细胞培养中透明质酸探究范文

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《影像科学与光化学》2016年第3期

摘要：

通过观察生物体内骨的电镜图片，发现骨表面具有丰富的纤维微纳结构，在此观测的启发下，本实验设计将二氧化钛表面生物活性化的同时构筑这种纤维微纳结构，模仿骨表面。考虑到二氧化钛具有光催化性，且具有生物无毒性，本实验采用“自上而下”的一步法，在紫外光照的条件下，将二氧化钛静电纺丝与透明质酸衍生物在光照条件下通过双键稳定地连接起来。傅立叶－红外光谱分析表明实验成功地在二氧化钛静电纺丝表面嫁接上透明质酸分子。通过荧光和扫描电镜分析表明，间充质干细胞可以很好地在二氧化钛静电纺丝和透明质酸的复合结构上生长。这种构筑复合结构表面的方法，生物活化了二氧化钛纺丝的表面，同时模仿骨表面获得了微纳纤维拓扑结构。此外，可以将二氧化钛静电纺丝纺在不同种类的材料表面，从而在不同材料表面简便地得到可用于细胞培养的纤维表面结构，对于未来可实际应用的移植材料研发具有很好的借鉴意义。

关键词：

二氧化钛静电纺丝；透明质酸；紫外光引发；细胞培养

时至今日，研究生物体系与材料界面的作用机理和规律成为了组织医学工程的重要课题。根据众多的科学文献报道，微纳图案化材料在组织医学工程、人工生物体内移植材料等领域中都有了广泛的应用，对人工体内骨移植、人造血管、牙齿种植等方面都具有重大的推进作用。现在，来自多个领域的科研工作者将从不同的研究领域和角度共同探讨研究生物体内外的各种生物界面组成。在众多研究中，具有微纳结构的人工移植材料具有刺激并调控细胞行为的作用，这些微纳结构很好地加强了材料与组织的相容性，具有很强的应用价值。有关的一系列工作包括构筑特殊的微纳图案化表面诱导干细胞的定向分化；利用特殊的图案化基底在体外培养体细胞，使其恢复并具有多能分化性，最终成为多功能干细胞用于体内的疾病治疗、器官组织恢复；将体内移植材料表面上构筑特殊的微纳图案化结构，使体内细胞在移植材料表面的黏附更加顺畅，并减少机体因移植物而出现的免疫排斥现象，达到促进组织与材料相容性的目的［1－4］。但是，微纳结构的表面构筑具有成本高、耗时长、可构筑范围有限等诸多不利因素，同时用于移植的材料本身在无生物毒性以外，还需要具有较好的生物相容性，比如众多金属移植材料的机械强度很好，但是具有生物毒性，聚合物材料聚醚醚酮具有生物无毒性且表面的力学性质与骨表面相似，但是材料本身却具有生物惰性。考虑到以上众多问题，本实验设想在构筑微纳结构的基础上改性材料表面的性质，使细胞更易在材料表面黏附、增殖，完成一系列的生物行为。

本文工作采用原位聚合的方法将接有双键的透明质酸（透明质酸甲基丙烯酸酯）构筑在二氧化钛静电纺丝的表面，选取Wistar大鼠的间充质干细胞作为实验用细胞来评价所研究材料的生物相容性。透明质酸是生物体内一种常见的生物大分子，在细胞外基质中广泛存在［5－8］，考虑到二氧化钛具有光催化性，且具有生物无毒性，我们在紫外光照的条件下通过“自上而下”一步法，将二氧化钛静电纺丝、透明质酸衍生物两者用化学键稳定地连接起来。这种构筑复合结构表面的方法，生物活化了二氧化钛静电纺丝的表面，同时模仿骨表面获得了微纳纤维拓扑结构。此外，可以将二氧化钛静电纺丝纺在不同种类的材料表面，从而在不同材料表面简便地得到可用于细胞培养的纤维表面结构，对于未来可实际应用的移植材料研发具有很好的借鉴意义。

1实验部分

1．1试剂与仪器

去离子水，透明质酸钠（上海拜力生物科技公司），甲基丙烯酸酐（西格玛奥德里奇），聚乙烯吡咯酮，钛酸四丁酯（麦克林），醋酸（99％，阿拉丁），1×PBS，丙酮（分析纯，北京化工厂），乙醇（分析纯，北京化工厂），过硫酸铵（APS）（阿拉丁），牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇），鬼笔环肽，DAPI，氢氧化钠（分析纯，上海阿拉丁），水合氯醛（分析纯，北京化工厂），戊二醛（分析纯，北京化工厂），青霉素－链霉素（简称双抗，Hyclone公司），DMEM－F12培养基（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（0．25％，Hyclone）。高压电源（东文天津有限公司），马弗炉（安赛斯北京科技有限公司），傅里叶红外光谱仪，CO2临界点干燥仪，微电子天平，环境扫描电子显微镜，原子力显微镜，二氧化碳培养箱，荧光倒置显微镜（尼康），单光子激光共聚焦显微镜（蔡司），超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，制冰机，全自动酶标仪，紫外灯。

