高远的学习志向和明确的学习目标解决了学习的方向和目的。自主学习者还必须有正确的学习态度和乐学精神。自主学习者仅仅有了正确的学习态度是不够的，还必须有强烈的求知欲望、好学、乐学，否则，请相信，时间将会让你无力进步。
第3篇
一 指导思想及目标
我们学生会的就是为大家提供服务的，为了更好的服务于每一位同学，为了更好的完成办公室的每一项任务，为了让自己的大学生活过得更充实更加有意义，为了以后更好的服务社会，为了适应这个充满竞争的社会，我将践行“争取想做的，做到该做的，做好在做的”这一座右铭，对自己严格要求，认认真真，踏踏实实的完成领导交给的每一项任务。经过接下来的努力学习及工作生活总结，努力使自己成为一名优秀的学生会办公室委员。
二 主要工作任务
1、对每周一次的例会做好通知、记录，做好上传下达的工作，并且落实例会的决定
2、多学、多看、多思，多悟，在例会中有不懂的地方，及时请教主任和同事。
3、在课余时间，积极主动地到办公室，辅助老师的工作，做一些力所能及的事情，认真履行自己的职责。
4、 协助各部门开展工作，协调部门之间的关系。
5、定期了解各部门工作进程，期末交学生会主席团，由此形成学生会工作总结，并以此作为部门考核内容之一。
6、负责文件处理。接收、传阅、督办上级团，学习组织文件、外来信函材料等;起草、印发学生会文件、总结汇报材料和对外信函等;做好文件管理、档案(含电子档案)和信息工作，对档案资料等文件，做到不遗失，查阅方便、迅速。
7、认真完成主席团交给的其它工作任务。
8、对办公室的重新布置与美化，处理办公室日常事务。
9、及时申请系团委学生会的办公用品，并且在最短时间内发放到各部。
10、对每次活动进行考勤，建立起一套完整的档案管理机制，建立起每个学生会部门、每个干事的考勤档案制度，确保学生会的各项评优、评奖活动有据可依。
11、对系团委学生会内部成员的档案管理将进行调整。
12、收集各部门的工作计划与工作总结，交于团委老师，审查后存档。
13、妥善保管好各部门、各项活动的计划、总结以及相关系团委学生会的所有资料，做好期末存档工作。
14、做好学生会各项活动的记录。
三常规工作
1：在工作的过程中，在做好我们的基本职能的前提下，我们应该更坚守我们的原则，规范自身，以身作则，认真的对待工作，我们需要加强仔细程度，及时上传下达，将信息传递给每个人，这是我们的工作与责任。
2：在办公室举行的活动中，我们需要具体动作创新，在保持传统活动精神的前提下，对活动的内容、形式、运作要有所创新，有所突破，很多活动如果再这样发展下去将毫无生命力，每个活动都包括前、中、后三个阶段：前期活动的策划;中期活动的举行，后期活动的总结。在活动前期一定要认真的做好详细的活动调查，调查对象主要包括校内大学生、学校党政机关和校外社会企业，并对活动的可行性进行评估分析。抓好活动精髓，提高活动立意，在我们本着为同学们创造学习环境、建设锻炼平台，提供表现机会的同时，更有必要在活动精髓及活动立意深思熟虑。要真正做到举办活动有意义，有收获，体现广大学生的需求，实实在在的为同学们提供服务，体现活动真正的价值，总而言之，价值体现在需求。整合现有资源的同时，可以根据实际情况，扩大活动规模，提高活动的意义。
四、学习管理理念
1、社会高速发展，为了赶上发展，学校管理制度也在迅速发展。所以作为系学生会咽喉部门的办公室会本着“一切服务于学生”为宗旨，做到快速的服务，确保学生工作的顺利进行。
2、“友情是人生的一次宝贵的财富”它将使我们的工作更加顺利，使我们之间更加团结和统一。
以上是我在新学期办公室的工作计划，如有不当，望谅解。
第4篇
关键词：益气活血药；毛细血管密度；周细胞计数；心肌梗死；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.07.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）07-0038-05
Change of Capillary Pericapillary Cells in Rats with Myocardial Infarction and Effect of Supplementing Qi and Activating Blood Circulation Herbs HUANG Kun， YANG Dan-dan， GUO Shu-wen， SUN Qing， ZHANG Lu， QI Xin， WAN Ting， ZHENG Cheng-long （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029 ， China）
Abstract：Objective To observe the change of capillary pericapillary cells in rats with myocardial infarction and the influence of supplementing qi and activating blood circulation herbs， and explore its mechanism of improving myocardial perfusion. Methods The rat model was established by ligaturing the left anterior descending coronary artery. On the base of ECG evaluation， successfully modeled rats were randomly divided into the model group， group treated with supplementing qi and activating blood circulation Chinese medicine （activating blood and supplementing qi group）， group treated with Perindopril （Perindopril group）， group treated with Tongxinluo Capsules （Tongxinluo group）. The sham-operation group was taken as the control. There were totally 5 groups. The model group and the sham-operation group were treated with normal saline. The changes of myocardial capillary density （MCD） and number of pericapillary cells on the 7th， 28th day after medicinal administration were observed. Results On the 7th and 28th day， the MCD decreased significantly and the number of capillary pericapillary cells increased significantly in the model group compared with the sham-operation group （P
Key words：supplementing qi and activating blood circulation herbs；myocardial capillary density；number of pericapillary cells；myocardial infarction；rats
研究显示，心肌梗死患者虽然经过搭桥或支架置入术后使梗死相关冠脉再通，或经冠脉造影证实已达TMI3级血流的梗
基金项目：国家自然科学基金（81173142）
通讯作者：郭书文，E-mail：
死相关血管，有超过25%的患者心肌组织水平的血流灌注并未恢复[1]。因此，减少缺血心肌再灌注损伤、保持心肌微血管的完整性、改善缺血心肌血供状态、恢复心肌细胞功能，是目前研究的热点问题。
前期的系列研究结果显示，益气活血方能明显促进大鼠缺血心肌微血管生成而改善心肌缺血，并能抑制心肌细胞凋亡，对相关蛋白及细胞因子有显著调节作用[2-4]。本研究采用结扎冠状动脉的方法建立大鼠急性心肌梗死后心衰模型，利用免疫组织化学方法观察模型大鼠心肌毛细血管周细胞的变化，以及益气活血中药对其的影响，进一步探讨益气活血中药改善心肌血流灌注的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，清洁级，8周龄，中国科学院动物研究所提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001。
1.2 药物
益气活血药由黄芪、人参、当归、川芎、三七粉等组成。根据前期研究结果[5-6]选择益气活血药（2∶1）的剂量组合[5-6]。依口服剂工艺制备，按处方比例称取中药材，加9倍量水，煎煮2次，每次2.5 h，共5 h，水煎液过滤，浓缩，加乙醇调含醇量至50%，过滤，回收乙醇，过滤，调整浓度为相当原药材2 g/mL，北京中医药大学药厂提供。
对照药物选用通心络胶囊，石家庄以岭药业股份有限公司生产，批号110723-120116；培哚普利片，施维雅（天津）制药有限公司，批号P2009971052951。
1.3 试剂与仪器
BA3414 兔抗鼠CD34抗体（武汉博士德生物工程有限公司产品），BM0002小鼠抗α-SMA抗体（武汉博士德生物工程有限公司产品），血清内皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO），南京建成生物工程公司提供。RSP1002型小动物呼吸机（Kent Scientific Corporation）。
2 实验方法
2.1 造模
采用左冠状动脉前降支结扎方法[7]。用1%戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后，背位固定，行气管插管，连接小动物呼吸机，在左侧第3、4肋间切开皮肤，钝性分离肌层，打开胸腔，用开胸器推开胸腺扩大手术视野，充分暴露心脏，用带线缝合针在左心耳与肺动脉圆锥之间于左心耳下约2 mm处，无张力的状态下将左前降支连同少量的心肌组织一起结扎，然后迅速将心脏复位，关闭胸腔。全部手术过程在30 min内完成，严格无菌操作。术后连续3 d肌肉注射青霉素预防感染。以结扎部位以下心肌变灰白、搏动减弱、心电图肢体导联出现ST段弓背向上明显抬高为造模成功的标志。假手术组手术过程相同，仅绕过左冠状动脉，打松结。
2.2 分组与给药
将大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、中药组、培哚普利组、通心络组。
各组于造模的第1日开始分别灌胃相应药物，每日1次。通心络组每日给予通心络胶囊30 mg/kg体质量，培哚普利组每日给予培哚普利片0.72 mg/kg体质量，益气活血组每日给予益气活血中药21 g/kg体质量[5-6]。各干预药物均溶于无菌蒸馏水中，在保证药物剂量的前提下，调整浓度使每只动物给药容积均为10 mL/（kg・d）。假手术组和模型组每日以相同容积无菌蒸馏水灌胃。连续灌胃28 d。
2.3 标本采集
称取大鼠体质量，用1%戊巴比妥钠麻醉，剪开腹腔，从腹主动脉取血，分离出血清待测。然后剪断肋骨和胸肌，暴露胸腔取出心脏，用生理盐水洗去血污，剔除血管、脂肪等非心肌组织，从左心室最大横径处切开，将切好的下半部分心脏放入预先准备的4%多聚甲醛液中固定备用，进行常规组织学方法处理，制作石蜡切片。据各组大鼠在实验过程中的成活数量分别观察第7、28日2个时间点指标的变化情况。
2.4 心肌病理形态学观察
将心肌组织用不同浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋、切片，脱腊，二甲苯透明，HE常规染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固，光学显微镜观察。
2.5 心肌毛细血管密度
石蜡切片脱蜡至水；3%过氧化氢室温孵育8 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗3次（每次2 min），电炉加热沸腾后断电，间隔7 min，反复2次，冷却后PBS（pH 7.2～7.6）洗涤2次，滴加5%牛血清白蛋白封闭液，室温20 min，甩去多余液体，滴加CD34一抗（浓度为1∶100），4 ℃过夜，第2日早晨滴加生物素山羊抗小鼠IgG，室温20 min，PBS洗3次（每次2 min），滴加SABC，室温20 min，PBS洗4次（每次5 min），DAB显色，取1 mL蒸馏水，A、B、C试剂各加1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制时间，蒸馏水冲洗，苏木素轻度复染，1～2 s即可，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
2.6 免疫组化染色法检测周细胞
石蜡包埋，切片（厚度4 ?m，每只鼠各取3张切片），脱蜡，高温高压抗原修复，喷气后计时2 min，自然冷却，水洗。4 ℃下于1∶300 α-SMA单克隆抗体孵育24 h，每张切片滴加50 ?L EnVisionTM试剂，室温下孵育30 min。滴加新鲜配制的显色剂（DAB），苏木素复染。显微镜下观察，胞浆显棕黄色者为阳性细胞。按下法计数：先在100×视野下随机选择血管密度高的5个区和血管密度低的5个区作为计数部位，后在400×视野下计数微血管旁胞质出现棕黄色颗粒的周细胞数，每只大鼠计数20个视野，最后以平均每个视野（400×）的周细胞数表示。小动脉平滑肌细胞亦为α-SMA阳性表达，根据血管壁厚度及结构可与周细胞相区别，此类阳性细胞不在计数范围内。
2.7 血清内皮素-1、一氧化氮测定
采用双抗体夹心ELISA法测定各组大鼠血清ET-1、NO的变化，具体方法严格按试剂盒说明操作。根据各组大鼠在实验过程中的成活数量分别观察第7、28日2个时间点指标的变化情况。
3 统计学方法
用SPSS16.0统计软件进行分析。一般资料采用描述性分析，计量资料以―x±s表示，计数资料以频数及百分数描述；多个样本计数资料用χ2检验，计量资料符合正态性分布采用t检验，如不符合正态性分布采用非参数检验，比较各项指标在治疗前后之间的差异，多组间差异性统计采用方差分析，若方差不齐，则用Games-Howell分析，双侧检验。P
4 结果
4.1 模型建立情况
采用冠状动脉结扎法致大鼠急性心肌梗死后，肢导Ⅱ导联心电图ST段呈弓背向上抬高，缺血心肌很快变苍白色。共手术100只，造模成功81只，死亡19只，其中手术中死亡8只，急性心肌梗死造模成功后24 h内死亡3只，给予药物治疗后死亡3只，注射麻药后行心脏超声检查后死亡5只，死亡原因为呼吸停止、室颤和大出血，造模成功率81.0%。第7日观察大鼠42只，第28日观察大鼠39只。
4.2 各组大鼠心肌形态学观察
第7日：假手术组大鼠心外膜未见纤维素渗出及未见炎细胞浸润；模型组心肌梗死区炎症反应明显，有泡沫状组织细胞聚集，大量中性粒细胞浸润，心肌纤维断裂、排列紊乱，坏死的心肌组织由新生的肉芽组织取代；梗死区边缘有充血、出血及炎细胞带，心外膜有炎性及纤维素性渗出物。培哚普利组病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小。通心络组病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小，较培哚普利组病变范围小。益气活血组病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小，较培哚普利组及通心络组病变范围较小。见图1。
第28日：假手术组大鼠心外膜未见纤维素渗出及未见炎细胞浸润。模型组大鼠心肌梗死区由纤维母细胞、纤维细胞及致密的胶原纤维束组成，呈束状或平行排列，胶原纤维束之间有极少残存的心肌组织，炎性细胞浸润明显减少，地图状瘢痕组织形成；心室腔扩大，室壁变薄。培哚普利组大鼠病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小，且梗死区有岛状或细带状的心肌组织。通心络组大鼠病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小，且梗死区有岛状或细带状的心肌组织，但较培哚普利组病变范围大。益气活血组大鼠病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小，且梗死区有岛状或细带状的心肌组织，但较培哚普利组病变范围大。见图2。
假手术组 模型组
益气活血组 培哚普利组 通心络组
