纳米管触致工人氧化损伤炎症反应研究范文

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摘要：[目的]研究多壁碳纳米管（MWCNTs）职业接触对工人氧化损伤及炎症反应水平的影响，制定职业危害预防策略。[方法]分别选取广东省某MWCNTs生产企业不吸烟的长期接触MWCNTs的工人和不接触职业病危害因素的行政管理人员各40人作为接触组和对照组。对工作场所中MWCNTs浓度进行检测。采集研究对象血样，检测氧化损伤和炎症反应指标并对结果进行分析。[结果]接触组在工作场所及个体接触的MWCNTs浓度分别为（41.5±18.7）μg/m3和（34.4±17.7）μg/m3，均明显高于美国国家职业安全卫生研究所（NIOSH）推荐的容许接触限值（7μg/m3）。接触组8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）、8-异前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素33（IL-33）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、骨桥蛋白（OPN）、嗜酸性粒细胞水平高于对照组，接触组过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平低于对照组，以上差异均有统计学意义（P<0.01或0.05）；两组其他抗氧化指标、炎症反应指标差异无统计学意义（P>0.05）。[结论]高浓度的MWCNTs职业接触可导致工人体内活性氧水平增高，引发机体氧化损伤甚至是细胞脂膜DNA损伤，并可导致部分炎症反应细胞因子和嗜酸性粒细胞水平升高，加重呼吸道炎症反应和哮喘症状，对肺功能造成损害。接触MWCNTs的劳动者应注意加强个人防护。

关键词：多壁碳纳米管；职业接触；氧化损伤；炎症反应；肺功能；呼吸道炎症

碳纳米管（carbonnanotube）是继碳60（C60）之后发现的碳的又一同素异形体，是由单层（单壁碳纳米管，single-walledcarbonnanotubes，SWCNTs）或多层（多壁碳纳米管，multi-walledcarbonnanotubes，MWCNTs）碳原子呈六边形排列而构成的同轴圆管。作为复合材料增强体，MWCNTs强度高、弹性好，表现出良好的抗疲劳性及各向同性，因而在超级电容器、催化器载体、储氢材料、质子交换膜燃料电池等产品的生产中被广泛使用，是目前全球新材料研究的一个热点[1-2]。但有研究表明：MWCNTs颗粒能引起染毒小鼠肺部炎症、肉芽肿、纤维化[3]；另外，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8）等细胞因子均可参与其引起的炎症反应[4]。MWCNTs可诱导细胞反应产生细胞内活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS），引起机体氧化应激[5-7]。然而，上述研究均在体外细胞模型或动物模型中开展，MWCNTs对职业接触人群能否造成氧化损伤及炎症反应，仍须通过职业流行病学研究来验证。为此，作者进行了本项研究。

1对象与方法

1.1对象

研究对象来自广东省某从事碳纳米管开发和生产的高科技企业，该企业拥有约200名员工。粉碎、干燥、反应3个工种的92名工人存在职业性MWCNTs接触，其中反应工种的工人为工作时间8h完全接触，其他2个工种为间歇性接触。从中选择40名长期接触MWCNTs（接触时间不低于2年）的反应工种工人作为接触组，选择该企业不接触职业病危害因素的40名行政管理人员作为对照组，入选对象均无吸烟习惯。接触组男性21名，女性19名，平均年龄（32.6±6.5）岁，接触MWCNTs平均工龄（4.1±3.0）年；对照组男性18名，女性22名，平均年龄（33.1±7.1）岁。两组年龄和性别构成差异均无统计学意义（t年龄=1.168，χ2性别=0.450，P＞0.05）。

1.2方法

1.2.1主要仪器与试剂采用的主要仪器：酶标仪（美国ThermoScientificMultiskan公司）、血细胞全自动分析仪（美国BeckmanCoulter公司）、紫外可见分光光度计（日本Unico公司）、化学发光免疫分析仪（德国RocheDiagnostics公司）；采用的主要试剂：超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）、丙二醛（malonicdialdehyde，MDA）、8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-33、TNF-α及骨桥蛋白（osteopontin，OPN）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，人8异前列腺素F2α（8-epi-prostaglandinF2alpha，8-iso-PGF2α）检测试剂盒购于上海斯信生物科技有限公司，趋化因子C-C-基元配体2（CCL2）检测试剂盒购于上海语纯生物科技有限公司。

