结冷胶发酵生产工艺研究范文

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1实验部分

1.1菌种菌种为SphingomonaspaucimobilisNK2000（实验室保藏）。

1.2培养基成分斜面培养基：蔗糖为3%，豆饼粉为0.6%，磷酸二氢钾为0.14%，硫酸镁为0.06%。种子培养基：蛋白胨为1%，牛肉膏为0.1%，葡萄糖为0.5%，氯化钠为0.5%。发酵培养基：蔗糖为3%，豆饼粉为0.6%，磷酸二氢钾为0.14%，硫酸镁为0.06%。

2实验步骤

2.1种子培养活化保藏在冰箱中的菌种，然后将斜面培养基在30±1℃的恒温箱中培养24h。将种子培养基（100mL装于500mL的锥形瓶中）在120℃下杀菌20min，冷却，再用接种环从斜面上取一环放入消过毒的种子培养基中，于30±1℃的恒温室中培养20h，摇床转速为220rpm。

2.2发酵培养取90mL发酵培养基装于500mL锥形瓶中，放入灭菌锅中在120℃下灭菌20min，冷却，取培养20h后的种子培养基10mL于发酵培养基中，于30±1℃的恒温室中培养60h，摇床转速为220rpm。

2.3黏度的测定温度为25℃，取10mL浓度为15g/L结冷胶发酵液置于小烧杯中，使发酵液淹没转子末端，启动转子为4号的旋转黏度仪，转速50r/min，旋转30s读数记录结果。

2.4产胶率的测定称取发酵培养基的重量M，用2-3倍体积的95%乙醇洗涤两次（加入酒精时应慢慢加入，快速搅拌，防止集聚在玻璃棒上的发酵液表面结冷胶萃取出来包裹住中间的发酵液，使萃取不完全），第二次洗涤后放在平稳的地方静置20min，用纱布过滤，得到的粗胶在65℃干燥箱中干燥4h，取出后用天平称量重量为m，产胶率为m/M。

2.5OD值的测定将发酵液稀释适当的倍数，然后用紫外分光光度计测定发酵液的OD640值，根据所得结果适当稀释发酵液浓度使所得OD640值在0.15～1.2之间。

2.6正交实验根据单因素实验选择发酵培养基碳源（蔗糖）、氮源（豆饼粉）和无机盐（硫酸镁和磷酸二氢钾）为正交试验的4个因素，选择3个合适的数值为水平设计正交试验，正交试验表采用L9（34），正交试验的因素和水平如表1所示。每个样品做三个平行样，得出最佳的发酵条件。

3结果与分析

3.1菌种在种子培养基中的生长曲线实验在波长为640nm的条件下进行，根据OD值确定菌种在种子培养基中的生长曲线，如图1所示。根据生长曲线可以发现微生物在各个时间段的生长衰老情况［13］。由图1可知：少动鞘脂单胞菌在种子培养基中的调整期大致为0～10h，对数期大致为10～22h，之后菌种生长基本等于衰老，菌种进入稳定期，这时次级代谢产物开始积累（即结冷胶开始大量积累）。

3.2发酵时间对产胶率的影响由图1菌种在种子培养基中的生长曲线发现22h后菌种进入稳定期。图2所示，24h时已有一部分结冷胶产生，并且发酵液黏度已经很高。随着发酵时间的增加结冷胶不断积累，黏度不断的增高，在60h时发酵液的黏度和产胶率均达到最大值，分别为44744cp和1.4%。之后结冷胶产量和黏度均略微降低是因为菌种开始进入衰老期，有害物质积累过多，不适合菌种进一步生长和产胶。

3.3接种时间对产胶率的影响由图1菌种的生长曲线可以大概确定菌种的对数期，即为最佳的接种时间，实验将接种时间设定在14-26h，由图3看出，当选择接种时间为20h时结冷胶的黏度和产胶率都最高，和前边得到的生长曲线相符合，所以最佳接种时间为20h。20h之前接种产量低是因为此时种子培养基中菌种还较少，接种后发酵培养基中菌种的调整期和对数期较长，延缓正常发酵；20h后接种产量也不高是因为这时种子培养基中有害物质已有一部分积累，不适合菌种生长，20h是菌种活力和有害物质积累的最好的临界点。

