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摘要:采用酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶耦合催化方法制备他喷他多手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸甲酯［(S)-TT5］。经过正交工艺优化，最佳反应条件:底物4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸甲酯(TT2)浓度为66.1g/L，酮基还原酶用量为12U/gTT2，辅酶NADH用量为8g/L，反应温度为30℃，反应时间为10h时，底物TT2转化为(3S，4S)-4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸甲酯((3S，4S)-TT3(主要产物))的收率为92.5%，d.e．99.5%;再经次氯酸钠氧化得(S)-TT5，收率98%，e.e．99.6%。
关键词:(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸甲酯;他喷他多中间体;生物催化
他喷他多(Tapentadol)是由美国强生制药和德国GruenenthalGmbH公司联合研制的新型口服镇痛药，其速释片剂和缓释片剂分别于2008年11月和2012年8月经美国FDA批准上市。本品是一种新型中枢镇痛药，既是阿片受体激动药，又是去甲肾上腺素重吸收抑制剂，镇痛作用强，介于吗啡和曲马多之间，与其他阿片类镇痛药(如吗啡、曲马多等)相比，耐受性和依赖性更小，不良反应(如恶心、呕吐等)轻［1］。他喷他多分子含有2个手性碳原子，采用手性拆分方法收率低［2，3］，采用手性化学催化法则因使用昂贵的手性催化剂导致生产成本偏高［4］。生物催化法，具有原子经济、对映选择性高、绿色环保、操作简便、成本低等特点，该方法正广泛用于许多手性药物及其中间体的合成，如降血脂药阿托伐他汀(Atorvastatin)［5，6］、新型胆固醇抑制剂依折麦布(Ezetimibe)［7］、抗抑郁药氟西汀(Fluox-etine)和度洛西汀［(S)-Duloxetine］［8，9］以及组胺类药物倍他司汀(Betahistine)［10］等。他喷他多的合成路线如下页所示［11］。(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸甲酯［(S)-TT5］是合成他喷他多的手性中间体。本研究设计了(S)-TT5的生物合成路线:底物4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸甲酯(TT2)在酮基还原酶和还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的作用下，被一步还原为(3S，4S)-4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸甲酯((3S，4S)-TT3)(主要产物)和(3S，4R)-TT3;反应中利用葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化实现氧化型NAD+的耦合还原，保证了NADH的再生。然后TT3经次氯酸钠氧化得手性中间体(S)-TT5。本研究方法目前尚无文献报道。
1实验部分
1.1主要仪器与试剂LC3000I型高效液相色谱仪(山东同心科教仪器设备有限公司);RE-5250型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);4-16K型离心机(德国Sigma公司);GS-3型膜分离机(上海斯纳普膜分离科技有限公司);EasysSiralpro型螺旋接种仪(法国Intersience公司)。自主专利菌株基因工程菌由中国微生物菌种保藏中心保藏，编号分别为CCTCCM2016101(产酮基还原酶，来源于木兰假丝酵母(Candidamag-noliae)，Genbank:BAB21578.1)和CCTCCM2016102(产葡萄糖脱氢酶，来源于芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)，GenBank:AKL85515.1)。
1.2他喷他多手性中间体的合成
1.3实验方法