1.2.2检测方法（1）工作场所MWCNTs接触水平检测：工作场所MWCNTs接触的定点空气采样和个体接触采样的具体采样步骤和分析方法按照NIOSHMethod5040[8]进行。（2）生物样本采集和处理：采集所有研究对象肘静脉血5mL至EDTA-2K抗凝血管，5mL至促凝血管。采血后4h之内分别分离出血细胞和血清，0.5mL分装并编号后，置-80℃超低温冰箱内保存备用。（3）检测指标与方法：血清SOD、CAT、GSH-Px、MDA采用比色法测定，血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-33、TNF-α、CCL2采用化学发光法检测，血清8-OHdG、8-iso-PGF2α、OPN采用ELISA测定，白细胞及其分类计数采用血细胞全自动分析仪检测。1.2.3统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间差异比较采用独立样本t检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，理论频数不符合χ2检验要求的采用Fisher确切概率法进行检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1工作场所碳纳米管暴露水平检测及防护情况

该公司生产的MWCNTs外直径约80nm。在企业的反应车间，对10个采样点的MWCNTs在空气中的时间加权平均浓度（指质量浓度）进行检测，测得最小值为33.1μg/m3，最大值56.2μg/m3，均值（41.5±18.7）μg/m3；对10名随机选取的工人的个体接触浓度（时间加权平均浓度）进行采样检测，最小值29.6μg/m3，最大值51.8μg/m3，均值（34.4±17.7）μg/m3。工作场所及个体接触的MWCNTs浓度均明显高于美国国家职业安全卫生研究所（NIOSH）根据动物实验结果推荐的容许接触限值（7μg/m3）。作业场所防护通风排毒设施运行正常，所有工人都按要求穿戴防护用品（防护口罩、乳胶手套、防护服）。该公司配发的防护口罩符合美国材料与试验协会（ASTM）的LevelⅢ标准的要求：对小至100nm颗粒物的过滤效率应达到98%以上。工人平均每天工作8h，每月工作26d。

2.2氧化损伤水平检测结果

接触组的3个抗氧化指标超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平均低于对照组，其中CAT和GSH-Px与对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）。接触组的3个氧化损伤指标丙二醛（MDA）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）、8-异前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）水平均高于对照组，其中8-OHdG和8-iso-PGF2α与对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3炎症反应水平检测结果

2.3.1血清炎症反应细胞因子检测结果除CCL2外，接触组7个血清炎症反应细胞因子浓度均高于对照组，其中白细胞介素（IL-6、IL-8、IL-33）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、骨桥蛋白（OPN）浓度与对照组的差异有统计学意义（P<0.01或0.05）。见表2。

2.3.2白细胞及其分类计数除嗜碱性粒细胞（BASO）计数外，接触组白细胞（WBC）总数及其他4种分类白细胞，即淋巴细胞（LYM）、单核细胞（MONO）、中性粒细胞（NEU）、嗜酸性粒细胞（EO）计数均高于对照组，其中EO计数与对照组的差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。

3讨论

作为一种应用越来越广泛的新型材料，碳纳米管的接触人群必将不断扩大。MWCNTs主要经呼吸道进入体内。动物实验发现，MWCNTs进入体内后主要分布于肺脏，其次是肾脏，在肝脏和脾脏内也有少量分布并有蓄积。MWCNTs在体内不易降解，主要通过肝肾代谢排出体外[9]。有研究表明，碳纳米管主要对肺部造成损伤，如肺部炎症、肉芽肿、纤维化等[3]，并增加支气管纤维化，加重哮喘相关病症，如气道高反应性、气道重塑现象以及肺部炎症加重[10]。体外实验发现MWCNTs染毒可致肺巨噬细胞的细胞核变性、核基质减少，染色质浓缩，出现月牙样边界，胞质中出现空泡，这些均为细胞凋亡的表现[3]。近年也有碳纳米管对心血管系统损伤的报道，如主动脉内皮细胞线粒体DNA发生剂量-反应性氧化损伤、血管内血栓形成等[11-12]。然而，这些研究绝大多数在体外细胞模型或动物模型中开展，缺乏人群健康损害的证据。作者曾针对本文涉及的相同研究对象的职业健康检查表明，接触组哮喘发病率（20%）明显高于对照组（2.50%）；接触组咳嗽发生率（22.50%）、咳痰发病率（25.00%）、喘息发病率（20.00%）均高于对照组（分别为5.00%、5.00%、2.50%）；肺功能检查结果显示接触组用力肺活量为（3.38±0.85）L，第1秒用力呼气量为（3.13±0.67）L，均低于对照组[分别为（3.76±0.85）L、（3.49±0.85）L]；以上差异均有统计学意义（P<0.05）。具体参见文献[13]。SOD、CAT、GSH-Px均属于机体重要的抗氧化酶，可有效防止活性氧的损伤效应。MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，可间接反映氧化损伤程度[14]。8-OHdG是活性自由基攻击DNA分子，使鸟嘌呤碱基第8位碳原子羟基化而形成的一种产物，该产物水平增高反映氧化应激对DNA的损伤[15]。8-iso-PGF2α是自由基损害脂质细胞膜多不饱和脂肪酸等脂类后的特异性产物。

