救必应提取物安全性探究范文

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《日用化学工业杂志》2014年第五期

1.实验方法

1.1救必应干浸膏制备把救必应药材(铁冬青树皮)洗净、晒干后，进行超细粉碎，再用φ=70%乙醇进行提取并进行板框压滤后得提取液，提取液经减压浓缩和真空干燥后即得救必应干浸膏。

1.2急性毒性测定腹腔注射法:取救必应干浸膏15g，加10g吐温80溶解后再加75g纯净水配制成试验样溶液;配制质量分数为10%的吐温80水溶液作为对照样溶液。取小鼠70只，每只体重约为18～20g，雌雄各半，试验前禁食12h。按照3．25，2．76，2．35，2．00，1．70和1．44g•kg－1注射剂量把小鼠分6组(每组10只，雌雄各半)注射试验样溶液，剩余10只注射对照样溶液。注射完后1和4h分别观察1次，以后每天上午、下午各观察1次，共7d，观察其行为表现、运动、进食情况及中毒表现和死亡数。灌胃法:取救必应干浸膏加蒸馏水研磨配成质量分数为40%的水溶液，分别以16．00，12．80，10．24，8．19，6．55和5．24g•kg－1剂量把小鼠分6组，每组8只，早、晚各灌胃一次，对其行为表现进行观察，共3d。

1.3亚慢性毒性测定大鼠试验:取大鼠96只，每只体重约为(130±20)g，雌雄各半，按照性别随机分成对照组和试验组，每组24只。为避免大鼠间交配怀孕而影响体重测量，将雌雄分笼喂养，均饮冷开水。救必应干浸膏按其小鼠半数致死量(LD50，为(2．022±0．155)g•kg－1)的1/15，1/15×30%和1/15×10%即135.0，40．0和13．5mg•kg－1•d－1分为高、中、低剂量组。为保证用量的准确，避免人为刺激或损伤，将救必应干浸膏均匀拌入饲料内，制成颗粒饲料，自由进食，次日称剩余饲料，折算救必应干浸膏实际摄入量。对照组喂食足量的基础饲料。所有大鼠每2周称1次体重，试验组大鼠按体重增长调整添加救必应干浸膏的用量，同时每日检测进食和进水量，观察大鼠毛色及行为活动情况，连续3个月。各剂量组和对照组3个月后处死2/3大鼠，眼球取血，做血常规和血生化检查，取各主要脏器称重并做组织病理学检查。试验组剩余1/3大鼠于停止喂食救必应干浸膏饲料1个月后处死，对照组剩余1/3大鼠也于1个月后处死，重复前述检查项目。狗试验:取狗19只，体重约为(8．0±1．6)kg，检疫1周后，随机分为对照组(4只)，高剂量组(5只)，中剂量组(5只)和低剂量组(5只)。参照大鼠使用救必应干浸膏的添加量推算出狗每日所用高、中、低3个剂量为39．12，11．74和3．91mg•kg－1，拌于直径约3．0cm的肉丸(由面粉、瘦猪肉和少量肥猪肉组成，蒸熟后食用)内，每日喂1丸。对照组喂无救必应干浸膏的肉丸。各组每2周称1次体重，每日记录进食量，观察其行为表现、运动、肌肉张力、刺激反应、瞳孔大小及眼结膜、腺体分泌、呼吸等一般情况，连续喂食3个月。分别于喂食前和喂食45和90d后进行静脉采血做血常规和血生化检查，采尿液做尿常规检查。3个月后，高、中、低剂量组及对照组分别处死4，4，4和3只狗，称主要脏器质量及进行组织病理学检查。停止喂食救必应干浸膏肉丸1个月后处死剩余的狗，同时处死对照组的1只狗，检查血常规和血生化项目。