图1 第7日HE染色大鼠心肌病理形态（×50）
假手术组 模型组
益气活血组 培哚普利组 通心络组
图2 第28日HE染色大鼠心肌病理形态（×100）
4.3 益气活血中药对心肌梗死大鼠血清内皮素-1、一氧化氮水平的影响
与假手术组比较，模型组大鼠血清ET-1含量明显升高，NO水平下降（P
表1 各组大鼠血清ET-1、NO水平比较（―x±s，pg/mL）
组别 术后第7日 术后第28日
只数 ET1 NO 只数 ET1 NO
假手术组 10 5.37±1.06 31.12±2.57 9 6.38±1.73 30.38±4.00
模型组 7 13.67±1.68## 19.41±3.24## 7 14.60±2.38## 16.23±3.05##
益气活血组 9 8.06±1.21** 41.71±4.43** 8 8.97±1.07** 40.11±5.51**
培哚普利组 8 10.65±1.12** 33.02±2.68** 8 7.30±1.37** 45.26±6.60**
通心络组 8 9.87±0.73** 37.76±3.34** 7 9.57±1.57** 35.06±5.20**
注：与假手术组比较，##P
4.4 益气活血中药对心肌梗死大鼠毛细血管密度的影响
在病理图像分析系统下测定各组大鼠心肌梗死边缘区平均毛细血管密度（MCD）。第7日：模型组较假手术组心肌梗死边缘区MCD明显降低（P
表2 各组大鼠心肌MCD比较（―x±s）
组别 n 第7日 第28日
假手术组 20 612.79±33.35 611.11±25.67
模型组 20 533.67±20.27## 493.27±19.38##
益气活血组 20 1178.50±33.27** 1051.30±30.12**
培哚普利组 20 1010.10±33.27** 1099.30±33.98**
通心络组 20 1094.30±33.12** 974.75±35.41**
4.5 益气活血中药对心肌梗死大鼠毛细血管周细胞计数影响
第7日：模型组较假手术组心肌梗死边缘区周细胞计数明显增加，益气活血中药组、培哚普利组、通心络组与模型组比较，梗死边缘区的周细胞计数减少（P
表3 各组大鼠心肌周细胞计数比较（―x±s，个）
组别 n 第7日 第28日
假手术组 20 0.8±0.84 1.2±0.84
模型组 20 8.2±1.30## 14.0±1.58##
益气活血组 20 4.2±0.84* 4.4±1.14**
培哚普利组 20 5.8±0.84** 3.6±1.14**
通心络组 20 4.4±0.55** 5.8±1.30**
注：与益气活血组比较，P
P
5 讨论
临床研究表明，急性心肌梗死患者多存在“气虚血瘀”的中医病理[8]。实验的中药组方中，生晒参、黄芪大补元气、广益五脏，针对气虚的主要病机；三七、川芎、当归为臣，活血通络、止血消瘀。诸药相合，气行则血行，血行则气实，诸药合用，标本兼治，相得益彰，共奏益气活血、化瘀通络之功效。
冠脉微血管结构完整性与功能正常，是确保心肌收缩力储备和局部功能恢复的先决条件，是心肌存活的必备条件，当发生微小动脉和阻力血管的功能及结构变化时，冠脉血流速率和血流储备的变化可引起心肌缺血。低灌注梗死区和正常心肌之间的慢复流区域毛细血管内皮肿胀、突出甚至脱落，受周边的坏死组织压迫，毛细血管内皮细胞功能和结构完整性受损，心肌毛细血管周细胞功能失调。血管壁在结构上由血管内皮细胞和血管周围细胞组成，它们分别构成血管的内外壁。周细胞又叫壁细胞，可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、软骨细胞、平滑肌细胞等，具有收缩能力，从而调节微循环的灌流量和通透性[9-10]。
有研究显示，早期心肌缺血缺氧性坏死中周细胞数量在4 h后明显增多，12 h后开始下降，48 h后显著低于正常水平，推测周细胞作为心肌中的间质细胞可能是心肌纤维化发生发展中的主要效应细胞[11]。本实验结果表明，使用益气活血中药后，毛细血管周细胞的计数减少，与模型组比较差异有统计学意义（P
本实验结果显示，益气活血组较模型组心肌梗死边缘区域MCD明显增加，可见周细胞对毛细血管生长起到调控的作用。研究发现新生血管的生长和维持主要由周细胞的募集和分化所推动[12-13]。周细胞募集并伴随发生基底膜重塑[14-15]。可见，周细胞的募集对血管新生是必不可少的。
此外，益气活血中药可提升内皮分泌NO水平，并相应降低ET-1水平。NO和ET-1是由血管内皮细胞分泌的一对作用相反的血管活性分子，NO的含量与生物活性的变化能够反映内皮功能的状态。与益气活血组模型组比较，ET-1下降，NO升高，说明益气活血中药具有保护血管内皮功能的作用。
总之，益气活血中药可以通过降低心肌梗死大鼠毛细血管周细胞计数，维持血管的相对完整性，改善局部微循环的血流，减少梗死面积，并促进血管新生，调节NO/ET-1的平衡，从而达到改善局部心肌血供的目的。
参考文献：
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第5篇
西安交通大学与香港科技大学基于共同的战略审视、共同发展需求，怀着“教育兴国、科教强国”的使命感，以服务国家经济社会发展为目标，瞄准国家和陕西的长远需求，着眼于可持续发展的新趋势，一致同意建立全面、长期的战略合作伙伴关系，直接引进香港科大的课程体系、教材和教学方法等优势资源，以联合共建“可持续发展学院”为载体，建立政、产、学、研协同创新机制，在人才培养、知识创新和提升产业技术水平等方面开展广泛深入合作。
郝平感谢陕西省委、省政府对高等教育的重视和支持。他说，香港科技大学是短时间内成为世界一流大学的成功典范，为经济社会发展培养了众多优秀人才；西安交通大学历史悠久，特别是改革开放以来取得了突飞猛进的发展，正在向世界一流大学迈进。两校战略合作协议的签署，实现了强强合作，必将在深入实施西部大开发战略进程中有更大作为。这种联合办学模式，也为全国高校开展对外交流合作提供了样板、作出了榜样。
孙清云代表省委、省政府对两校签署合作协议表示祝贺。他说，高等学校是科技第一生产力和人才第一资源的重要结合点，担负着人才培养、科学研究、服务社会、文化传承创新等重大使命。随着科技进步、经济社会发展，各高校特别是著名大学都在探索创新之路。正是在这个大背景下，西安交通大学与香港科技大学启动实质性合作，突破传统意义的学科界限，围绕国家和区域经济社会发展需求，进行高素质人才培养。这种合作办学模式，不仅有利于两校优势资源的共建共享，增强核心竞争力，提升办学水平，也为陕西高等教育发展提供了有益经验，更为陕西经济社会发展注入了新活力。
孙清云指出，陕西高等教育实力雄厚，省委、省政府一贯重视高等教育的发展，支持高校扩大对外开放，开展合作办学，提升国际化水平。我们将全力支持两校合作，也希望两校瞄准国家战略需求，紧贴区域发展需要，共同办好“可持续发展学院”。
第6篇
【关键词】 川芎嗪注射液;黏附分子;信号转导;血管平滑肌细胞
【Abstract】 Objective To investigate the Tetramethylpyrazine (TMP)mediating antiproliferation effect，and define its molecular mechanism in cultured rat aortic vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Cultured cells proliferating model of rats VSMC were established by plateletderived growth factor (PDGF). Cultured cells were randomly pided into three groups: control， PDGF (20 ng/ml)and TMP treatment (20， 40， 80 μmol/L) groups. The number of VSMC were accounted under microscope. The expression of intercellular adhesion molecular1 (ICAM1) and integrinlinked kinase (ILK) were analyzed by Western blotting respectively. Results The proliferation of rat VSMC induced by PDGF could be inhibited by TMP significantly in a dosedependent manner. A remarkable decrease of ICAM1 and ILK expression were demonstrated in the TMP group compared with the PDGF group.Conclusions The antiproliferation effect of TMP associates with suppression of adhesive molecules.
【Key words】 TMP;Adhesive molecules;Signal transduction;Vascular smooth muscle cells (VSMC);Rat
川芎嗪是从具有活血化瘀作用的中药川芎中分离得到的一种生物碱，化学组分为四甲基吡嗪，目前已在临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗。我们前期研究证明，川芎嗪通过作用于血管平滑肌细胞(VSMC)而发挥活血化瘀的作用〔1〕，但缺乏在分子水平上阐明其机制的研究。细胞间黏附分子(ICAM)是一类介导细胞与细胞间或细胞与细胞外基质间相互作用的膜表面糖蛋白，在单核细胞及血小板的黏附聚集过程中发挥着重要的作用，与细胞增殖密切相关〔2〕。本研究用血小板源性生长因子(PDGF)刺激体外培养的大鼠VSMC复制细胞异常增殖模型，从抑制黏附分子信号传递角度探讨川芎嗪抗VSMC增殖的机制，为从分子水平上阐明其活血化瘀作用机制提供实验依据，明确其作用靶点。
1 材料与方法
1.1 材料 健康雄性5周龄SD大鼠，体重(100±10)g，由河北省实验动物中心提供。川芎嗪注射液 (40 mg/2 ml)由北京第四制药厂提供。DMEM培养基、胎牛血清FBS由Gibco公司提供。PDGF、小鼠抗ICAM1单克隆抗体、小鼠抗整合素耦联激酶(ILK)单克隆抗体、兔抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗、发光试剂等均购自美国Santa Cruz公司。其他化学试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 VSMC的培养 5周龄雄性SD大鼠用25%乌拉坦按照0.4 ml/100 g体重进行腹腔注射麻醉，于无菌条件下取大鼠的胸腹主动脉。用0.01 mol/L PBS洗净管腔内血液并剥脱血管外膜后，按贴块法分离培养VSMC。待细胞爬满培养瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，用光镜及免疫组化的方法进行细胞鉴定。取3～6代细胞进行实验。
1.3 细胞分组 取传代培养的VSMC接种于细胞培养瓶中。待VSMC在含10%胎牛血清的DMEM培养液中生长至60%～70%融合时，换无血清培养基饥饿培养24 h，使细胞同步化于静止期。实验随机分为对照组、PDGF刺激组和川芎嗪组。对照组单纯加入培养液5 ml;PDGF刺激组添加PDGF使其终浓度为20 ng/ml;川芎嗪组先用不同浓度 (20、40、80 μmol/L) 的川芎嗪注射液预孵育1 h，然后再加PDGF(20 ng/ml) 刺激24 h。收集各组细胞进行实验。
1.4 Western印迹分析 提取各组细胞的蛋白，用改良的Lowry法测定浓度。取各组等量蛋白提取液经8% SDSPAGE电泳分离后，半干式电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，分别与鼠抗ICAM1单克隆抗体 (1∶300)、ILK单克隆抗体(1∶400) 在4℃条件下封闭反应过夜。用HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶10 000) 室温反应2 h，经TTBS、TBS充分洗涤后采用化学发光法显影。用美国Kodark公司ID数码成像分析系统分析结果。
1.5 统计学处理 采用SPSS10.0 统计软件包处理，数据以x±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，组间均数比较采用t检验。
2 结 果
2.1 川芎嗪呈剂量依赖性抑制VSMC的增殖 细胞计数后发现，与对照组比较，PDGF刺激组细胞数量显著增多，增加约3.8倍。20 μmol/L川芎嗪实验组对细胞数目增加的抑制作用不明显，40 μmol/L川芎嗪组具有抑制细胞数量的作用，此时细胞数量约为PDGF刺激组的48%(P
2.2 川芎嗪抑制ICAM1的表达 Western印迹结果经过灰度值对比处理后发现，正常对照组ICAM1的灰度值表达量很小，PDGF刺激组ICAM1的表达量显著增加。川芎嗪组ICAM1的表达量与刺激组相比明显减少，仅相当于其的44%(P
2.3 川芎嗪抑制ILK的表达 Western印迹结果显示，对照组仅有少量ILK表达;PDGF刺激组ILK的表达量明显增加。川芎嗪组ILK的表达量虽然仍旧比对照组多，但与PDGF刺激组相比降低明显，仅相当于其62%(P
3 讨 论
川芎嗪是伞形科植物川芎的主要成分，具有活血化瘀的作用，因可与其他中药组成方剂，故广泛应用于心脑血管疾病的救治。大量研究表明川芎嗪可抑制VSMC的异常增殖，但对其确切的分子机制目前尚不很清楚。现已明确，动脉粥样硬化等血管增殖性疾病的主要病变特征是血管平滑肌细胞向内膜下迁移与增殖、血小板的黏附聚集、单核/巨噬细胞浸润等，黏附分子及其受体的相互作用是引发这一系列慢性炎症过程的主要生物学机制。因此，如何抑制黏附分子的表达或阻断其功能已经成为研制抗血管增殖性疾病的新靶标〔3〕。
单核细胞在血管内皮黏附并向内皮下迁移和泡沫化被认为是动脉粥样硬化的早期病理过程。ICAM1是单链跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，分子量为80～110 kD，其受体为整合素家族的黏附分子白细胞功能相关抗原1(LFA1)。已经发现ICAM1/LFA1的相互作用在淋巴细胞与内皮细胞的相互作用、淋巴细胞介导的细胞毒反应过程中具有至关重要的作用〔4〕。ICAM1可分布于白细胞、内皮细胞、平滑肌细胞及某些肿瘤细胞上，正常情况下很少或不表达，在炎症、内皮损伤等病理生理条件下表达增加，从而促进炎症的发生与发展〔5〕。所以阻断黏附分子的作用可能会抑制细胞的迁移与增殖。本研究结果显示，对照组ICAM1很少表达，这可能是由于此时 VSMC 正处于分化状态不具有增殖活性，PDGF刺激组由于细胞异常增生活跃，故 ICAM1 的表达量明显增多，川芎嗪组 ICAM1 的表达量与比PDGF刺激组相比显著减少，提示川芎嗪可能通过抑制ICAM1的表达而发挥抗VSMC增殖的作用。
ILK是1996年Hannigan等〔6〕用酵母双杂交的方法研究整合素β1结合蛋白的过程中被发现的。它具有Ser/Thr蛋白激酶结构，是一个59 kD的细胞内信号蛋白，广泛分布于多种细胞中，对黏附分子信号跨膜转导至细胞内起者关键性的介导作用。ILK可以与整合素β1、β2、β3亚基胞浆区域及细胞骨架相关蛋白结合，以依赖于PI3K的方式被激活。活化后的ILK可以磷酸化蛋白激酶B (PKB) 的Ser473和糖原合成酶激酶3 (GSK3)，进而发挥生物学效应。ILK在调节细胞黏附与生长、肿瘤形成等过程中均起重要作用，是保证黏附信号进一步向下游传递的重要调节分子。为了探讨川芎嗪抑制ICAM1表达的生物学意义，本研究进一步观察了ILK在增殖细胞中的表达变化。Western印迹结果显示，作为黏附分子信号传递关键性调节激酶的ILK在各个实验组中的变化趋势与ICAM1的改变基本相同。以上结果提示，川芎嗪可能通过下调ILK的表达得以阻断细胞黏附与迁移的信号在VSMC内的传递;通过减少ICAM1的表达减弱炎细胞的黏附与聚集，从而削弱局部的炎症反应，起到抑制细胞异常增殖的作用。
总之，本研究结果提示川芎嗪可逆转由PDGF刺激导致的VSMC异常增殖，其分子机制与阻断黏附分子信号传递、抑制黏附分子表达有关。由于中药具有多层次多靶点作用的特点，川芎嗪是否还通过其他途径抑制VSMC异常增殖还需做进一步的探讨。
参考文献
1 狄柯坪，常立功.川芎嗪对家兔肠系膜微血管运动的作用机理与一氧化氮的关系〔J〕.中成药，2003;25(1)：4951.