1．2合成透明质酸甲基丙烯酸酯

将透明质酸钠配制成1％质量浓度的溶液（所用溶剂为去离子水），向配制好的溶液中加入额外10倍体积的甲基丙烯酸酐，将溶液体系的pH调整为8左右，混合后的体系使用透析袋（分子量6～8kDa）进行纯化，得到的目标产物使用冻干机进行冷冻干燥，得到白色类棉花的絮状物，这些絮状物就是透明质酸甲基丙烯酸酯［9，10］。将最终产物溶于去离子水制备成2％质量浓度的溶液待用。

1．3制备二氧化钛静电纺丝薄膜

将分子量为1300000的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0．3g放入带有磁力搅拌子的洁净的小锥形瓶中，加入5mL无水乙醇，加盖封闭并进行磁力搅拌直到得到均一透明的液体。将3mL钛酸四丁酯和5mL冰醋酸同时缓慢滴加到小锥形瓶中，经过2h的磁力搅拌后会得到均一澄清的黄色液体。将黄色液体移入用于电纺的注射器中，注射器所配备的针头为0．7mm的钢制针头。针头与承接电纺丝的硅片距离为12cm，注射泵的推进速度为0．5mL•h－1，加载在两端的电压为15KV，经过5h的电纺，得到含有PVP和钛酸四丁酯的静电纺丝薄膜。将静电纺丝薄膜与硅片一起放入马弗炉中，在500℃的温度下煅烧2h，得到二氧化钛静电纺丝薄膜［11］。硅片上的薄膜可以用镊子轻轻揭起，密封保存。薄膜很薄需要小心处理，很容易发生断裂。

1．4制备透明质酸和二氧化钛静电纺丝的复合结构

将透明质酸甲基丙烯酸酯溶液作为工作液，向覆盖有二氧化钛静电纺丝的硅片表面滴加工作液至覆盖表面，置于1000W紫外灯下照射4min，工作距离5cm。由于二氧化钛静电纺丝具有光引发性［12］，在紫外光的照射激发下，会使其在表面产生自由基，从而与周围带有双键的透明质酸单体发生聚合反应，使两者稳定的连接在一起。将紫外光照射后的样品取出使用去离子水清洗3遍，每遍3min，洗掉没有反应的单体，如图1所示。清洗后，使用氮气吹干以备待用。对于用于细胞实验的样品，将其高压灭菌或者使用低功率紫外灯照射5h左右。

1．5表面性质检测制得的样品

使用傅里叶红外光谱仪在700～4000cm－1的范围内，4．0cm－1分辨率下进行检测。表面图像使用环境扫描电子显微镜（ESEM）在低真空模式下进行检测，加载的电压为8kV，样品在测试前要提前蒸镀上2nm左右厚度的铂金层加强导电性。

1．6鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养

将提取细胞所使用的器械进行高压灭菌处理，超净台在使用前利用紫外灯杀菌40min，取60～80g雄性Wistar大鼠，对大鼠腹腔内注射5％水合氯醛2．5mL，待老鼠麻醉不动后将其断颈处死。在超净台中，利用剪刀剪取其双侧股骨和胫骨并使用针管提取骨髓，将提取出的骨髓过滤至15mL离心管中。在以1300转／min的速度离心后，将其分散到配备好的DMEM－F12培养基中（15％胎牛血清，1％双抗），放于细胞培养箱（5％CO2，37℃）中进行培养。第二天全换液，换掉杂质细胞，第4天全换液替换掉杂质细胞，然后通过观察细胞的成长情况，每2天换一次液。细胞长满培养皿后，使用胰酶进行传代，当细胞传代到第4代时可以使用，接种到材料表面进行后续试验。将修饰有二氧化钛静电纺丝和透明质酸衍生物的硅片放入24孔培养板中，每个孔中加入1mL消化下来的细胞悬浮液（50000细胞／mL），将孔板放入细胞培养箱（5％CO2，37℃）进行培养，每2天换一次液［1，13］。

1．7基底细胞扫描电镜分析

将上述细胞培养24h后的不同基底从孔板中取出，使用PBS清洗表面一次除去多余培养基，使用5％戊二醛固定样品，浸泡不同基底过夜，固定后使用PBS清洗基底3次，一次2min除去多余的戊二醛；清洗后的样品使用30％、50％、75％、80％、95％、100％浓度的酒精进行梯度脱水，每个浓度的脱水时间15min到20min，梯度脱水后保存在无水乙醇中；将保存在无水乙醇中的样品转移至CO2临界点干燥仪中进行干燥；干燥后的样品使用环境扫描电镜进行表面分析。