1.3.1TT3的合成向5L反应釜(有效反应容积为4L)中依次加入1000g缓冲液(磷酸-磷酸二氢钾反应体系，pH7.1)、200g固体葡萄糖、按照每1g底物TT2加入250U葡萄糖脱氢酶、8U酮基还原酶以及20g辅酶NDAH的比例，混匀后加入250g(1.058mol)底物TT2，得0.265mol/L底物TT2的反应液;于28℃保温反应9h，TLC(展开剂:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1))显示反应完全。用乙酸乙酯萃取(1.0L×3)，收集有机相，减压浓缩，得208.1g(0.873mol)淡黄色油状液体TT3中间体，收率82.5%。HPLC纯度为99.1%(归一化法:色谱柱OD-H手性柱(4.6mm×250mm，5m);流动相为m(正己烷)∶m(异丙醇)∶m(二乙胺)=98∶2∶0.1;检测波长220nm;流速1mL/min;柱温30℃)。生物催化转化后主要产物是(3S，4S)-TT3，保留时间为15.48min，(3S，4R)-TT3的保留时间为16.98min，d.e．99.2%。
1.3.2(S)-TT5的合成取200g(0.846mol)TT3和500mL石油醚混匀后，于40～50℃滴加40mL(1.9mol/L)次氯酸钠水溶液，滴毕保温反应3h。加入100mL乙酸乙酯，搅拌15min，静置分层，有机相用水洗至中性;收集有机相，用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压浓缩得188.2g淡黄色油状液体TT5，产率为98%。色谱方法同上，(S)-TT5的保留时间为10.01min，少量(R)-TT5的保留时间为9.59min，e.e．99.6%。1HNMR(CDCl3，400MHz)，δ:7.40～7.46(m，1H，H-5);7.28(s，1H，H-1);7.24～7.26(m，1H，H-4);6.98～7.01(m，1H，H-3);3.80～3.84(m，1H，H-8);3.71(s，3H，H-12);3.52(s，3H，H-13);2.81～2.87(m，1H，H-9a);2.32～2.37(m，1H，H-9b);1.10～1.15(s，3H，H-11)。13CNMR(CDCl3，100MHz)，δ:202.101(C-7)，172.341(C-10)，159.594(C-2)，136.889(C-6)，129.325(C-4)，120.572(C-5)，119.081(C-3)，112.495(C-1)，54.962(C-12)，51.249(C-13)，36.996(C-8)，36.849(C-9)，17.523(C-11)。
2结果与讨论
在手性中间体TT5的合成中，生物催化过程最为关键，通过单因素考察，葡萄糖脱氢酶为还原底物葡萄糖的NADH再生系统用酶，葡萄糖脱氢酶和葡萄糖的因素对反应收率影响不大，因此为了进一步提高生物催化效率，对底物浓度、酮基还原酶用量、辅酶NADH初始用量、反应温度和反应时间进行了5因素4水平的优化试验，结果见表1。从正交试验结果可以看出，影响TT2转化效率的因素中，影响大小依次为:底物浓度＞反应时间＞酮基还原酶用量＞辅酶用量＞反应温度。其中底物浓度和反应时间为显著性影响因素，均方与自由度的比值F比分别为46.352和12.039(＞F临界=9.28)。从上述试验结果可知，(3S，4S)-TT3的最佳生物催化工艺条件为A2、B3、C4、D2、E3，即在底物浓度66.1g/L、每1gTT2的酮基还原酶用量12U、辅酶用量8g/L、反应温度30℃及反应10h时，底物TT2的转化率最高。将底物66.1g(0.28mol)TT2溶于pH7.1的磷酸-磷酸二氢钾缓冲溶液中，每1gTT2添加12U酮基还原酶，8g辅酶，反应总体积1L，反应温度30℃，反应10h，得61.7g(0.259mol)(3S，4S)-TT3，收率92.5%，d.e．99.5%。
3结论
利用酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶耦合催化方法成功制备了盐酸他喷他多手性中间体(S)-TT5。经过工艺优化，在底物浓度66.1g/L、每1gTT2的酮基还原酶用量为12U、辅酶用量8g/L、反应温度30℃及反应10h时，底物TT2转化为(3S，4S)-TT3的收率为92.5%，d.e．99.5%，(S)-TT5的收率为98%，e.e．99.6%。该生物催化方法具有较好的工业化应用价值。
参考文献:
［1］刘阿敏，丁斌，李德刚，等．新型镇痛药他喷他多的研究进展［J］．安徽医药，2015，19(8):1433-1437．
［2］马慧，冯文化，梁玉华．盐酸他喷他多的合成［J］．中国医药工业杂志，2010，41(9):641-645．
［3］马彦琴，赵世魁，张桂森，等．盐酸他喷他多的合成［J］．中国医药工业杂志，2013，44(6):554-557．
［4］刘振德，高河勇，毕鹏飞，等．一种合成盐酸他喷他多的方法:104803861A［P］．2015-07-29．
作者：郑美娟1，吕育财1，戴秋红2，代齐敏3，龚大春*1 单位：1．三峡大学生物催化重点实验室，2．安琪酵母股份有限公司，3．能特科技股份有限公司