1.4基因突变检测采用沙门氏菌/回复突变试验(Ames试验)，具体方法见《化妆品卫生规范》(2007年版)。该试验用来判断受试物是否为致突变物，用TA97，TA98，TA100和TA1024个试验菌株测定，以S9为诱变剂。先采用渗入法，加诱变剂(以S+9表示)与不加诱变剂(以S－9表示)，如果受试物的平均回变菌落数是空白对照的平均回变菌落数2倍或2倍以上，且存在剂量－回变菌落数关系者，则判断受试物是致突变阳性，否则就是致突变阴性。再采用点试法，加诱变剂(以S+9表示)与不加诱变剂(以S－9表示)，并采用不同浓度的受试物溶液浸湿灭菌圆滤纸片边缘，只要有一个试验菌株为阳性，即该受试物是致突变阳性;如果4个试验菌株均为阴性，即该受试物是致突变阴性。同时做阳性对照试验，检验试验的有效性。

1.5染色体畸变的检测采用哺乳动物细胞微核试验，具体方法见《化妆品卫生规范》(2007年版)。以受试物处理大鼠和狗，处死然后取骨髓，制片、固定、染色，于显微镜下计数淋巴细胞中的微核。如果与对照组比较，处理组淋巴细胞微核出现率有统计学意义的增加，并有剂量－反应关系，则可认为该受试物是哺乳动物体细胞的致畸变物，反之则可认为该受试物是致畸变阴性。试验与亚慢性毒性试验同时进行，大鼠淋巴细胞微核出现率正常值为0～0．1%，狗淋巴细胞微核出现率正常值为0～0．9%。

1.6对口腔黏膜刺激性的检测制备含救必应干浸膏质量分数分别为0．2%，1%和5%的试验样牙膏，对照样牙膏为不含救必应干浸膏的普通牙膏。家兔40只，体重为(1．86±0．27)kg，随机分为2组。其中损伤组(20只)用梅花针刺入家兔口腔颊侧黏膜，直至出血为止，剩余家兔为非损伤组(20只)。2组均用含救必应干浸膏质量分数分别为0.2%，1%和5%的试验样牙膏(每个质量分数对应5只家兔)和对照样牙膏(5只家兔)涂于家兔口腔颊侧黏膜，每日1次，分别给牙膏5和10d，涂抹期间观察局部黏膜反应。不同组分别于给牙膏5，10d和停用牙膏10d后杀死1只家兔，取涂牙膏部位口腔黏膜送病理切片检查。

1.7对牙龈黏膜刺激性的检测家兔10只，随机分为2组，每组5只，试验组体重为(1．99±0．19)kg，对照组体重为(1．86±0．27)kg，试验组所用牙膏中救必应干浸膏的质量分数为1%，对照组为不含救必应干浸膏的普通牙膏。2组均用牙膏模拟刷牙，每日1次，分别给牙膏5和10d，并于给牙膏5，10d和停用牙膏10d后分别杀死1只家兔，取涂牙膏部位牙龈黏膜送病理切片检查。

2结果与讨论

2.1救必应干浸膏的急性毒性

腹腔注射试验数据见表1。根据药物研究技术指导原则及LD50的计算方法，由表中数据计算出的LD50为(2．022±0．155)g•kg－1;注射对照样的小鼠未见异常反应，无死亡。灌胃法试验中，16．00和12．80g•kg－1剂量组出现毒性反应，毒性反应在24～48h内消失，小鼠恢复正常活动，无死亡;其余4组未见异常反应。按照急性毒性数据分级，该救必应干浸膏为实际无毒级物质。

2.2救必应干浸膏的亚慢性毒性

亚慢性毒性试验结果表明，该救必应干浸膏在经口反复接触时是安全的，详细情况分析如下。

2.2.1一般体征喂救必应干浸膏期间的各组动物，无异常行为表现，运动正常，皮毛有光泽，无脱毛，状况良好，进食量各组间无明显差异。

2.2.2尿常规检查各组狗喂救必应干浸膏前后，狗的尿液pH、尿蛋白、尿糖及隐血试验检查值均在正常范围，各组间比较无显著差异。

2.2.3血常规检查大鼠喂救必应干浸膏3个月后高剂量组血小板计数、中剂量组血红蛋白水平较对照组低(P＜0．05)，但仍在正常范围内，停喂救必应干浸膏后亦无明显变化。各组大鼠血常规检查均在正常范围内。各组狗喂救必应干浸膏前后血常规各项指标均在正常范围内，组间无显著差异。