1．8基底细胞荧光分析

将间充质干细胞接种在不同的基底表面24h后，样品用PBS清洗10min，除去表面多余的培养基；样品使用4％的多聚甲醛固定15min，固定后用PBS清洗3遍，每遍10min，以除去多余的多聚甲醛；清洗完后样品用0．1％TritonX－100在室温条件下破膜，破完膜后用PBS清洗3遍，每遍5min；使用1％的牛血清白蛋白在室温条件下对样品封闭2h，封闭后使用PBS清洗3遍，每遍5min；将清洗过的样品使用鬼笔环肽（储备液1∶40，用PBS稀释后使用），在避光处进行细胞骨架染色40min，染色后使用PBS清洗3遍，每遍5min，清除多余的染料；使用DAPI（储备液1∶100稀释）染色细胞核10min，染色后使用PBS清洗3遍，每遍5min；染色后的样品保存到甘油或直接使用激光共聚焦显微镜进行观测［1］。

2结果与讨论

2．1红外吸收光谱

二氧化钛具有自引发性，在紫外光照条件下会产生活性自由基团并与透明质酸甲基丙烯酸酯所带有的双键基团发生加成反应［14］，经过紫外照射4min后二氧化钛静电纺丝就会通过化学键稳定地嫁接在亲水的透明质酸分子链上。傅里叶红外光谱仪的测量用来描述基底表面的分子嫁接情况，如图2所示，在3370cm－1附近有很强的吸收峰，这正是由羧基引起的。这些数据表明透明质酸成功地修饰在二氧化钛静电纺丝上。

2．2二氧化钛静电纺丝和透明质酸纤维复合结构扫描电镜

为了评价修饰透明质酸后的二氧化钛静电纺丝的表面形貌特性，我们对修饰后的表面进行扫描电镜的观测。图3（a）是修饰后的二氧化钛静电纺丝表面，与图3（b）的真实骨表面比较我们会发现，真实骨表面充斥着丰富的纤维结构，修饰后的二氧化钛静电纺丝纤维结构很好的模仿了这一点。我们知道基底的纳米结构所产生的形貌不对称会促进细胞的极化现象，而细胞的极化会促进细胞的分化趋势，我们有理由相信修饰后的二氧化钛静电纺丝纤维结构表面能够很好地促进细胞分化的趋势［15－17］。

2．3细胞电镜图片

对细胞的骨架和细胞核进行双染色，利用环境扫描电镜对间充质干细胞在不同基底的细胞形态学情况进行了分析。如图4所示，在修饰后的二氧化钛静电纺丝表面上细胞铺展情况很好，通过扫描电镜图片观察可以发现纤维结构上的细胞伪足（包括板状伪足、丝状伪足）充分铺展。伪足的铺展情况直接影响细胞的稳定粘附、迁移、分化等细胞行为，对于伪足黏附情况较差的材料，无疑在细胞应用方面也是极其不利的，而细胞的伪足在修饰有透明质酸的二氧化钛纺丝结构表面铺展情况很好，这证明了生物活性化的二氧化钛静电纺丝表面能够提供给细胞更多的黏附位点，也可以认为仿骨表面的纳米纤维拓扑结构从结构角度讲具有促进干细胞成骨分化的作用。

2．4细胞荧光图片

如图5所示，通过观察荧光图片可以发现，接种在二氧化钛静电纺丝和透明质酸纤维复合结构上的细胞核和骨架的荧光图像很明显，骨架与核的轮廓很清晰，这说明细胞在纤维结构表面的生长状况良好，而且细胞的核与骨架具有很高的长径比，这主要是由于二氧化钛静电纺丝的表面富含不对称的纳米纤维拓扑结构，较高的长径比使得细胞骨架更加容易发生极化现象，而极化现象的产生会加速细胞的分化程度，使得干细胞在表面的成骨分化导向更加强烈［18］。通过数据分析有理由相信，二氧化钛静电纺丝和透明质酸纤维复合结构具有生物相容性的同时还具有促干细胞成骨分化的能力。

3结论

本文采用“自上而下”的一步构筑法，在紫外照射条件下成功地将二氧化钛静电纺丝与生物活性分子透明质酸结合起来。生物活性分子的修饰大大提高了细胞在静电纺丝表面的黏附、铺展、增殖等生物行为，此外，二氧化钛静电纺丝自有的纳米纤维拓扑结构极大的促进了间充质干细胞的分化导向，同时由于制作方法简单使得这种构筑手段可以应用于各种生物活性较差移植材料表面。本文的工作成功地构筑了具有生物活性的纳米纤维结构，并且引入了纳米拓扑结构，这种结构可以用于改善生物惰性问题，在力学与纳米结构的复合作用下能够更好地促进干细胞的分化导向，而且使用的一步构筑方法操作简便，对于移植材料的表面构筑具有一定借鉴意义。

作者:刘思迪 张俊虎 单位:吉林大学化学学院超分子结构与材料国家重点实验室