它能够选择性地收缩肾脏、冠状动脉、视网膜和肺脏等脏器的血管，并且可放大炎症细胞及炎症介质的作用[16]。本研究结果显示，MWCNTs可诱发机体脂质过氧化反应，可能引起机体过度氧化应激，甚至对细胞脂膜DNA造成损伤。多种细胞因子均可影响炎症进程，IL-6、IL-8、TNF-α的水平升高可有效刺激炎症发生，哮喘患者尤为明显[17]；体外实验表明IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等细胞因子均参与碳纳米管引起的炎症反应[4]。IL-33及其受体ST2可通过调解免疫应答，介导炎症反应的发生，哮喘病人的血清IL-33表达升高[18]。有研究认为MWCNTs能诱导肺上皮细胞分泌IL-33，后者通过与肥大细胞表面ST2受体结合而导致肺部炎症、肉芽肿、纤维化[19]。嗜酸性粒细胞是白细胞的一种，在变态反应性疾病如支气管哮喘、荨麻疹中，患者嗜酸性粒细胞计数明显增高。OPN对嗜酸性粒细胞功能具有趋化和调节作用，诱导嗜酸性粒细胞向气道迁移，促进气道变态反应性炎症的发生，参与哮喘发病[20]。本研究结果表明，接触MWCNTs可提高工人体内某些炎症相关细胞因子的水平，造成气道高反应性，引发以嗜酸性粒细胞增多及浸润为主的慢性气道炎症，加重哮喘症状，并出现肺免疫毒性损伤，从而引起工人肺功能降低。体外实验和动物实验研究结果表明，MWCNTs通过胞吞和扩散等方式进入细胞，刺激细胞释放炎症介质（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-33等），在细胞内提升活性氧（ROS）水平，降低抗氧化剂含量，导致8-OHdG等氧化产物水平升高，对多种细胞系造成氧化损伤和细胞毒效应，引发呼吸道炎症和纤维化[21]。本文研究结果与之一致。值得注意的是，MWCNTs介导的氧化损伤对炎症反应可能起到协同效应，这种协同效应的产生可能与碳纳米管通过直接和间接途径形成的ROS促进NLRP3炎性小体的激活有关[22]。值得注意的是，虽然本次调查对象所处的作业场所通风排毒设施运行正常，所有工人都按要求穿戴防护用品（防护口罩、乳胶手套、防护服），但工人仍受到健康损害。

分析其原因可能有：（1）美国职业安全与卫生管理局规定合成石墨的时间加权平均容许浓度为5mg/m3，石英为0.1mg/m3，美国国家职业安全卫生研究所根据动物实验结果推荐的碳纳米管职业接触限值为7μg/m3，说明碳纳米管的毒性远高于合成石墨、石英。多数碳纳米管生产企业可能对MWCNTs的健康损害了解不够，将MWCNTs归类为合成石墨，仅采用5mg/m3作为接触限值，这在一定程度上反映了对该物质的健康危害缺乏重视。（2）虽然该公司配发的防护口罩是市面上的顶级产品，对小至100nm的颗粒物的过滤效率达99.8%，但该公司生产的MWCNTs外直径约80nm，被人体吸入机会肯定高于0.2%，故工人长期低剂量吸入MWCNTs引起的健康损害不容忽视。目前，国内外已有纳米粉尘防护口罩的发明专利，这类口罩能更有效地阻止纳米粉尘的吸入。综上所述，高浓度的MWCNTs职业接触可导致工人体内ROS水平增高，引发机体氧化损伤甚至是细胞脂膜DNA损伤，并可导致IL-6、IL-8、IL-33、TNF-α、OPN等炎症反应细胞因子和嗜酸性粒细胞水平升高，加重呼吸道炎症反应和哮喘症状，对肺功能造成损害。接触MWCNTs的劳动者应注意加强个人防护，以降低相关健康损害的发生风险。同时，高浓度MWCNTs职业接触背后更细微、更具体的机制（例如通过哪种途径介导的ROS水平升高）仍有待进一步研究。

作者：周金鹏 张方方 黄红英 冯文艇 单位：深圳市职业病防治院