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3 Shimizu N，Suzuki H， Wakabayashi K，et al.Expression of intercellular adhesion molecule1 and vascular cell adhesion molecule1 in the pig coronary artery injury model：comparison of plain old balloon angioplasty and stent implantation〔J〕.J Cardiol，2004;43(3)：1319.
4 Smith LA，Helim AE.Interplay between shear stress and adhesion on neutrophil locomotion〔J〕.Biophys J，2007;92(2)：63240.
第7篇
关键词：求美；文化艺术活动教育；原则；内容
中图分类号：G64文献标识码：A文章编号：1003-949X(2008)-12-0077-02
“求美”是大学教育的重要功能。文化、艺术的教育是培养高品位、高素质人才的必要内容。只有学会欣赏美，才能创造美。先生在北大初建时期就十分重视在大学教育中提倡“求美”，他主张“美育与智育相辅而成，知识以外兼美感情，以图德育之完成。”活动教育作为学生自由发展的载体、经验积累的途径能够提升学校文化、丰富学校生活、增强学校活力，为学生的自由全面发展提供平台。
一、“求美”文化艺术活动教育的概念
“求美”文化艺术活动教育是指通过体验、养成、熏陶，使人文艺术知识内化为大学生的人文精神和艺术素养的教育过程。“求美”文化艺术活动教育旨在培养学生人文精神、审美能力和“求美”品格。“求美”文化艺术活动教育坚持为人民服务、为社会主义服务，坚持百家争鸣、百花齐放，坚持面向现代化、面向世界、面向未来的原则，对文化艺术活动教育内容进行了有针对性、有选择的取舍，努力做到雅俗共赏、健康向上。
“求美”文化艺术活动是大学校园文化的核心内容。大学校园文化历来被看作社会文化发展的潮头和先导，它相对于一般社会文化具有先进性和超前性，对社会文化发展负有选择与创造的责任。如今，随着校园对外开放的程度日益扩大，社会上的各种文化观念、行为准则、生产方式也开始跻身校园。多元娱乐活动和生活方式的出现，对学术、理性、审美等具有品味的校园文化冲击极大。高校面临着用高雅健康的文化艺术活动占领校园文化阵地，用积极向上的内容和形式陶冶大学生思想情操的考验。
二、“求美”文化艺术活动教育的意义
1.文化艺术活动教育有利于大学生知识结构的完善
新时期，社会需要高等学校教育培养出集科学素养、人文素养、艺术素养于一身的高素质人才。过去，高校普遍重视为大学生提供专业教育，对其他的领域有所淡化或忽视，致使大学生在知识结构的构成上，更多的是专业性和专门化的知识体系，其思考和认识的视野比较狭窄。专业知识的教育只形成了大学生知识结构的一个部分，要形成完善的知识结构就必须有相对的辅助知识作为支撑。“求美”文化艺术活动教育能有效的促进科学与人文的交融，通过科学与人文“两种文化”间的深刻对话，使他们在获得知识的基础上，形成深厚的文化底蕴，达到沟通、整合的目的，使大学生的理性与情感，科学精神与人文素养得到和谐发展，从而完善大学生的知识结构。
2.文化艺术活动有利于大学生社会性的培养
人的社会性是人在社会中生存和发展的基础和前提。人的社会性是指人在社会化的过程中具有了人类所特有的合作、理解、同情、关爱等主体意识，人具有了个体完整性。如果人缺乏了社会性，不仅仅是难以融入社会，而且容易产生远离社会的意识，一旦个体产生远离社会的意识，的偏激和偏见就可能滋生，不仅不利于社会的健康发展，而且也会影响人的健康发展。“求美”文化艺术活动，倡导提升大学生的人文素养、培养大学生的公民意识、形成大学生的社会责任感，通过人文、社会、科学知识、能力和修养的教育，培养大学生的合作精神、团队意识、集体主义、人文关怀等主体意识，使大学生认识到人的社会性对于人、社会、世界发展的意义和价值，使大学生在人与人、人与社会的冲突与融合中，学会克服缺陷，充分理解他人和社会，减少片面的看法，提升大学生的社会性。
3.文化艺术活动教育有利于大学生伦理道德的形成
“求美”文化艺术活动教育是着重于精神领域的教育，它以文化艺术的形式，富有形象性、感染性的特点，使人们在潜移默化的影响下，激起情感共鸣，从而使社会道德要求和善恶观念逐渐形成。文化艺术活动能展现美好的生活图景，深刻地反映社会生活，给人们提供区别善恶、美丑的标准，引起内心共鸣，使人们受到深刻的思想教育。长期以来，由于高等教育过分注重专业教育，使得大学生在思考人、社会、自然之间的关系方面，缺乏伦理道德观念。当今，世界性的生态保护与地球的永恒发展问题、国际化与本土文化的问题、生物科技与社会伦理问题、国际政治与民族冲突、种族冲突与宗教伦理等等，都成为当今世界人们必须思考的问题。因此，通过文化艺术活动，可以培养大学生的人文精神，提升大学生的文化品格，使他们尊重人的价值，获得超越人的生存的精神内涵，以其自主性、社会性思考人与社会、自然之间的关系处理，并以伦理学的视角思考科技发展与人、社会、自然之间的生态伦理关系，有利于培育形成大学生的伦理道德观念。
4.文化艺术活动教育有利于大学生审美情趣的培育
对美的不同观点，不仅是个体对美的评判标准，也集中体现出个体对美的感受、认知、理解和欣赏的素养，展示出个体在生活中的审美情趣。因此，对大学生的审美情趣的培育，不仅关系着大学生以何种标准去评判、感受、认知、理解和欣赏美，而且关系着大学生以怎样的审美情趣在生活中创造美。学会以高尚的审美情趣感受美、理解美、欣赏美、创造美，既是完善人生发展的一个重要方面，又是营造和创建现实生活及追求未来生活的内在机制和动力。大学生已进入青年阶段，不仅关注自己和他人的仪表美、语言美、行为美，而且以更为细腻的情感和独立的思考来感受、认知、评鉴生活中各种人和事物的更广泛、更深刻的美，并以美的标准创造美。所以，通过文化艺术活动教育，可以提高大学生的审美情趣，让大学生对美好事物的感受、理解和创造从简单的、表面的印象提升为对丰富、深刻的美好意境的欣赏，升华到精神美的境界，激发大学生理解美、欣赏美和创造美的意识和激情。
三、“求美”文化艺术活动教育内容确定的原则
“求美”文化艺术活动教育的内容体系是大学生文化艺术素质教育的基础环节，是实现教育目标的重要保证，是大学生“求美”文化艺术活动教育有效实施的根本条件。其教育内容的确定既要符合素质教育的目的又要满足学生的需求，既要区别专业教育、学科教育又要与专业教育、学科教育相衔接，因此要科学、合理的进行选择、整合、优化，这就必须遵循一定的客观原则。
1.导向性原则
随着经济的发展、分工的细化、文明的进步，现代社会将越来越重视人才的综合品性，特别是人才的团结合作意识、人文素养、心智模式。因此，构建“求美”文化艺术活动教育内容体系，应该关注大学生品德、团队意识、创新精神、人文修养等特性的培育。让大学生获得一个合格建设者所应该具备的公民意识、社会责任意识，让社会逐步理解大学生这些素质的提升对于社会发展的意义和价值。
2.基础性原则
大学生“求美”文化艺术活动教育不是专业教育的附属，它主要是为大学生的全面发展提供通识性、广博性的基础性知识和能力。大学生“求美”文化艺术活动教育不是对学生进行专业知识和专业能力的教育，而是主要进行基本认识、基本素养、基本技能的训练，是从大学生全面发展的角度构建内容体系。通常我们将人的进一步发展的基础归纳为三个方面，即知识、能力、修养。所谓“知识”，不仅是指专业知识，还包括人文历史、文明道德、科学技术、社会艺术等一般性的知识；所谓“能力”，也不仅仅是指专业的技能技巧，还包括思维理解能力、实践操作能力、自主学习能力等等；而“修养”更是一个人发展的基石，表现为健康的个性心理品质、积极的团队合作意识、文明的社会道德行为、良好的科学素养等。
3.民族性原则
在大学生“求美”文化艺术活动教育内容选择的过程中，不仅要重视学生基础性知识和能力的培养，还应特别重视中国传统文化的特色，要求大学生熟悉中国文化的精髓，知晓中国文化的历史渊源。这一原则的提出主要是针对我国高校大学生缺乏对我国传统文化全面的认识和理解，特别是我国传统文化中的人文教育思想，儒家的“仁”、“孝”、“信”的理念，对待人生和社会的积极态度等思想学说，这些内容对当代大学生可能比较陌生。所以，坚持民族性原则，合理安排教育内容，加强对我国民族文化及思想方面的教育，不仅有利于大学生认识和理解我国民族文化的博大精深，而且能够培养大学生的民族精神。
4.计划性原则
大学生“求美”文化艺术活动教育内容体系构建如果不合理，就容易造成与专业教育和学科课程内容的交叉，从而冲击专业教育。要实现把大学生“求美”文化艺术活动教育内容融入学校整体教育内容体系，既达成素质教育的目标，又不至于冲击专业教育。因此，必须有目的、有计划地对内容体系进行精心、合理的设计，避免教育内容的重叠，使大学生“求美”文化艺术活动教育内容体系尽量系统化、简洁化。
5.整合性原则
大学生“求美”文化艺术活动教育的内容不是相对独立的体系和结构，而是众多相关学科基础文化知识、技术能力经验的综合，各个方面密切相关、相互作用、相互制约，共同构成一个开放的适合学生各方面需要的内容整体。在内容选择上不是“杂、乱、散”碎片内容的堆砌，而应遵循教育规律，遵循大学生发展的需求，围绕人的综合素质的提高，整合大学生的校园生活和社会生活，并将知识性学习和体验养成性的教育有机的结合起来，做到由浅入深、重点突出、整体协调，从而提升学生的主体意识，学会处理人与人、人与社会之间的关系，充分理解他人和社会，培育大学生的社会责任感，倡导集体主义、人文关怀等时代精神。
6.体验与养成性原则
大学生“求美”文化艺术活动教育不同于其他教育，不能单靠知识传授和技能培养来完成，而是要通过教育、体验、养成、熏陶，从而促使大学生把学到的知识和能力内化为自身的素质和修养，塑造他们的科学与人文精神。这就需要在内容的构建上强化体验性和养成性教育，把体验性、养成性的活动和方法作为教育内容，通过规范的引导、环境的熏陶、身体力行的实践，帮助大学生形成文明的举止和良好的人格。
四、“求美”文化艺术活动教育的内容
1.哲学知识普及活动
根据的观点，“任何真正的哲学都是自己时代精神的精华”。对青年大学生进行哲学教育，增强其理论思辨能力，有助于他们高屋建瓴，把握整体，突破各具体学科的局限，超越人文与科学认识的界限。把哲学教育作为“求美”文化艺术活动教育的主要内容，有助于引导学生通过哲学思辨，去探究超越于现实功利的人生意义、理想、信仰与终极关怀，构建正确的世界观、人生观和价值体系。开设定期的论坛、讲座是进行哲学知识普及的最好形式。
2.传统文化教育活动
我国的传统文化是在中国社会长期发展过程中逐渐形成并支配着大多数人的具有积极意义的价值观念、道德标准和行为规范等意识形态因素，是一个蕴含着丰富内容的综合体。所以，加强对我国文化及思想方面的知识教育，不仅有利于大学生认识和理解我国传统文化的博大精深，而且能让学生重塑民族人文精神，树立奋进图强的民族精神，激发学生的爱国主义情感与高度的民族责任感。如开展诗词吟诵大赛、诵读经典活动、传统纪念日的纪念活动、典型历史人物的学习活动等。
3.世界文化教育活动
随着我国改革开放的不断深入，西方多元文化的价值观、不同主张的自由化思想观念等对我国高校大学生的冲击很大，极大地影响着大学生对我国传统文化和社会发展的立场和态度。通过对世界文化的教育，使大学生对世界文化及思想有个系统、全面的认识，可以让学生了解和认识世界各国人民的历史，掌握历史发展的脉搏，让学生在错综复杂的国际关系中保持清醒的头脑。可以开设国际文化交流论坛，邀请专家进行国际文化讲座，进行国际文化交流，开展西方经典电影、戏剧、文学赏析活动等。
4.人与自然、社会和谐共处教育活动
随着科学技术的发展，人与自然之间的关系出现了改变，人类的活动影响了自然的自我发展,并严重危及了人类自身的生存和发展。因此，应该让大学生了解人与自然和谐共处的意义和价值，思考人类社会可持续发展的问题，加强大学生的环境意识。另外，让大学生确立起“人”是社会经济发展的最终目的这一思想观念，使大学生学会与人相处、与人交流，从而实现人与社会的和谐发展。可以通过开展“保护母亲河”主题活动、第三只眼看社会主题摄影展、“人与自然”主题征文等活动进行这一内容的教育。
5.文艺鉴赏教育活动
文学、艺术作品包含着人们对不同时期人的生存状况的描写和反映，同时也体现着人们对人生问题的深刻思考，不仅能引发大学生的思考，而且能够升华大学生的人文关怀、润泽大学生的心灵、促进大学生人的本性的觉醒和提升。通过引导大学生进行文艺作品鉴赏，能够让他们领悟美的真谛，培养大学生欣赏美、体验美、鉴赏美和创造美的意识，进一步提高大学生的艺术修养和审美能力，使他们对文学、艺术作品有一定的的鉴赏和评论能力，能借助文学、美术、音乐来表达自己的感情，能将追求完美的意识渗透到生活和学习中去，升华大学生对生活美、艺术美的追求，培养其高雅的审美情趣。可以通过戏剧、歌舞、器乐、文学、传统艺术表演等各种形式培养大学生的审美能力。
参考文献：
[1] 苟克鼎.课余活动在大学生素质培养中的地位和作用[J].兰州大学学报,2000(2)
[2] 但武刚.活动教育的理论与方法[M]．华中师范大学出版社,2005.