3.4装液量对产胶率的影响结冷胶的生产菌种少动鞘脂单胞菌是一种好氧细菌，发酵生产中氧气的含量可以明显的影响结冷胶的产量和黏度。适当的装液量不仅可以有效的利用发酵空间，而且可以使发酵液更好的通气和散热，使菌种在最佳的氧气环境中生长代谢，得到最佳发酵效果［14］。如图4所示，随着装液量的增加，结冷胶产量和黏度都逐渐减少，装液量小于20%时，随着装液量的增加结冷胶的产胶率和黏度变化较小；当装液量大于20%时，随着装液量的增加结冷胶的产量和黏度减小较快。当装液量为10%时，结冷胶的黏度和产胶率都最高，分别为45433cp和1.41%。

3.5接种量对产胶率的影响接种量是影响发酵的一个重要因素，如果接种量太少，菌种进入发酵培养基中会经过较长时间的调整期和对数期，延缓次级代谢产物的积累，不利于发酵效率的提高［15］；如果接种量过多，则会使发酵液中菌种生长繁殖过快，导致营养物质的大量消耗，同时从种子培养基中带来较多代谢垃圾，不利于发酵的正常进行［16-17］，所以接种量的确定对发酵生产有重要的意义。如图5所示，当接种量为10%时结冷胶的黏度和产胶率都最高，分别为44667cp和1.38%。当接种量超过14%时随着接种量的增加，发酵效果明显降低。

3.6发酵温度对产胶率的影响如图6所示，当温度控制在30℃时结冷胶的黏度和产胶率都达到最大值，分别为45333cp和1.4%，发酵的最佳温度为30℃。

3.7初始pH对产胶率的影响发酵液的pH是微生物是否能正常生长和繁殖的重要指标，它可以直接影响微生物细胞内部各种酶的活性强度，只有最佳的pH才能更好的促进细胞内各种反应的正常进行，从而促进少动鞘脂单胞菌次级代谢产物结冷胶的积累［14］。如图7所示，当初始pH为7.2时结冷胶的黏度和产胶率都最高，分别为46000cp和1.41%。最佳初始pH为7.2。

3.8摇床转速对产胶率的影响发酵生产中随着结冷胶的不断生成和积累发酵液的黏度不断的增加，后期发酵液的黏度更是达到40000～50000cp，发酵液中菌种排出的有害气体不能和摇瓶空气中的氧气对流就会很大程度的影响菌种的生长，所以摇床适当的旋转很有必要，但是如果摇床转速过快，剪切力过大就会破坏微生物细胞结构杀死一部分菌种，不适合菌种的正常生长和产胶［18］。如图8所示，选择合适的摇床转速作为实验变量，当转速为220rpm时结冷胶的黏度和产胶率都最高，分别为46167cp和1.39%，摇床最佳转速为220rpm。

3.9正交实验结果分别以蔗糖、豆饼粉、硫酸镁和磷酸二氢钾作为正交试验的4个因数，每种成分选择3个不同添加量为3个水平做3水平4因数的正交试验，如表2所示，影响结冷胶产胶率多少的顺序为RA＞RC＞RB＞RD，所以发酵培养基的最佳配方为A2B3C2D2，即蔗糖为3%，豆饼粉为0.6%，硫酸镁为0.06%，磷酸二氢钾为0.14%。用最佳配方进行发酵培养，60h后测定的发酵液黏度和产胶率分别为44767cp和1.4%。

4结论

综上所述，选择四个对发酵影响较大的因素（温度、pH、摇床转速、接种量），确定三个水平进行正交试验，得出影响发酵强弱的因素为：温度＞pH＞摇床转速＞接种量。最终得出发酵生产的最佳条件为：发酵时间为60h，接种时间为20h，装液量为10%，发酵温度控制在30℃，发酵液初始pH为7.2，摇床转速为220rpm，接种量为10%，并且在这种条件下发酵结冷胶的黏度和产胶率分别为46867cp和1.41%。根据优化后的指标进行3次试验，求得结冷胶黏度和产胶率平均值分别为46878cp和1.416%。可见，优化后的工艺参数值得借鉴。本研究为结冷胶的发酵生产扩大应用提供了有意义的基础参数。

作者：陈强 刘钟栋 白祥 裴延飞 单位：河南工业大学粮油食品学院 佳力士添加剂（海安）有限公司