2.2.4血生化检查喂大鼠高、中和低剂量救必应干浸膏3个月后，血胆固醇水平较对照组高(P＜0．05);但喂中和低剂量救必应干浸膏的大鼠血胆固醇水平仍在正常范围内;喂高剂量救必应干浸膏的大鼠血胆固醇水平则大于正常值，停用1个月后下降至正常值。其余血生化指标均在正常范围内，组间比较也无明显差异。喂高和中剂量救必应干浸膏的狗在45和90d后，血胆固醇水平较试验前明显升高，并高于正常值，停用1个月后下降至正常值。其余血生化指标均在正常范围内，组间比较也无明显差异。

2.2.5脏器检查喂救必应干浸膏3个月及停用1个月后分别处死的动物，各脏器大小及色泽正常，无充血、水肿及坏死，各组间脏器重量无明显差异。各组动物的心、肝、肺、脾、肾、胃、肠道及性腺组织结构正常，除个别动物的肺或肾有轻度炎症外，其余无明显病理学改变。各组之间炎症的变化无明显差异。

2.3救必应干浸膏致基因突变的风险

沙门氏菌/回复突变试验(Ames试验)结果见表2，表3和表4。由表中数据可知，在渗入法试验过程中，救必应干浸膏加入S9(0．3mL/皿)和不加入S9的平均回变菌落数相比较无明显增加，不同剂量救必应干浸膏的平均回变菌落数与空白对照的平均回变菌落数相比也无明显增加，且不存在剂量－回变菌落数关系。点试法均为阴性。阳性对照物(2－氨基芴、叠氮化钠和丝裂霉菌)的渗入法和点试法测试均为阳性。由此说明该救必应干浸膏为致突变阴性，即无致突变风险。

2.4救必应干浸膏致染色体畸变的风险

哺乳动物细胞微核试验的结果见表5和表6。根据表中的数据可知，大鼠和狗喂救必应干浸膏3个月后的淋巴细胞微核出现率与对照组比较无明显差异，且均在正常值范围内。由此说明该救必应干浸膏为微核试验阴性，即无致染色体畸变风险。

2.5救必应干浸膏对口腔黏膜的刺激性

非损伤组在涂抹含救必应干浸膏牙膏和对照样牙膏期间，家兔口腔黏膜无充血、水肿、破溃、糜烂，亦无水泡、出血点等现象，家兔口腔黏膜病理学切片在普通光学显微镜下均未见病理性损伤。损伤组在涂抹试验样牙膏和对照样牙膏期间，肉眼可见一些家兔局部充血、水肿、破溃、糜烂现象，在普通光学显微镜下观察家兔口腔黏膜病理学切片亦见明显的损伤，但各组间无明显差异。试验结果表明，含救必应干浸膏牙膏对正常状态下的口腔黏膜无刺激性。救必应干浸膏应用于牙膏对口腔黏膜无额外增加的刺激性。

2.6救必应干浸膏对牙龈黏膜的刺激性

在刷牙期间，肉眼观察试验组和对照组牙龈黏膜，均无充血、水肿、破溃、糜烂及牙龈增生等改变，病理切片检查未见明显的损伤性变化。试验结果表明，含救必应干浸膏牙膏对正常状态下的牙龈黏膜无刺激性。救必应干浸膏应用于牙膏对牙龈黏膜无额外增加的刺激性。

3结论

小鼠腹腔注射法试验结果表明，救必应提取物的LD50为(2．022±0．155)g•kg－1;灌胃法试验结果表明，10．24g•kg－1及更低剂量试验组无毒性反应;按照急性毒性数据分级，救必应提取物属实际无毒级物质。亚慢性毒性试验结果表明，救必应提取物在经口反复接触时是安全的。基因突变和染色体畸变的检测表明，救必应提取物无致突变风险和无致染色体畸变风险。口腔黏膜试验和牙龈黏膜试验表明，救必应提取物应用于牙膏对口腔黏膜和牙龈黏膜无刺激性。综合以上结果，按照牙膏用中药安全性判定的基本原则，救必应提取物可安全用于牙膏等口腔护理品中。

作者：徐春生徐文霞单位：广州市牙博士口腔护理研究院