第8篇
【关键词】 nf-κb；核糖核酸类，反义；肌细胞，平滑肌
effect of antisense rna of nf-κb on proliferation of vascular smooth muscle cells in spontaneously hypertensive rats/hu rong，hong huashan，xu changsheng，wu kegui//chinese journal of cardiovascular rehabilitation medicine,2009,18(2):116
abstract：objective:to investigate the effect of antisense rna of nf-κb on proliferation of vascular smooth muscle cells（vsmcs） in spontaneously hypertensive rats（shr） promoted by thrombin.methods:after pretreated with the 50moi recombinant adenovirus expressing antisense rna of nf-κb for 48h and 100μmol/l pdtc （nf-κb special inhibitor）for 1h， vsmcs proliferation induced by 0.5u/ml thrombin was investigated.the proliferation rate of vsmcs was determined with both wst-1 metabolic activity and 3h-tdr incorporation efficiency.results:the pretreatment of recombinant adenovirus expressing nf-κ b antisense rna obviously inhibit vsmcs proliferation induced by thrombin (p<0.01) at the rate of >30%, which was similar to the inhibition of vsmcs proliferation by nf- κ b special inhibitor pdtc with no statistical difference between two group(p>0.05).conclusion:the recombinant adenovirus expressing nf-κ b antisense rna may effectively inhibit vsmcs proliferation induced by thrombin,is similar to the nf- κb special inhibitor,may be applied to successive basic research and clinical interference treatment.
author′s address：department of cardiology，union hospital，fujian medical university，fuzhou，fujian，350001,china
key words：nf-kappa b;ribonueleases,antisense; myocytes,smooth muscle
血管平滑肌细胞（vsmcs）的增殖、向内膜下迁移、分泌细胞外基质等在血管增殖性疾病的发病中起重要作用。体内可以引起细胞增殖的因素很多，各种有丝分裂原可通过不同的信号传导系统产生细胞增殖反应，单纯抑制某种特定的因子并不能完全抑制病灶形成。因此，阻断调节细胞增殖、分化、迁移等最终共同通路的关键基因成为有效防止血管增殖性疾病的研究方向。核因子-κb（nf-κb）是调节细胞基因转录的关键因子之一，调控几十种生长因子、细胞因子、粘附因子、趋化因子等靶基因的表达[1]。因此，许多学者认为调控nf-κb的活性是一个理想的治疗靶点。基因治疗是从基因水平改变细胞的病理状态而达到治愈疾病的目的，具有一次治疗长期有效的优点，克服现有药物疗法的缺点，实现“生理性治疗”[2]。反义rna是一类能与特异性mrna互补的小分子质量的、可扩散的dna转录物，它能够从翻译水平、转录水平和核酸复制水平上高度特异性地抑制靶基因表达。反义核酸技术的意义在于仅干扰靶基因功能，对基因组其它基因的结构无影响，而且方法简便。本研究试图在细胞水平探讨以腺病毒为载体，nf-κb反义核酸治疗对vsmc增殖的影响，为其在整体动物的水平治疗经皮冠状动脉介入治疗（pci）术后再狭窄和动脉粥样硬化（as）奠定基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料
实验所用的自发性高血压大鼠（shr）购自北京维通利华有限公司［二级动物合格证号：scxk(京)2003-0003］。表达nf-κb反义rna重组腺病毒载体－pad/cmv/269和空载体pad/cmv系本实验室构建保存[3]；凝血酶、吡咯烷二硫氨基甲酸盐（pdtc）（sigma公司）1；氚-胸腺嘧啶核苷（3h-tdr，中国原子能科学研究院）；测定细胞活性的wst-1试剂盒（德国boehringer mannheim公司）；阳离子脂质体（lipofectamine）tm 2000转染试剂（invitrogen公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 vsmcs的培养与鉴定[4]:以组织贴块法培养vsmcs。取清洁级三月龄雄性shr大鼠，无菌操作分离其胸主动脉，剪碎后加入含15%胎牛血清（fbs）的dmem培养液（含100 ku/l青霉素，100mg/l链霉素），5%co2、37℃二氧化碳培养箱静置培养。实验选用3～5代细胞。用光镜和免疫细胞化学法鉴定。
1.2.2 重组腺病毒的制备、滴度测定及鉴定[3]:paci酶切使重组腺病毒质粒pad/cmv/269线性化，紫外分光光度计测定质粒的纯度及浓度。按lipofectaminetm 2000转染试剂盒操作说明，用脂质法转染培养好的293单层细胞，进行细胞内包装，形成并释放完整的腺病毒颗粒。包装后的腺病毒用空斑法测定滴度，操作按virapowertm adenoviral expression system 试剂盒说明书。重组腺病毒用聚合酶链式反应（pcr）方法进行验证，按dna提取试剂盒操作说明。
1.2.3 实验分组:实验选用3-5代的培养vsmcs，用0.125％胰酶消化后，以2×104个/孔或5×103个/孔，均匀接种于24孔或96孔培养板上，待细胞贴壁生长至70%～80％汇合时，吸弃原培养液，换用无血清或0.2％血清的dmem培养液，继续培养24h，使vsmcs处于g0/g1期，再进行后续干预实验。将培养细胞分为5组：①空白对照组：加入无血清dmem液；②空载体组：加入50多重感染（moi） ad/cmv感染vsmcs；③凝血酶组：加入终浓度为0.5u/ml凝血酶；④pdtc组：先加入终浓度为100μmol/l的pdtc预处理1h，再加入终浓度为0.5u/ml凝血酶；⑤反义rna预处理组：先加入50moi 重组ad/cmv/269感染vsmcs后48h，再加入终浓度为0.5u/ml凝血酶。按实验要求细胞继续培养至加刺激因素凝血酶后24h，测定细胞增殖率。每组复3孔取均值。重复4次。
1.2.4 vsmcs增殖的测定方法:wst-1代谢活性测定[4]：取3～5代vsmcs以5×103个/孔均匀接种于96孔培养板上，培养至70%～80％汇合时，换用0.2％血清的dmem培养液，继续培养24h，使vsmcs处于g0/g1期。在上述各干预因素刺激至规定时间后加入即用型wst-1溶液，10μl/孔，继续置37℃ 5％co2培养箱孵育90 min。取出培养板，置振荡器上充分振荡（300 r/min）1min，在酶标仪450/630nm双波长处检测光密度（od）值，即wst-1检测值。每次实验均设一个（复3孔）空白对照孔（以dmem培养液代替细胞），对照孔吸光值应<0.01。dna合成率测定：3～5代vsmcs以2×104个/孔，均匀接种于24孔培养板上，在上述干预因素加入时，同时加入1微居里/ml的3h-tdr，共育至相应时间后，吸弃培养液，0.125％胰酶消化细胞，收集细胞于0.45μm的微孔滤膜（预先用10％三氯醋酸湿润）上，负压抽滤，用生理盐水和10％三氯醋酸冲洗滤膜，室温凉干后置入液体闪烁杯中，加入3ml闪烁液［二甲苯+0.5%二苯基噁唑（ppo）+0.04%对苯撑苯唑基（popop）］，静置过夜后，在液体闪烁计数器上进行放射性强度的测定。
1.3 统计学处理
实验结果用数据和图表表示，测定值以均数±标准差(±s)。采用spss 10.0统计软件包分析。组间比较采用多样本均数的单因素方差分析检验。p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 nf-κb反义rna重组腺病毒感染vsmcs对vsmc wst-1代谢活性的影响
凝血酶＋反义rna组和凝血酶＋pdtc组的wst-1的od值均比凝血酶组明显减少（p<0.01），反义rna组与pdtc组之间不存在显著差异（p>0.05）。50moi nf-κb反义rna和100μmol/l pdtc对0.5u/ml凝血酶诱导的vsmc wst-1代谢活性增加的抑制率分别为35.64％和36.32％，较之凝血酶组显著减少（p<0.01），见表1，图1。
2.2 nf-κb反义rna重组腺病毒感染vsmcs对vsmc 3h-tdr掺入率的影响
凝血酶＋反义rna组和凝血酶＋pdtc组的3h-tdr掺入率均比凝血酶组明显减少（p<0.01），反义rna组与dptc组之间不存在显著差异（p>0.05）。50moi nf-κb反义rna和100μmol/l pdtc对0.5u/ml凝血酶诱导vsmc 3h-tdr掺入率增加的抑制率分别为45.22％和49.62％，较之凝血酶组显著减少（p<0.01），见表1，图2。表1 不同组wst-1测定的代谢活性和氚胸腺嘧啶核苷（3h-tdr）掺入率(n=4)
3 讨 论
许多能够抑制vsmc增殖的药物，无论是在基础研究还是临床实验中，均已被证明具有防治动脉硬化及pci术后再狭窄的作用。但由于药物治疗的效果尚不十分理想，以及必须坚持长期用药给病人心理上造成了巨大的困扰，寻找更加有效和方便可靠的治疗方法便成为心血管病研究的热点。尽管基因治疗目前尚不十分成熟，但在这一领域中所取得的成就已引起众多学者的关注。
凝血酶是一种重要的血管活性物质，除凝血作用外，晚近也证明它还能促进vsmc的增殖和迁移；促进血管壁非细胞成分的累积和新生内膜形成和释放炎症反应因子等作用，其功能多由细胞表面的凝血酶受体基因介导[5]。nf-κb是调节细胞基因转录的关键因子之一，新近研究发现vsmc中存在着nf-κb通路，且是vsmc增殖必经的激活通路。本系列实验的先前研究结果显示凝血酶能够激活vsmc的nf-κb，使其从细胞浆转位至细胞核，而且凝血酶引起的vsmc增殖与nf-κb途径相关联[6]。nf-κb可能是vsmc增殖的细胞内信号转导的共同通路。国内、外已有利用反义核酸技术抑制凝血酶受体表达来阻断凝血酶作用，从而抑制vsmc增殖的报道[7～9]，但利用反义表达载体、反义核酸技术抑制nf-κb的生成，从而达到抑制凝血酶诱导vsmc增殖的目的至今尚未见相关报道。
本研究利用前文[3]构建的nf-κb反义rna腺病毒表达载体，转染293细胞，获得高滴度腺病毒上清，再感染vsmc，观察nf-κb反义rna对凝血酶引起的细胞增殖的作用。结果显示，该载体能在vsmc内表达出nf-κb反义rna，显著抑制了凝血酶诱导的vsmc增殖，显示出该反义表达载体在心血管细胞增殖性疾病的基因治疗的研究中具有良好的适用性。
基因治疗是从根本上针对发病环节的一种治疗手段，靶向性更明显，具有一次治疗长期有效的优点。本实验结果证实，在同等条件下，nf-κb反义rna对vsmc增殖的抑制率＞30％，即具有生物学效应，且与nf-κb特异性阻断剂pdtc的抑制作用相仿，为今后进一步的基础研究和临床干预治疗奠定了基础。值得注意的是，nf-κb在维持机体的防御功能和细胞生死平衡方面，起着极其重要的作用，完全地、持续地阻断nf-κb激活有可能导致免疫缺陷和正常细胞的凋亡[10,11]。因此，如何进一步提高反义核酸技术的稳定性、有效性、安全性，尚待进一步的研究。
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第9篇
[关键词] 阿尔茨海默病；电针；tau蛋白；磷酸化
[中图分类号] r-33 [文献标识码] a [文章编号] 1674-4721（2013）05（c）-0016-03
老年性痴呆亦称阿尔茨海默病（alzheimer' s disease，ad），它是一种极其常见的中枢神经系统退行性疾病，由于病因及发病机制至今不清，发病以后很难治愈，给患者的日常生活也带来了很大的不便。ad患者脑内含有大量的以异常过度磷酸化的tau蛋白为主要成分的神经元纤维缠结（nfts）[1]，有研究[2]发现ad患者的痴呆程度与神经原纤维的缠结数目具有密切的关系，而神经原纤维增粗扭曲形成缠结正意味着神经元趋于死亡，因此也可以验证出ad患者的痴呆程度与神经原纤维的缠结数目是呈正相关[3]趋势增长的说法。所以可以大胆地推断海马tau蛋白的过度磷酸化其实就是ad的核心原因。而电针治疗通过电流微弱的刺激大鼠海马区域，以此来增强其活性，通过激活磷酸酯酶活性，来限制ad患者脑tau蛋白异常过度磷酸化，从而进一步改善ad的发病症状。此实验初步探究电针刺激大鼠海马区，旨在证明电针能改善ad大鼠的记忆能力，抑制tau蛋白异常过度磷酸化，进而延缓ad的发展并改善其症状。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康的sd雄性大鼠60只，体重180～200 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供（批号：2010002）。在实验室稳定条件下饲养1周。
1.2 主要试剂及仪器
戊巴比妥钠（上海索莱宝生物科技有限公司）；ab25-35（美国chemicon公司）；tau-5单克隆抗体、tau-1单克隆抗体、p-tau（s396）多克隆抗体（biosource公司）；脑立体定位仪（narishige sn-2型）；morris水迷宫（北京硕林苑科技有限公司）；全能脉冲电疗仪（6805-c型）（汕头市医用设备厂有限公司）；无菌针灸针（北京健乐康医疗器械有限公司）。
1.3 动物造模
将大鼠称重并用4%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉注射之后，将大鼠固定在大鼠脑立体定位仪上，并且可以参照《大鼠脑立体定位图谱》先对大鼠进行最常规的消毒，然后切口于颅顶正中矢状，将骨膜分离，用锥颅器快速钻开颅骨，使硬脑膜完全暴露出来。于前囟1.3 mm，矢状缝左右旁开1.6 mm，垂直3.5 mm，用微量注射器对每侧侧脑室各注射aβ25-35（实验前将其溶于0.9%氯化钠溶液中，配置成浓度10%）。用微量注射器将aβ25-35在3 min内缓慢注入，留针5 min，充分浸润局部组织，缓慢拔出微量注射器。第3天重复注射试剂，剂量相同，正常组不用注射药品。
1.4 分组和治疗
