钆基凹凸棒纳米材料的制备范文

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近年来，临床治疗工作对于疾病的及时准确的诊断和病程的监控提出了更高的要求。由于无辐射、软组织分辨率高的特点，使得磁共振成像(MRI)在医学等生命科学领域得到广泛的应用。随着该技术日新月异的优化，其分辨率逐步提高，扫描时间逐渐缩短，对于微小病灶的检测也更加准确。伴随着纳米科技的快速发展，以纳米材料作造影剂或药物载体，在疾病诊断和治疗领域内的突破引起了广泛关注，同时也带来了新的机遇与挑战。T1型造影剂目前主要是以过渡元素或镧系金属的离子为核心形成的螯合物，由于三价的钆(Gd)离子最外层有7个未成对的电子，具有极强的顺磁性，已普遍作为医学磁共振成像诊断的造影剂［6］。但是游离的Gd离子在体内有很高的毒性，因此，常常需要有机配体形成配合物来降低化学毒性，以作为稳定安全的临床制剂。近几年，各种钆基的纳米结构造影剂因其极佳的稳定性、良好的生物相容性和优越的药动学被陆续开发和报道出来。本研究基于纳米级的凹凸棒(ATP)为模板，利用液相合成方法原位载负钆氧化物，制备出凹凸棒-氧化钆复合纳米材料。以实验兔为动物模型，主要考察该纳米材料的体外成像以及在动物活体内的血管成像效果，探究材料在体内的循环代谢过程，从而为该新型纳米制剂的进一步临床研究提供依据。

一、材料

H7650透射电子显微镜(加速电压为100kV，日本Hitachi公司);Super40场发射扫描电子显微镜(德国Zeiss公司)。硝酸钆六水合物(gadolinium(iii)nitrate，Gd(NO)3•6H2O，美国AlfaAesar公司);一缩二乙二醇(diethyleneglycol，DEG)、氢氧化钠、乙醇、戊巴比妥(pentobarbital)购自中国上海国药集团。实验试剂均为分析纯，在使用前未经进一步提纯。凹凸棒由安徽国星生物化学有限公司赠送。普通级实验用雌性新西兰大白兔，购于金陵种兔场，生产许可证:Scxk(苏)2012-0003。

二、方法

1纳米材料ATP-Gd的合成100mgATP溶于15mLDEG中，超声破碎20min，和902．5mg浓度为2mmol的Gd(NO3)3一起加入到50mL的单颈烧瓶中，600r•min－1搅拌过夜。新制2．5mmolNaOH(100mg溶于1mL水中，加入5mLDEG)，搅拌均匀。加入NaOH后，单颈烧瓶在油浴中加热，同时磁子均匀搅拌。140℃加热1．5h后，再升温至180℃加热4h。8000r•min－1离心20min，第1次离心后分散于20mL乙醇，第2次离心后分散于水中，用水离心2次，定容于10mL水中保存。同时取100μL制ICP样，以确定材料内Gd元素的浓度。

2MRI检测将纳米颗粒胶体溶液配成浓度为1，0．75，0．5，0．25，0．125mmol•L－1的4mL体系溶液，装于5mL离心管中。在MRI测试时，所有的样品管均浸泡在水模标准液(NiSO4溶液)中。为了获取较好的成像效果，在扫描中采用膝关节线圈，利用自旋回波序列(SE)对样品进行扫描:重复时间(repetitiontime，TR)为400ms;回波时间(echotime，TE)为8.7ms;扫描视野(fieldofview，FOV)为240mm×240mm;采集矩阵(acquisitionmatrix)为256×233;层厚5mm。普通级实验用新西兰大白兔使用电子秤称重。用3%的戊巴比妥，按照1mL•kg－1的剂量耳缘静脉注射。若3min后兔子未处于深度麻醉状态(可采用眨眼反射评估)，再以0．2mL•kg－1的剂量逐次增加麻药量。大白兔采取仰卧位姿势，四肢向两侧水平展开，并固定于自制的非金属固定架上，在大白兔的前肢静脉上预先留置1个留置针并连接充满造影剂的注射器。扫描前首先把大白兔以头先进的进床方式连同固定架放入头、颈联合线圈中，调整位置至线圈中央，打开扫描仪定位光标，将线圈的中心位置与定位光标重合，然后将扫描床移至磁体扫描孔洞的中心。首先扫描T2WI横断面、冠状面和矢状面的图像，主要的扫描参数为:T2W:TR3500ms，TE:102ms;FOV:155mm×180mm;Matrix:276×320;层厚3mm。然后使用三维扰相梯度回波序列(FLASH3D)扫描大白兔头颈部及胸腹部血管，主要的扫描参数为:TR3．6ms，TE:1．65ms;FOV:210mm×280mm;Matrix:288×512;层厚0．7mm。在注射造影剂前先期扫描1次作为蒙片，随后从前肢皮下静脉注射材料(剂量为10mg•kg－1，流速为1mL•s－1)，材料注射完成后以相同流率团注等量生理盐水冲管，同时开始再次以相同参数的FLASH3D序列扫描，最后对造影前后的图像采用减影处理并导入三维工作站进行最大强度投影(MIP)，得到大白兔血管的三维影像。3统计学分析数据处理采用OriginPro7．5软件分析，数据均以平均值±标准差(x珋±s)表示。