将雄性sd大鼠30只随机分成正常组、模型组和电针组，每组10只。电针组：第2次水迷宫测试结束后，用毫针针刺“百会”穴，平刺约2.5 mm，“大椎”穴，直刺约4 mm。“百会”穴、“大椎”穴连接6805-c型全能脉冲电疗仪，频率为30 hz，电压为2 v，强度是以肢体轻微抖动为宜，用针刺大鼠双侧“太溪”穴，双侧“肾俞”穴，直刺进针5 mm，双侧 “足三里”穴，直刺进针4 mm，间歇5 min捻转一次，每日1次，时间40 min。7 d为1个疗程，间歇1 d，治疗3个疗程后进行行为学测试。正常组：给予正规的饲养，模型组：造模后常规饲养。
1.5 morris水迷宫测试
迷宫水池中的平台位于东北象限正中，水面高出平台100 cm，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其在2 min内寻找到并爬上平台的时间即逃避潜伏期。潜伏期最长时间120 s。分别在治疗前后进行游泳实验
，大鼠每次在2 min内寻找到并爬上平台的时间为大鼠的记忆成绩，每日2次，连续5 d，然后计算出测试结果的平均成绩。
1.6 检测大鼠海马tau蛋白含量
第2次大鼠进行水迷宫试验结束后，将其断头取脑，分离双侧海马，放入冰箱中冷冻保存，用western blot法来检测大鼠海马区tau蛋白的含量。在1 ml组织裂解液匀浆中加入双侧海马，等待离心5 min后提取上层清液，并利用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度的测定，将各组所得蛋白调整成等浓度的溶液样品。等量蛋白样品经过10% sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到pvdf膜封闭2个小时，加入一抗（tau-5检测tau蛋白总量，tau-1检测198位点非磷酸化tau蛋白，s396 tau检测404位点磷酸化tau蛋白），孵育过夜，洗膜3次，加入二抗室温孵育2 h，洗膜13次。凝胶成像仪拍摄图像，image j软件测定平均光密度（od）值。
1.7 统计学分析
采用spss 17.0统计软件分析包，进行单因素方差分析，组间比较用t检验，统计结果以x±s表示，p < 0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠morris水迷宫试验逃避潜伏期比较
治疗前模型组和电针组的时间延长与正常组比较差异有统计学意义（均p < 0.05），治疗后模型组大鼠的逃避潜伏期的平均值相对于正常组和电针组的时间长，差异有统计学意义（均p < 0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠海马tau蛋白含量比较
tau-5蛋白3组间的含量差异无统计学意义，与模型组相比电针组海马tau-1含量明显偏高，但是s396 tau蛋白的含量却明显比模型组（均p < 0.05）低很多，s396 tau蛋白含量及电针组海马tau-1的含量与正常组相比，它们之间的差异无统计学意义。见表2。
3 讨论
老年性痴呆又称阿尔茨海默病（alzheimer's disease，ad），是中枢神经系统（cns）退行性疾病。患者中最具特征性的神经病理改变就是神经元内出现大量的神经原纤维缠结，神经原纤维缠结（nft）多出现在海马、皮质以及基底前脑的神经元中，其病理特征为大脑皮质及海马等处的老年斑（sp）和nft[4]。在ad患者中，其病理条件下，tau蛋白会不断的发生异常过度磷酸化的改变，因此会丧失与微管相互结合的能力，而且这些磷酸化的蛋白会聚集在一起并形成 nft（也就是说会使大量的神经元纤维缠结），结果会导致微管解聚，破坏了细胞的正常骨架，更会损坏正常轴突的转运系统，由此导致了突触丢失并引发退行性的病理改变。而神经原纤维缠结主要是由双股螺旋纤维构成的，tau蛋白过度磷酸化会形成各种各样的同分异构体，这些异构体正是双股螺旋纤维的主要成分，细胞之中tau蛋白过度磷酸化是ad最早出现的病理改变之一[5]。有关的最新研究表明[6-8]，关于aβ所导致的失忆和生理行为的缺陷，其实都是依赖于tau蛋白分子所具有的独特功能。因此，怎样预防并改善tau蛋白过度磷酸化是现代化科学对ad病理学研究的关键性所在。
tau蛋白是在1975年weingarten等在采用猪脑分离纯化微管蛋白的同时，被首次分离出来的一种与微管的组装具有密切关系的含磷糖蛋白。它能使微管的功能和结构维持正常稳定的基础，而且它的功能也受到磷酸化水平调节，tau蛋白构象改变的主要原因之一就是其过度磷酸化所导致的，它也会因此丧失促微管组装的生物学活性及功能，而且对蛋白水解酶的抗性增加，会产生神经毒性[9-11]，进而危害机体健康。tau蛋白在ad患者脑内磷酸化程度高出正常人3～4倍。在ad患者的大脑内存在3种tau蛋白，一是细胞质正常tau蛋白（c-tau），二是过度磷酸化易溶型tau蛋白（adp-tau），第三种是聚集成phf的tau蛋白（phf-tau）。到目前为止，在phf-tau中已经鉴定出45个磷酸化位点[12]，其中主要是苏氨酸和丝氨酸残基发生过度磷酸化，本实验是在丝氨酸的198和404位点展开进行的。电针通过对大鼠海马区的刺激，来增强细胞活性，通过激活磷酸酯酶活性，来限制ad患者脑tau蛋白异常过度磷酸化，从而进一步改善ad的发病症状。
祖国医学认为，脑为髓海、精明之府，肾藏精，生髓，通于脑，髓由肾中精气化生。《素问·宣明五气篇》曰：“肾藏志。”志，即为记忆、学习能力。清·林佩琴《类证治裁》曰：“夫人之神宅于心，心之精根于肾，而脑为元神之府，精髓之海，实记忆之所凭也。”说明肾中如若精气充盈，则神清气朗，耳聪目明。由此用“百会”“大椎”“太溪”“肾俞”“足三里”组成针灸治
疗，通过影响中枢神经系统，能抗氧化，以及改善突触形态可塑性及长时程增强效应，来直接或间接提高ad大鼠的学习记忆能力[13-15]。本实验结果显示，针能减低aβ所致的tau蛋白在198和404位点磷酸化水平，提示电针治疗有一定的抑制tau蛋白磷酸化的作用，这将有助于神经元微管系统的稳定，起到保护神经元的作用。
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第10篇
【摘要】 目的 观察褪黑素替代治疗对去松果体成年大鼠学习记忆及侧脑室室管膜下区（SVZ）神经干细胞增殖的影响。方法 将30只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术、去松果体及褪黑素替代治疗3组，每组大鼠10只。在建立动物模型2天后开始用褪黑素（200μg/kg体重）或5%乙醇-生理盐水进行干预，每天在固定时间给予每只大鼠腹腔注射1次，连续给药21天。各组均于术后第16天开始用Morris水迷宫连续5天测定大鼠的学习记忆能力，用免疫组织化学方法观察SVZ的增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞变化。结果 去松果体组大鼠在Morris水迷宫游泳的逃避潜伏期及在原平台象限游泳距离的百分比明显延长或减少（P＜0.01）。去松果体大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核数也明显下降（P＜0.01）。褪黑素替代治疗后可明显逆转上述指标的变化，并使其接近假手术组大鼠的水平（P＜0.01）。假手术组与褪黑素替代治疗组间的指标差异无显著性（P＞0.05）。结论 本研究首次观察到，去松果体使体内褪黑素减少，可导致学习记忆功能及SVZ神经干细胞增殖能力出现相似的明显下降趋势，褪黑素替代治疗后可使上述指标出现相似的明显升高趋势并接近正常水平。说明褪黑素是确保学习记忆及神经发生得以正常进行的重要激素之一；提示褪黑素可能通过作用于局部神经干细胞以及星形胶质细胞上的相应受体的机制来促进神经干细胞增殖，使SVZ-吻侧迁移途径-嗅球的神经发生链在结构和功能上得到不断更新，进而提高学习记忆能力。
【关键词】 松果体； 褪黑素；替代治疗；学习记忆；室管膜下区；神经干细胞；增殖；大鼠
【Abstract】 Objective To investigate the effects of melatonin replacement therapy on the learning and memory as well as on the proliferation of neural stem cells in the subventricular zone（SVZ） of the lateral ventricle in pinealectomized adult rats.Methods Thirty male Sprague-Dawely rats were randomly pided into three groups with ten rats per group： sham-operated，pinealectomized and melatonin-replacement therapy. After two days of operations，the rats in melatonin-replacement therapy group received daily peritoneal injection of melatonin（ 200μg/kg body weight，dissolved in 5ml of 5% ethanol-NaCl solution）for twenty one consecutive days; while the rats in sham-operated and pinealectomized groups were daily given the equal volume of vehicle under the same conditions. After sixteen days of operations，the rat performences in Morris water maze were detected for five consecutive days. Then the number of proliferating cell nuclear antigen immunoreactive （PCNA-IR） cell nuclei in the SVZ was counted.Results Navigation tests showed that the escape latency for finding the platform during training trials of pinealectomized rats was significantly longer than that of sham-operated or melatonin-replacement rats （P＜0.01）. Probe tests revealed that pinealeetomized rats had much worse knowledge of the platform’s prcise location than sham-operated or melatonin-replacement rats did （P＜0.01）. Similarly，the mumber of PCNA-IR cell nuclei in the SVZ of pinealectomized rats was significantly lower than that in sham-operated or melatonin-replacement rats （P＜0.01）. However，melatonin replacement therapy reversed the above parameters（P＜0.01），which nearly reached the levels of sham-operated rats（P＞0.05）.Conclusion The data for the first time demonstrate that pinealectomy reduces the level of endogenous melatonin，and impairs the learming and memory processes as well as the proliferation of neural stem cells in the SVZ，whereas exogenous melatonin replacement therapy can reverse these changes，indicating that melatonin plays an important role in maitaining the normal learning and memory processes as well as in augmenting the neurogenesis in SVZ; and that melatonin may promote the neurogenesis in SVZ via activation of melatonin receptors in both neural stem cells and astrocytes，thereby enhancing olfactary memory.
哺乳动物侧脑室室管膜下区（subventricular zone ，SVZ）是脑内终生存在神经发生（neurogenesis）的一个主要部位，由此产生的神经干细胞通过有丝分裂形成祖细胞（progenitor cell），后者迁移到嗅球，分化成新的中间神经元，代替衰老或死亡的神经细胞，使局部神经环路的结构得到不断更新，从而发挥正常的嗅觉及嗅觉记忆功能［1］。褪黑素是主要由松果体合成和分泌的一种神经内分泌激素，已证实其不仅具有促进胚胎个体发育及体外培养神经干细胞增殖的功能［2，3］，而且还可提高学习记忆能力［4］。然而，迄今仍匮乏有关褪黑素对成年在体SVZ神经发生及学习记忆影响的报道。为此，笔者最近进行了研究并初步观察到，松果体切除对成年大鼠SVZ神经发生及学习记忆均产生类似的负性效应［5］。为进一步揭示褪黑素、神经干细胞及学习记忆三者之间的内在联系，本研究通过观察褪黑素替代治疗对上述指标的影响模式，为阐明学习记忆的神经内分泌机制提供新的资料。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 小鼠抗人PCNA单克隆抗体为DAKO公司产品；生物素结合IgG、链霉菌抗生物素-过氧化酶（SP）及二氨基联苯胺（DAB）染色试剂盒均为福州迈新公司产品；褪黑素为Sigma公司产品。
1.2 动物与分组 选用清洁级健康雄性Sprague-Dawely大鼠30只，8～10周龄，体重150～180g，由广西医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为以下3组，每组10只：假手术、去松果体及褪黑素替代治疗组。
1.3 动物模型的建立 参照袁群芳等的方法［4］，进行松果体切除术，假手术除不切除松果体外，其余步骤与上述相同。所有动物在自然光暗周期的环境中分组饲养，自由饮水、进食。
1.4 替代治疗方法 术后第2天开始进行相应的干预，褪黑素替代治疗组的每只大鼠按200μg/kg 剂量将褪黑素溶于0.5ml的5%（V/V）乙醇-生理盐水中，每天在固定时间（18：00 pm）腹腔注射1次，连续给药21天。在相同条件下，每天给予假手术组和去松果体组的每只大鼠腹腔注射0.5ml的5%乙醇-生理盐水，连续注射21天。
1.5 学习记忆能力的测定
1.5.1 定位航行实验 于术后16天开始用Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所研制，型号：DMS-2）测试，历时4.5天，每天分上、下午2个时段，每只大鼠在每个时段测试4次，记录大鼠每次自入水直至找到并爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期，如60s找不到平台即记录为60s，以此作为判断大鼠学习能力的指标。
1.5.2 空间探索实验 在测试的第5天下午撤走平台，将大鼠放入水中，通过电脑测试系统记录大鼠在2min内的游泳轨迹，计算出大鼠在原平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比，以此作为判断大鼠记忆能力的指标。
1.6 组织切片制备 各组大鼠在完成测试学习记忆能力后，1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，经心脏灌注100ml 生理盐水，继之灌注500ml的4%多聚甲醛固定液（0.1mol/L PB液配制，pH 7.4，4℃）。除去颅盖骨，将头部固定于脑立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱［6］，在前囟前1.6mm至前囟后4.8mm的范围内切取脑组织块，置于相同的固定液后固定3h（4℃），转至30%蔗糖溶液（0.01mol/L PBS配制，pH 7.4，4℃），待组织块下沉后行冠状连续冰冻切片，片厚40μm，隔3取1，收集于0.01mol/L PBS中，待反应。
1.7 免疫组化反应 采用SP法检测SVZ的增殖细胞核抗原（proliferating cell nucleus antigen，PCNA）的表达，主要步骤如下：切片入3%（V/V）H2O2溶液室温15min，消除内源性过氧化物酶的活性；入0.1%（V/V）Triton X-100溶液（0.01 mol/L PBS配，pH 7.4）室温孵育1h；正常羊血清室温封闭抗原20min；小鼠抗人PCNA单克隆抗体（1:100）室温孵育22h；生物素结合IgG室温孵育2h；SP室温孵育2h；0.05%DAB（含0.01%（V/V）H2O2）室温显色约30s。在上述过程中，完成每一步骤后均用0.01mol/L PBS（pH 7.4）漂洗15min，然后再进行下一步骤。常规脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照实验除用羊血清代一抗外，其余步骤与上述相同。
1.8 细胞计数 每只动物选取3张切片（前囟前0.8mm、1.0mm、1.2mm）作为观察对象［6］，光镜下（40×10）计数左侧侧脑室SVZ的背侧、外侧及内侧3个视野的PCNA阳性细胞数。
1.9 数据统计分析 采用SPSS 10.0统计软件中的单因素方差分析对原始数据进行统计处理，用最小差异显著性检验（LST）及Games-Howell检验对数据进行两两比较，以双侧α=0.05作为显著性检验水准，最后得出的数据以x±s表示。
2 结果
2.1 Morris水迷宫测试结果 各组大鼠的逃避潜伏期及在原平台象限游泳距离的百分比分别见表1及图1。
从表1可见，除测试的第1时段外，去松果体组大鼠在其余测试时段的逃避潜伏期均比褪黑素替代治疗或假手术组大鼠明显延长，组间的差异有非常显著性（P＜0.01），而褪黑素替代治疗组大鼠与假手术组大鼠的逃避潜伏期较为接近，组间差异无显著性（P＞0.05）。在整个测试中，去松果体、褪黑素替代治疗及假手术组大鼠9个时段的平均逃避潜伏期分别为33.89、19.73及18.28s，其中去松果体组的平均逃避潜伏期分别比褪黑素替代治疗组和假手术组明显增加了71.8%和85.4%，组间差异有非常显著性（P＜0.01），但褪黑素替代治疗组与假手术组之间差异仍然无显著性（P＞0.05）。
从图1可见，去松果体、褪黑素替代治疗及假手术组大鼠在原平台象限游泳距离的百分比分别为18.7%、40.3%及45.8%；去松果体组大鼠分别比褪黑素替代治疗组和假手术组大鼠明显下降了53.6%和59.2%，组间差异有非常显著性（P＜0.01），而褪黑素替代治疗组与假手术组大鼠之间差异无显著性（P＞0.05）。
2.2 PCNA阳性细胞的变化 SVZ的PCNA免疫反应产物定位于细胞核，呈棕黄色，阳性细胞核为圆形、椭圆形或梭形，各组大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核形态均无明显差异。此外，用羊血清替代—抗的反应结果也为阴性。对各组大鼠左侧侧脑室SVZ的PCNA阳性细胞核计数的结果见表2。
由表2可见，去松果体组大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核数分别比褪黑素替代治疗组及假手术组大鼠明显下降了37.1%和38.8%，组间差异有非常显著性（P＜0.01），而褪黑素替代治疗组与假手术组之间则差异无显著性（P＞0.05）。
3 讨论
神经干细胞是一种具有高度增殖能力的原始细胞，为了解这类细胞的增殖状态，常通过观察其细胞周期中的标志物变化来加以断判之。PCNA既是属于种系发生中高度保守的DNA多聚酶δ辅助蛋白，又是参加细胞DNA合成的一个不可或缺的蛋白因子［7］。PCNA定位于细胞核，在神经干细胞增殖的DNA合成期中表达，且其表达水平与DNA合成的活跃程度呈正比［8］，故PCNA是研究神经发生动力学的一个重要指标。由于PCNA具有以上特点，故本研究用其来观测神经干细胞的增殖变化。
既往研究表明，在体外培养的新生大鼠SVZ神经干细胞经表皮生长因子刺激后，再加入褪黑素可明显提高神经干细胞的增殖率［2］，而且褪黑素还可加速个体胚胎生长和发育的进程［3］，说明褪黑素对细胞发生及胚胎形成均产生明显的正性效应。由此可推测，褪黑素有可能对成年在体SVZ神经干细胞的增殖施加某种影响。为探讨这一问题，笔者最近做了相关研究，结果初步显示，通过切除松果体消除内源性褪黑素的主要来源，可明显降低成年大鼠SVZ的PCNA阳性细胞核数（P＜0.01）［5］；本研究结果则显示，褪黑素替代治疗可使因去松果体下降的PCNA阳性细胞核数明显升高到正常水平（P＜0.01）。因此，以上结果与其他作者的基本一致［2，3］，也充分证实了笔者的推测，即褪黑素对成年在体SVZ神经干细胞具有促增殖作用，而且此作用呈现出对部位、细胞种类及发育阶段的非依赖性。其作用机制可能与两方面有关：（1）褪黑素直接作用于神经干细胞上的相应受体［3］，使PCNA表达上调，促进更多的细胞进入DNA合成期，为产生更多的子细胞提供了合成代谢的物质基础；（2）褪黑素作用于局部星形胶质细胞上的相应受体［9］，促进星形胶质细胞与神经干细胞相互作用并合成及释放多种细胞生长因子，后者可保护子细胞完成迁移抵达终点以及分化成局部中间神经元［10］，这对于完成使局部神经环路的结构得到不断更新转归和整合以及维持功能的可塑性均有重要的生物学意义。
袁群芳等报道［4］，松果体源性褪黑素具有提高大鼠在Morris水迷宫的学习记忆能力。笔者前期的研究［5］、本研究亦表明，去松果体可使大鼠在Morris水迷宫的学习记忆能力下降（P＜0.01），褪黑素替代治疗则可提高去松果体大鼠的学习记忆能力（P＜0.01），这与上述作者的相一致。此外，本实验结果还首次显示，在去松体或褪黑素替代治疗状态下，学习记忆的变化与PCNA阳性细胞核数的变化之间存在着惊人的相似之处，故两者的变化趋势呈现出平行关系。提示褪黑素很有可能通过前述的机制来提高SVZ的神经发生，使神经干细胞产生更多的祖细胞，经吻侧迁移途径（rostral migratory stream）源源不断地迁移到嗅球，最终分化成颗粒细胞和小球周细胞，从而提高嗅觉记忆功能［11］;也有可能通过促进基底前脑胆碱能系统的功能来提高学习记忆能力［4］。至于是否另有提高学习记忆能力的其他机制，有待于进一步研究澄清。
临床研究表明，嗅觉障碍是在老年性痴呆早期首发的主要症状之一，并随病程进展而加重［12］。此外，老年性痴呆患者脑脊液的褪黑素水平显著下降，褪黑素分泌的节律性也明显紊乱［13］。这些结果提示，在老年性痴呆的发病中，有可能由于褪黑素的合成和分泌减退以及节律异常，导致SVZ神经干细胞的增殖严重受损，使嗅球需要更新的局部中间神经元得不到及时补充，进而引发嗅觉及嗅觉记忆功能障碍。因此，除了可用褪黑素调动原位SVZ神经干细胞来防治老年性痴呆外，还可在用神经干细胞移植或基因治疗该病中宜添加褪黑素，使得移植的神细干细胞能有效分裂、整合到靶组织，目的基因也能长期表达产物，从而在该病的神经结构重建及功能恢复方面有可能获得意想不到的效果。
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第11篇
【摘要】 目的 观察慢性愤怒应激对D半乳糖(Dgal)引起的衰老大鼠空间学习记忆能力的影响，并从脂质过氧化与抗氧化角度解释其作用机制。方法 采用夹尾间接激怒法诱导被攻击大鼠产生愤怒应激，观察慢性愤怒应激对衰老大鼠空间学习记忆能力和血清SOD活性及心、肝组织MDA、LPF含量的影响，分析心、肝MDA、LPF含量与血清SOD活性的相关性。结果 愤怒Dgal组大鼠较Dgal组寻台时间显著延长（P＜0.05），血清SOD活性显著降低（P＜0.05），心、肝组织MDA、LPF含量显著提高（P＜0.05，P＜0.01），心、肝MDA、LPF含量与血清SOD活性呈负相关。结论 慢性愤怒应激可降低衰老大鼠的学习记忆能力，加速衰老进程。抑制机体抗氧化能力，加重心、肝等重要脏器组织脂质过氧化可能是其机制之一。
【关键词】 愤怒应激；衰老；学习记忆能力；脂质过氧化
随着生活节奏加快、社会竞争激烈，人们的心理冲突逐渐增多，情绪调节不良对生命过程的影响受到关注。中医学认为，肝主疏泄，调畅全身气机，是情志调节的核心。那么，情志内伤对机体衰老进程有无影响？其机制如何？愤怒是负性情绪的核心，对个体及社会的危害尤为突出，许多重大的身心疾病可以追溯到情绪的长期愤愤不平。本研究从愤怒入手，选择氧化与抗氧化指标探讨慢性愤怒应激对大鼠衰老进程的影响及其部分机制。
1 材料与方法
1.1 实验仪器与试剂
TU1901双光束紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Morris水迷宫（参照文献〔1〕自制）；D半乳糖（Dgalactose，Dgal）（生物工程上海有限公司提供）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、脂褐素（LPF）测定试剂盒（均由南京建成生物工程研究所提供）。
1.2 动物及分组
清洁级3月龄Wistar雄性大鼠48只（河北医科大学实验动物中心提供），体重为（270±10）g。按体重随机分为3组：正常对照组10只，Dgal组和愤怒Dgal组各12只（长期激惹打斗可致大鼠死亡），剩余14只作为入侵鼠（长期夹尾刺激可致大鼠尾部损伤），各组分笼饲养，自由饮食。
1.3 Dgal模型制备
按李文彬等〔2〕Dgal衰老和脑老化造模方法。Dgal组和愤怒Dgal组大鼠自实验开始即给予Dgal，行亚急性衰老及脑老化造模。Dgal 0.1 g·kg-1·d-1连续颈后部皮下多点注射6 w，正常对照组注射同体积生理盐水。
1.4 慢性愤怒应激引入
参照顾立刚〔3〕等夹尾间接激怒法通过改良引入长期愤怒应激。具体方法如下：自第3周开始每日下午3：00，将愤怒Dgal组大鼠单独放入代谢笼内，另外随机放进1只入侵鼠，用纱布包裹止血钳钳夹入侵鼠鼠尾，入侵鼠被激惹，对愤怒Dgal组大鼠发起攻击，双方互相对峙、打斗甚至撕咬，产生愤怒心理和行为，每日刺激时间为20 min，连续4 w。最后入侵鼠丢弃不用。
1.5 Morris水迷宫测试
参照李文彬〔2〕等实验方法，第37天开始进行空间学习记忆能力测试，为期6 d。
1.6 SOD、MDA、LPF检测
实验至第43天，停药、禁食24 h，称重，摘眼球取血4～5 ml，静置、离心，吸取上层血清，－80℃保存，用于测定血清SOD活性。然后用脱颈椎法处死大鼠，迅速解剖动物，摘取心脏、肝右叶置于－80℃冰箱保存，用于检测心、肝组织匀浆MDA、LPF含量。血清SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法；心、肝组织匀浆MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法；心、肝组织匀浆LPF含量测定采用荧光法，均依照试剂盒说明书步骤进行检测。
1.7 统计学分析
采用SPSS13.0统计分析软件进行处理。数据资料应用x±s表示。数值变量组间均数差异的比较，服从正态分布和方差齐采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)，两两比较用最小显著差(LSD)法。以SOD为因变量，心、肝MDA、LPF为自变量进行Logistic回归分析。
2 结果
2.1 慢性愤怒应激对衰老大鼠空间学习记忆能力的影响
正常对照组寻台时间(SPL)为(8.07±2.28) s，Dgal组SPL为(16.29±6.04) s与Dgal组相比，愤怒Dgal组大鼠SPL〔(23.21±9.48) s〕明显延长，组间比较差异显著（P＜0.05）。
2.2 愤怒应激对衰老大鼠血清SOD活性及心、肝组织MDA、LPF含量的影响
与Dgal组相比，愤怒Dgal组大鼠血清SOD活性显著降低（P＜0.05），心、肝组织MDA和LPF含量显著增高（P＜0.05，P＜0.01），见表1。表1 各组大鼠血清SOD活性及心、肝组织MDA、LPF含量比较(略)
2.3 各组大鼠心、肝组织MDA、LPF含量与血清SOD活性的相关性分析 大鼠心、肝组织MDA、LPF含量与血清SOD活性呈负相关，见表2。表2 心、肝组织MDA、LPF含量与血清SOD活性的相关性（略）
3 讨论
衰老发生机制的自由基损伤学说于1956年由Denham首先提出，认为衰老是由于自由基损伤及其诱发的脂质过氧化造成的。SOD是氧自由基的专一清除剂，在一定程度上具有防止衰老的作用。MDA是脂质过氧化终产物之一，其含量反映氧自由基水平和过氧化反应的强度和速率，是了解自由基导致机体组织细胞损伤程度的重要指标。MDA及其复合物被溶酶体吞噬后形成的残余物质累积形成LPF，使细胞结构呈退行性改变，加速细胞老化过程。
衰老动物模型的建立是衰老病因病机研究的基础，Dgal模型属于衰老的氧自由基模型〔4，5〕，目前国内外多采用此方法建立大鼠衰老模型〔6，7〕。本课题组利用此模型对不同治法的抗氧化能力进行了比较研究，发现长期给予Dgal的确可使小鼠SOD活性下降，过氧化反应增强，脂质过氧化物增多而发生拟老化效应。益气健脾方药和益气健脾祛痰化瘀方药均能明显提高SOD活性、减少MDA和LPF含量，缓解氧应激状态〔8，9〕。
一般认为，Morris水迷宫测试对年龄相关性空间记忆损害有可靠的敏感性，是判断空间学习记忆能力的有力工具〔1〕。本实验Morris水迷宫测试结果显示：与Dgal组相比，愤怒Dgal组大鼠SPL明显延长。表明慢性愤怒应激可降低衰老大鼠的学习记忆等认知能力，加速衰老进程。
为揭示慢性愤怒应激加速衰老进程的可能机制，本研究关注大鼠的脂质过氧化和抗氧化功能，实验结果显示：持续愤怒应激可使Dgal衰老大鼠血清SOD活性降低，心、肝组织MDA、LPF含量升高，并且心、肝MDA、LPF含量与血清SOD活性呈负相关。提示慢性愤怒应激可诱发机体重要脏器脂质过氧化、抑制机体抗氧化能力，这可能是慢性愤怒应激加速衰老进程的机制之一。同时，临床检测血清SOD活性可用于评价全身抗氧化功能状态，并有助于推测心、肝等重要脏器的脂质过氧化水平。