三、结果

1ATP-Gd纳米材料的形貌表征采用电子显微镜观察水相法合成制备的纳米级ATP-Gd的形貌。从扫描电子显微镜(SEM)照片(图1)可以看到，材料的尺寸较为均一，长度为200～800nm，直径为40nm左右;透射电子显微镜(TEM)照片(图2)进一步表明该纳米材料分散性良好，能辨析出以凹凸棒为模板的负载结构，且未见有团聚现象。

2材料的生物安全性分析

以医用生理盐水(normalsaline，NS)及普通纯化水(distilledwater)为阴阳对照组，考察该材料对血液样本的溶血现象。结果见图3，ATP-Gd无溶血作用，这为材料在静脉注射等后续临床操作和临床应用中打下了坚实的理论基础。3体外MRI为评估纳米级ATP-Gd在3．0T强度的磁场下造影成像的性能和效果，本实验测定了该纳米材料在水溶液中的成像效果(图4a)，并计算了其弛豫率的大小(图4b)。在3．0T的磁场条件下，随着钆离子浓度的降低，材料在水溶液中的T1成像效果具有逐渐变暗变弱的趋势。对材料纵向弛豫率的测定及后续计算可知，材料的r1为3．03mmol•L－1•s－1，与商品化的钆喷酸葡胺(同样条件下测得r1值为3．88mmol•L－1•s－1)成像性能类似。证明该材料可作为良好的T1磁成像造影剂。4体内MRA成像扫描大白兔的MRA效果如图5所示。血管增强效果明显，且局部小血管显示清晰。说明材料具有非常优异的微小病灶成像的潜质。该材料在体内注射15min后已无明显的血管增强效果，表明此时该材料已经基本从血管中被清除。

四、讨论

纳米材料现已成为超声成像、MRI、CT、核医学等一系列影像诊断学科上的一股生力军，是今后临床医学和生命科学的重点研究和依赖对象。用纳米制剂造影剂替代目前的离子型造影剂，可以减少其对血管内皮细胞和血脑屏障造成的损害，避免形成血栓和血栓性炎症，降低产生的毒性。这种非离子型的纳米级造影剂对血脑屏障的影响也极少，并可获得更加清晰、更高对比的影像。磁共振血管造影(MRA)与其他血管成像的方法相比，它无辐射危害、无创伤、少有严重造影剂过敏反应，现已广泛应用于临床。对比增强MRA(CE-MRA)扫描克服了时间飞跃法(TOF)MRA扫描时间长的缺点，也避免了血管扭曲、湍流及慢血流等所致的信号丧失，因而无流动伪影，不存在自旋失相位和饱和效应而导致的对血管狭窄的过度评价，大大提高了诊断正确率。本实验通过对材料在体外成像及活体体内成像的研究，逐步验证了材料增强对比的能力，证明纳米级的ATP-Gd材料可作为一种潜在的MRI的诊断工具，并为该类材料在临床方面的研究应用做了良好的铺垫。在后继的研究中，笔者还将对纳米制剂造影剂对体内病变模型的成像效果进行探讨。

作者：徐运军 金勤玉 杨冬梅 单位：安徽省立医院影像科