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第12篇
[关键词]黄酒多酚；同型半胱氨酸；血管平滑肌；平滑肌细胞表型转换
中图分类号：R54文献标识码：A文章编号：1009_816X（2016）02_0104_05
doi：103969/jissn1009_816x20160208Inhibition on Homocysteine_induced_transformation of Rat Aortic Vascular Smooth Muscle Cells Phenotype by Yellow Rice Wine Polyphenols WU Qiu_de， GUO Hang_yuan， MENG Li_ping， et al Xidian Township Hostipal of Ninghai Country， Zhejiang 315600， China
[Abstract] Objective To verify the inhibition of yellow wine polyphenols on homocysteine（Hcy）_induced_transformation of rat aortic vascular smooth muscle cells（VSMCs） phenotype Methods Rat VSMCs in primary culture were identificated， and VSMCs in passage 4_7 were used for the following experiments The VSMCs were divided into 5 groups： control group， Hcy （100umol/L ） modulation group， Hcy+polyphenols modulation group， Hcy+alcohol modulation group， Hcy + yellow wine modulation group MTT were used to investigate the proliferation of VSMCs Transwell chambers and wound healing were employed to test the migratory ability of VSMCs ICC were used to detect the VSMCs’ morphology structure Western blotting were used to investigate the expressions of SM_actin， SM_MHC， Calponin and OPN in VSMCs of every group Results Compared with control group， the proliferation and migration ability of VSMCs were significantly increased in the Hcy modulation group （P
[Key words] Yellow wine polyphenol； Hcy； VSMCs； Smooth muscle cell phenotype transformation
血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和迁移是动脉粥样硬化（AS）发展过程中重要的病理基础，也是造成支架植入或冠状动脉搭桥术后血管再狭窄的重要原因。最近研究显示血管平滑肌细胞在不同的分化阶段有不同的细胞表型，不同表型之间的平滑肌细胞生理特性相差巨大，并且在外界因素发生变化时，VSMCs不同表型之间可以相互转化。正常血管中的VSMCs一般是已分化的“收缩型”平滑肌细胞，在血管受到损伤时，一些已分化的“收缩型”VSMCs可以去分化成为“分泌型”细胞。“收缩型”VSMCs低增殖，低分泌，特异性表达平滑肌肌动蛋白（SMA）、calponin、平滑肌肌动蛋白主要组织相容性复合体（SM_MHC）等具有标志意义的特征性蛋白，“分泌型”VSMCs增殖加快，细胞外基质分泌增加，表达“收缩型”细胞所没有的骨桥蛋白（osteopontin，OPN）。现在大量的研究结果显示在粥样斑块中，“收缩型”的VSMCs减少，“分泌型”的VSMCs增多。同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是目前公认的冠状动脉粥样硬化的独立危险因素，我们前期的实验已经证实Hcy可以增强VSMCs的增殖和迁移，诱导VSMCs大量分泌基质金属蛋白酶（matrix Metalloproteinases，MMPs）等影响细胞外基质动态平衡的蛋白酶。国内王生兰等也通过试验证实Hcy可以促进大鼠血管平滑肌细胞的增殖和表型转化。过去的研究结果显示少量引用低浓度的黄酒可以显著减少LDLR-/-小鼠主动脉内粥样硬化斑块的面积，低浓度的黄酒还可以抑制大鼠血管内皮细胞和血管平滑肌细胞分泌MMP2。国外的大量研究已经证实红酒中主要是多酚类物质具有AS的作用，所以我们推测黄酒中的多酚类物质也具有抗AS的作用。
1材料与方法
11材料：（1）实验动物：SPF级SD大鼠，雌雄不限，50天左右，体重150g～180g（购自浙江省医学科学院实验动物中心）。（2）实验试剂：黄酒多酚（上海中药制药技术有限公司，国家中药制药工程技术研究中心），乙醚、甲醇、75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、甲醇（杭州化学试剂有限公司）、DMEM高糖培养基、PBS、025%胰蛋白酶_EDTA、青霉素和链霉素（杭州吉诺公司）、同型半胱氨酸（Sigma公司）、胎牛血清（GIBCO公司）、MTT（Emresco公司）、DAPI（Rcohe公司）、兔抗大鼠SM_actin单克隆抗体、兔抗Calponin、SM_MHC、OPN多克隆抗体（ABCOM公司）、辣根过氧化酶标记的山羊抗兔或者抗鼠二抗、FITC、FRITC标记的山羊抗兔IGg（jackson公司）、蛋白免疫印迹以及明胶酶谱相关试剂（江苏碧云天生物技术研究所）。
12VSMC原代细胞培养以及鉴定：采用组织贴块法培育大鼠胸主动脉VSMCs，采用形态学观察和细胞免疫荧光检测SMA鉴定VSMCs，通过SMA与DAPI核染之间的关系鉴定VSMCs的纯度。取第4～7代细胞用于后续实验，实验中细胞加干预因素时用含25%胎牛血清的培养基。
13分组及干预：细胞实验分为5组，分别为空白组（不加任何干预因素），Hcy组（浓度为100μmol/L，以001%DMSO为溶剂），黄酒多酚组（100μmol/L Hcy+50mg/L黄酒多酚，以001%DMSO为溶剂），酒精组（100μmol/L Hcy+15%酒精），黄酒组（100μmol/L Hcy+黄酒）。国内外文献报道DMSO终浓度
14MTT法测VSMCs增殖：取4～7代培养细胞，025%胰蛋白酶消化单层VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基配成细胞悬液并计数，以每孔6×103个细胞接种于96孔培养板中。待细胞贴壁后，无血清培养基培养24小时使细胞同步化。各组细胞按上述分组加入对应浓度的干预因子，每组设3个复孔，2个不加细胞的空白对照孔。细胞于37℃、5% CO2孵箱培养24小时、48小时和72小时。培养结束，每孔加入MTT液20μL，37℃继续孵育4～6小时，终止培养，小心弃去培养上清，每孔加入150μL DMSO，震荡10分钟，选择490nm波长于酶联免疫检测仪测定各孔吸光值并记录。以时间为横轴，吸光值为纵轴绘制VSMCs生长表。
15细胞划痕实验测VSMCs迁移：取4～7代培养细胞，025%胰蛋白酶消化单层VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基配成细胞悬液并计数，以每孔105个细胞接种于6孔培养板中，每孔体积2mL。细胞铺满板底后，无血清培养基培养24小时使细胞同步化，加入18mmol/L羟基脲作用12h抑制细胞增殖，用100μl黄色枪头垂直于孔板制造细胞划痕，吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入各组相应的干预因子，拍照记录0、12、24、48、72、96小时图片，用image pro plus60分析计算出细胞迁移的面积（划痕面积减去迁移后细胞之间剩余面积），细胞迁移的面积与最开始的划痕面积之间的比值来表示迁移的多少。
16Transwell法测VSMCs迁移：取4～7代VSMCs，血清饥饿使细胞同步化，加入18mmol/L羟基脲作用12h抑制细胞增殖，025%胰蛋白酶消化单层VSMCs，用含有各组干预因子的DMEM高糖培养基（无血清）配成细胞悬液并计数（3×104个/ml）。各组24孔板配套的Transwell小室（08μm）上室加入200μl细胞悬液，下室加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基500μl，分别培养4小时、8小时、12小时、24小时、48小时。干预结束后以棉签轻轻擦去上层未穿透膜的VSMCs，取下Transwell半透膜，TBS洗涤3次，37%多聚甲醛室温固定5min，流水冲洗后，用2μg/ml的DAPI染核，PBS冲洗后，荧光显微镜下随机每组取5个视野计数穿膜细胞数并记录。
17细胞免疫荧光法检测各组中SM_actin在细胞中的分布及表达：将第4～7代细胞接种于96孔板，每孔3000～5000个细胞，待细胞贴壁后加入各组干预因子，在细胞融合之前进行检测。先PBS洗三遍，用4%多聚甲醛固定，025%Triton X 100穿破细胞膜，山羊血清室温封闭1h，加入稀释了250倍的anti_SMA抗体，4℃过夜，PBST清洗三遍之后加入结合有FICT或者FRICT的山羊抗兔二抗，室温孵育一小时后PBST清洗三遍，荧光显微镜拍照后图片用iamge pro plus 60分析。
18Western blot测定VSMCs中SM_actin、calponin、OPN的表达：各个干预因子干预48小时之后，裂解VSMCs提取蛋白，BCA法蛋白定量，SDS_PAGE胶每孔加入20μl样品，80V 30min进行蛋白浓聚，120V 2小时进行凝胶电泳，并用孔径045μm硝酸纤维素膜250mA 90min进行转膜。转膜完毕经常温下TBST洗膜x3、脱脂奶粉封闭2小时后，以1：1000浓度加入兔抗鼠SM_actin一抗（或抗calponin、SM_MHC、OPN、β_actin一抗），4℃孵育过夜，常温下TBST洗膜x3，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育后ECL化学发光法检测目标蛋白和内参。暗室柯达胶片显影，Quantity one软件定量分析。
19统计学处理：用SPSS200统计软件分析数据。实验数据以（x-±s）表示，多组均数比较用单因素方差分析，组间比较采用LSD法，P
2结果
21VSMCs原代培养及鉴定：用组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs，大概8天左右组织块周围有细胞爬出，两周左右细胞融合可以传代。传代后细胞呈典型“峰谷”状排列生长，用SM_actin细胞免疫荧光鉴定VSMCs，DAPI核染之后确定细胞纯度在99%以上，见图1。图1大鼠主动脉VSMCs形态学（×100）以及细胞免疫荧光鉴定（×400）22黄酒多酚和黄酒抑制Hcy诱导的VSMCs增殖：在加入各组干预因素后，12小时和24小时时各组OD值没有明显区别。相比于空白对照组，48小时之后Hcy组OD值明显升高（P
26Western blot检测各组细胞中SM_actin、calponin、SM_MHC、OPN的表达情况：各组VSMCs中SM_actin的表达量没有显著差异，相比于空白组，Hcy组VSMCs中OPN表达增加（P
在不同的外界因素影响下，VSMCs具有不同的细胞表型，具有很强的可塑性。在正常血管中膜中的VSMCs是一种高分化的细胞，细胞呈梭形，主要起维持血管形状和收缩血管的作用，具有低增殖、低迁移、低蛋白分泌等特征；当发生动脉粥样硬化等血管疾病时，VSMCs可以去分化为未分化的细胞，形态变圆，细胞收缩性能下降，表现出高增殖、高迁移、高蛋白分泌等特征。过去的观点是将VSMCs细胞表型单纯的分为“收缩型”和“分泌型”两种表型，现在大量的研究已经证实，在不同强度的外界因素作用下，VSMCs去分化的程度不同，可表现出各种介于“收缩”型与“分泌”型之间的细胞表型特征，从而在很多血管疾病的发生发展中发挥重要的作用。
自从1979年Chamley等第一次发现平滑肌细胞具有不同的细胞表型以来，目前已经发现了一大批特异性比较高的可以作为已分化成熟VSMCs标志的蛋白，比如与细胞收缩密切相关的SM_actin、calponin、SM_MHC、SM22α、smoothelin等蛋白以及参与细胞骨架构成的h_caldesmon、β_vinculin、telokin、metavinculin、desmin等蛋白。这些蛋白在分化成熟的VSMCs中表达，其表达量随着平滑肌细胞的去分化而逐渐减少，相反，最近的研究发现OPN和糖基质蛋白在去分化的VSMCs中开始表达，并且表达量跟细胞的去分化程度呈正相关。通过检测SMα_actin、SM_MHC、calponin、OPN等蛋白的表达情况是近几年来国内外研究者常用的鉴别VSMCs不同细胞表型的方法。
随着“法国悖论”以及“地中海饮食”等概念的提出，国内外大量的研究都证实规律适量的饮用红酒具有心血管保护作用并且已经阐明红酒的心血管保护作用主要是由于其中的多酚类成分。红酒多酚主要由儿茶素、花青素、白藜芦醇等组成，通过改善血管功能、调节血脂、调节特异性Micro RNA、抑制VSMCs增殖和迁移等作用而发挥心血管保护作用。绍兴黄酒由糯米发酵而成，也富含儿茶素、没食子酸等多酚类物质，我们前期的动物试验已经证实黄酒多酚具有抑制高脂饮食小鼠AS的作用和抑制Hcy诱导的VSMCs高表达MMPs等影响细胞外基质平衡的蛋白。在本实验中，我们进一步证明黄酒多酚具有抑制Hcy诱导的VSMCs表型转化的作用，这可能是多酚具有抗动脉粥样硬化作用的另一机制。
参考文献
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第13篇
懵懂的新学期
开学第一周的第一天，我错过了每个学年统一分发的学年计划书，其中包括老师的时间表、学习计划、作业计划等等。这个计划书对于大一的新生是很有帮助的：合理利用这本计划书能很好的规划学生自己的学习和工作时间，做到工作学习两不耽误。
我犯的第二个错误是居然忘记使用学校的BREO系统。以我们学校为例，你所选择的课程、老师授课的通知、交作业的通知、考试的通知以及授课老师的联系方式等等一些有关日常学习的信息资料，都可以在这个BREO网站上找到。
万事开头难
正式上课的第一周是漫长而又痛苦的，对我这个全年级唯一的中国学生来说，没有一个同胞可以进行课外的交流实在是极其郁闷的一件事情。
上课时我使劲儿跟着老师的英语发音走。英国本土学生口若悬河，可我脑子却还在慢慢进行中英文切换。我的切换速度明显比别人晚三秒。刚刚明白上一句的意思，下一句就来了。这时候开始狂佩服作同声传译的前辈，他们可真厉害!
老师冷不丁问个问题，自己还要反应个两秒钟，然后用紧张到结巴的英语回答，回答完立马反应过来，其中有个语法错误！令自己羞愧个五分钟!基本上我第一个学期的前3个月就是在这种纠结的心情中度过的。
回想一下，不知道我有没有把“害羞的中国人”这个概念在英国本土同学中发扬光大，实在是自责。
前车之鉴
学期末往往是交作业的高峰时期，学校收作业的机构在Student Centre一层。老师往往在deadline前8周或者新学期开始时就布置好了作业。即便如此，绝对还是有超过五成的不分肤色种族的同学们把作业压到deadline那一天交卷。还有三成同学绝对在Student Centre下午4点半关门前半个小时之内杀到现场，然后排起一个长长的队伍，离远看那排队的架势，不像是交作业，倒像是排队买超市特价打折商品。
还有小于一成的倒霉蛋在交作业的前一天去写老师布置的功课，没日没夜辛苦熬了20多个小时，把眼睛都累成熊猫了，终于在4点半之前把还烫手的散发着墨香的作业打印完成，一路狂奔赶到Student Centre。
第14篇
【关键词】 免疫 肝损伤 淋巴细胞亚群 大蒜多糖C 流式细胞术
Abstract：ObjectiveTo observe the changes of lymphocyte subsets in the peripheral blood of mice with immunological liver injury and intervention of Garlic Polysaccharide C. MethodsThe animal immunological liver damage model was reproduced by injection via the tail vein of BCG (Bacilli Calmette Guein)and lipopolysaccharide(LPS) into mice．The peripheral-blood lymphocyte subsets' percentages and the CD4+/CD8+ ratio was measured by the flow cytometry.ResultsCompared with normal control group， the percentages of the T lymphocyte and the CD8+ T lymphocyte in the peripheral-blood in immunological liver damage mice siginificantly increased（P< 0.01），however， the percentages of the B lymphocyte， CD4+T lymphocyte and the ratio of CD4+/CD8+ decreased(P
Key words：Immunity; Liver injury； Lymphocyte subset； Garlic polysaccharide C； Flow cytometry
病毒性肝炎的损害与机体的免疫应答有密切的关系［1］。卡介苗联合脂多糖(BCG+LPS)诱导的免疫性肝损伤是研究病毒性肝炎发病机制及药物防治的有效实验模型［2，3］，此模型中小鼠外周血淋巴细胞亚群的变化特征尚无定论。 大蒜药食同源，近来我们从大蒜球根中提取分离出新的安全低毒有效成分大蒜多糖C，并证实大蒜多糖C在体外有抗乙型肝炎病毒作用，对四氯化碳所致化学性及BCG+ LPS诱导的免疫性肝损伤小鼠肝功能均具保护性作用［3～5］。为此，本研究则进一步观察BCG+LPS免疫性肝损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群变化并研究大蒜多糖C的干预作用，以探讨大蒜多糖C护肝作用的相关免疫机制，寻求有效的抗病毒性肝炎药物。
1 材料和方法
1.1 主要药品及试剂大蒜多糖C：参照文献方法提取及纯化，纯度为92.3％［3～5］。卡介苗（BCG）活菌：兰州生物制品研究所产品，冻干粉剂，批号：20020501，使用前用灭菌生理盐水配制成1％的溶液。脂多糖（LPS）: SIGMA公司产品。小鼠单克隆抗体: FITC标记CD3试剂、PE标记CD19试剂、PE标记CD4试剂、PE标记CD8试剂以及相应同型对照，均为Caltag公司产品。流式鞘液及溶血剂（Immuno-Prep）均由Beckman Coulter公司提供。
1.2 动物与仪器健康雄性昆明小鼠，体重22～25g，由湖北医学科学院提供，适应1周后开始实验。主要仪器：美国Beckman Coulter公司 EPACS XL流式细胞仪。
1.3 动物模型、分组、标本采集及制备采用卡介苗（BCG）加脂多糖（LPS）诱发的小鼠免疫性肝损伤模型，即小鼠先尾静脉注射1% BCG活菌2 mg/只致敏，12 d后再尾静脉注射微量LPS（4μg/只）诱导肝损伤。小鼠随机分为正常对照组、免疫性肝损伤模型组、大蒜多糖C治疗组(800 mg/kg ig，qd×12)，每组20只。实验第1天，模型组及大蒜多糖C治疗组每只小鼠尾静脉注射1% BCG溶液2 mg即0.2 ml，正常对照组尾静脉注射生理盐水(0.2 ml/只)。次日起，正常组和模型组ig生理盐水qd×12；大蒜多糖C组 ig 800 mg/kg qd×12。末次给药后，模型组、大蒜多糖C治疗组每只小鼠尾静脉注射LPS 4 μg，正常对照组给予等容积无菌生理盐水。12 h后，小鼠摘眼球取血，收集于肝素抗凝管中备测。
1.4 外周血淋巴细胞亚群比值测定应用流式细胞术检测。采用淋巴细胞亚群双色分析方案，按照仪器和检测试剂说明书进行。取待测肝素抗凝血样本100 μl，分别加入相应抗小鼠抗体或同型IgG对照10 μl，室温避光孵育20 min，加入溶血素溶解红细胞后，1 000 r/min，离心5 min，弃上清液，用1ml 0.001M的PBS重新悬浮细胞，200目过滤网过滤样本后上机检测。
1.5 统计学分析实验数据以均数±标准差（ ±s）表示，两组间比较用t检验。
2 结果
结果见表1。与正常对照组相比，模型组T淋巴细胞、CD8+T细胞百分比值明显升高（P< 0.01），B淋巴细胞百分比值、CD4+/CD8+比值明显下降（P< 0.01），CD4+T细胞百分比值也有减少（P< 0.05），NK1.1+T细胞百分比值无显著变化。大蒜多糖C治疗组T，B，CD4+T，CD8+T淋巴细胞百分比较模型组均明显下降（P< 0.01），甚至低于正常组水平（P< 0.05或P
表1 大蒜多糖C对小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响（略）
与对照组比较，*P＜ 0.05， **P＜ 0.01； 与模型组比较，##P＜ 0.01；n=10
3 讨论
淋巴细胞是存在于体内的一种单核细胞，是机体免疫系统的主要构成成分之一。根据细胞功能不同，淋巴细胞主要分为T淋巴细胞（CD+3）和B淋巴细胞(CD+19)两大类，T淋巴细胞主要介导细胞免疫，B淋巴细胞主要介导体液免疫。其中T淋巴细胞又可分为CD4+、CD8+和NK1.1+ T淋巴细胞。CD4+T淋巴细胞主要由辅T淋巴细胞（Th）构成，其功能在于协助T、B淋巴细胞、MΦ分泌细胞因子、产生免疫应答。CD8+T淋巴细胞主要由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构成，作为效应细胞分泌细胞因子产生细胞毒性作用杀伤靶细胞。NK1.1+ T淋巴细胞是新近发现的一群细胞，现认为，NK1.1+ T淋巴细胞在防止自身免疫性疾病、控制感染及抗肿瘤免疫等方面均可发挥作用。各种T淋巴细胞之间相互影响、相互调节，保持CD4+/CD8+比值相对稳定，维持机体正常的免疫功能。淋巴细胞亚群的比例上升或下降，反映机体免疫功能发生相应变化。CD4+/CD8+比值发生变化说明机体的免疫状态失衡。
BCG联合LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤模型类似于人病毒性肝炎的急性或亚急性损伤过程，是研究病毒性肝炎较理想的模型［2，3，6］。该模型是巨噬细胞（MΦ）介导的免疫性肝损伤， 激活的MΦ能释放INF-γ，IL-1α，IL-6以及IL-8等多种细胞因子，刺激T淋巴细胞增殖、分化，并增强其功能。活化的T淋巴细胞和INF-α等细胞因子一起作用于肝细胞，发挥免疫功能产生损伤。 我们在前期研究中已经发现，大蒜多糖C对免疫性肝损伤小鼠有保护性作用，在较大剂量（800 mg/kg）时更为明显［3］，因而本部分实验也采用此剂量，进一步观察外周血淋巴细胞亚群的变化。 实验结果显示，BCG+LPS模型组小鼠CD8+ T淋巴细胞比例明显上升，这种变化导致了T淋巴细胞比例上升和B淋巴细胞比例相对性下降，CD4+/CD8+比值更是明显下降；表明该模型中小鼠免疫功能的平衡状态被打破，CTL大量增生，产生细胞毒性作用，杀伤大量正常肝细胞。在造模同时，连续给予大蒜多糖C 800 mg/kg灌胃12 d治疗后，小鼠各淋巴细胞亚群比例均下降，但CD4+/CD8+比值恢复正常；表明大蒜多糖C全面抑制BCG+LPS肝损伤小鼠机体免疫功能的过度激活，包括体液免疫和细胞免疫，阻止各种淋巴细胞增生，使其保持在较低水平，而且建立了新的免疫平衡。这种低水平的免疫平衡有两个好处: 一方面机体免疫功能受到抑制，减轻了免疫应答对正常肝细胞的损害，阻断肝损伤的进一步发展，发挥保护肝功能的作用；另一方面纠正了失衡的免疫状态，建立新的免疫平衡，有助于机体整体恢复，促进肝功能恢复。
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第15篇
作者：王莹 杜克莘 施京红 谢雯
【摘要】 目的：观察海洛因暴露对小鼠成瘾和学习记忆相关脑区的磷酸化p38 MAPK（pp38）表达的影响，探讨p38 MAPK细胞信号转导通路是否参与了发育早期海洛因暴露引起子代脑发育损伤的分子机制. 方法： 于胚胎鼠龄9～18 d时给孕鼠皮下注射海洛因10 mg/(kg·d)，建立子宫内海洛因暴露的小鼠模型. 按出生前处理将小鼠分为海洛因和盐水组. 蛋白免疫印迹检测两组小鼠前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核脑区pp38的表达改变. 结果： 与盐水组相比，海洛因组小鼠的pp38蛋白表达在前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核4个脑区均有明显增加( P< 0.05). 结论： 海洛因暴露可引起小鼠前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核脑区的pp38 MAPK蛋白表达上调，提示p38 MAPK信号通路可能参与了海洛因损伤小鼠神经发育的分子机制.
【关键词】 海洛因；p38丝裂原活化蛋白激酶；前额叶皮层；海马；伏核；杏仁核
0引言
近年来，女性滥用者增多，且大多属于育龄期妇女［1-2］. 研究表明，子宫内海洛因暴露不但可引起新生儿宫内窘迫和发育迟缓，还可导致子代成年后长期的认知行为缺陷和社会行为障碍［3-4］，但其细胞、分子机制未完全阐明. p38是MAPK(mitogenacti vated protein kinase) 超家族的重要成员之一，属于应激活化激酶，p38 MAPK不但与其他信号传递途径共同介导细胞应激诱发的基因表达和酶活性的改变，还在细胞凋亡、细胞因子的合成释放、细胞骨架重排等机制中发挥重要作用［5-6］. 本研究旨在探讨p38 MAPK 通路是否参与了海洛因导致后代神经、行为异常的机制.
1材料和方法
1.1材料标准品海洛因（heroin），学名二乙酰吗啡，纯度98.5%，由中国药品生物制品检定所（国家麻醉品实验室）提供，批号171206-200614. 兔抗鼠磷酸化p38 MAPK mAb，山羊抗βactin pAb （美国Cell Signalling 公司）；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔或山羊二抗（博奥森公司）；ECL化学发光试剂盒、PVDF 膜及Hyperfilm 胶片（德国Merck 公司）；蛋白质提取及浓度测定试剂盒（美国BioRad 公司）. FS600超声波粉碎仪(上海生析超声仪器有限公司)；离心机（德国Eppendorf公司）；电泳仪（德国Whatman Biometra公司）；紫外成像扫描仪及分析系统（美国BioRad公司）.
1.2方法
1.2.1动物分组及模型建立选健康活泼BALB/c 小鼠60只(第四军医大学实验动物中心)，雌雄各半，2 mo龄，体质量(25±5)g. 自由饮食饮水，昼夜12 h交替光照，室温25℃，湿度60% 左右. 每日21∶00 雌雄合笼，次日晨查精栓或阴道涂片，以精栓或阴道涂片查到做为受精标志，记为E0d. 将体质量相近的实验动物随机分为海洛因组和盐水组. 从E0～E8 各组动物自由进食， E9～E18 d，盐水组于21∶00在小鼠大腿外侧皮下注射生理盐水20 mL/（kg·d），1/d，海洛因组组给予海洛因10 mg/（kg·d） 注射，1/d，将药物溶于生理盐水中，0.5 g/L. 子代分组同亲代孕鼠.
1.2.2蛋白印迹实验仔鼠30 d龄时在各脑区取材，0.16 mol/L戊巴比妥钠腹腔麻醉，速断头、开颅、分离各脑区，即刻入液氮，冻存管分装，-80℃贮存. 用时加入4℃胞质蛋白提取液裂解，20∶1 加入蛋白酶抑制剂PMSF，高速分散器组织匀浆，冰浴1 h，12000 g 4℃离心10 min，沉淀加入4℃预冷核蛋白提取液，震荡混匀，冰浴1 h，再12000 g 4℃离心30 min，取上清为核蛋白，其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量，取上清加等体积2×SDS 样品缓冲液，煮沸5 min 使蛋白变性. 取50 μg待测蛋白加入等体积2×上样缓冲液煮沸5 min，行SDSPAGE 电泳，蛋白半干转至PVDF膜. 100 V 恒压转移2 h后，将PVDF 膜在含5%脱脂奶粉的TBST中室温下封闭1 h，与1∶1000一抗pp38 MAPK 兔多抗4℃孵育过夜，PBST 缓冲液洗膜3次，每次10 min；随后加入羊抗兔 IgGHRP 37℃孵育1 h，洗膜3次，每次10 min. ECL化学发光试剂显影，胶片曝光，UVP 凝胶成像系统扫描目的条带，Labworks 软件测量各阳性条带的光密度，将pp38 MAPK阳性条带与相应的βactin 条带吸光度比值作为其蛋白的相对表达量.
统计学处理：所有数据均采用SPSS12.0进行处理，多样本均数比较采用单因素方差分析.
2结果
分析各组间相应蛋白带的平均吸光度值，以βactin作内参蛋白，调整后进行半定量分析. 与盐水组相比，海洛因组动物的前额叶皮层、海马、伏核和杏仁核4个脑区组织的p38 MAPK磷酸化蛋白表达均明显增加（P< 0.05，图1，2）.
3讨论
MAPK信号系统作为真核细胞内各种信息传递的最后通路和共同通路，能够将细胞外的各种刺激信息转移到细胞核内，是神经细胞发生一系列可塑性变化的分子基础. p38 MAPK 多见于促炎和促凋亡的途径中，它在细胞分化、凋亡、迁移和增殖等基本生理过程中也发挥着不可忽视的作用［5］，许多细胞外刺激如应激刺激、炎性细胞因子、细胞因子、脂多糖、生长因子等通过细胞内信号转导通路激活p38 MAPK，进而磷酸化激活 MAPK APkinase2 等，并最终激活ATF2，Max 和MEF2 等转录因子而产生生物学效应［6］，但其具体调制及与其他信号通路之间的关系尚未明了.
海洛因暴露导致的行为异常与海洛因作用的时间、时程、剂量和给药方式等有密切关系，作用方式不同可导致的行为学损伤不完全相同. 我们采用的模型已报道动物有成年后迷宫学习记忆行为缺陷［7］，海马胆碱能系统及PKC 细胞学定位的改变［8］. 海洛因可迅速通过胎盘和血脑屏障，直接作用于发育中的神经细胞，导致子代成年后的神经行为损伤，但其细胞、分子机制未完全阐明. 我们的结果显示，发育早期海洛因暴露，上调了小鼠前额叶皮层，海马，伏核，杏仁核脑区中p38 MAPK 磷酸化蛋白的表达，提示在这些与成瘾和学习记忆相关的脑区里，存在着p38 MAPK 信号通路可能参与的生理病理学过程的改变，提示海洛因对子代动物成年后神经行为异常的长期影响，至少是部分源于海洛因在动物的神经系统发育早期，作用于神经行为相关的靶区，使该靶区的神经活动异常或作用于相关基因，使海洛因的致畸作用持续到生后，如海马损伤导致海马依赖的空间学习记忆损伤.
p38 MAPK在疾病发展的不同阶段，发挥的作用有所不同. 在细胞应激反应或炎症反应的早期，p38 上调发挥脑保护作用，但随着反应进程的加深，上调的p38 可以通过加强细胞的炎性反应，介导其他胞外信号引起的炎性细胞因子或炎性产物的表达和释放，以介导凋亡性细胞死亡的方式损伤神经细胞［6， 9］. p38 蛋白在成瘾和学习记忆相关脑区的持续表达上调，是损伤神经发育，或是激发了损伤后的神经代偿机制，需要进一步研究.
我们结果的提示，p38 MAPK 通路可能参与了海洛因对胚胎脑发育的毒性作用，进而影响动物成年后的行为，为进一步探讨子代神经行为的损伤机制及后期临床干预中靶蛋白的确定提供了有意义的资料.
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