特异性透明质酸酶的进展探究范文

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[摘要]透明质酸酶在临床上被用作药物扩散剂,它通过降解肿瘤微环境和皮肤组织中的透明质酸,从而提高组织的通透性来促进药物的扩散和吸收,在肿瘤治疗和皮下给药中都有很好的应用前景.透明质酸酶对细胞外基质中透明质酸的降解作用不仅与其对透明质酸的解聚作用效力有关,还与酶的底物特异性有关.近年来,不断有专一性降解透明质酸的透明质酸酶被发现,本文主要对目前发现的特异性透明质酸酶的研究现状作一综述.

[关键词]透明质酸葡糖胺酶;底物特异性;综述

透明质酸酶是一类能够降解透明质酸的酶的总称,1929年首次被DURANGREYNALS发现时称为“扩散因子”[1],它可以使皮下注射的疫苗、毒素等更好地扩散.1940年,该酶被MEYER等[2]正式命名为透明质酸酶.此后,在多种生物体内以及人体的多种组织中陆续发现了透明质酸酶.该酶在细菌中普遍存在,革兰阳性菌产生的透明质酸酶主要存在于细胞荚膜中,革兰阴性菌产生的透明质酸酶一般存在于细胞周质中.此外,在真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物的体内同样发现了透明质酸酶的存在.近年来,不断有专一性降解透明质酸的透明质酸酶被发现,由于其良好的生物学活性受到更多研究者的关注.本文主要对目前发现的特异性透明质酸酶的研究现状作一综述.1透明质酸酶1．

1透明质酸酶的生物学活性

透明质酸酶的生物学活性很多,它作为药物扩散剂,在眼科手术方面有一定的应用[3].透明质酸酶作为工具酶能够快速降解透明质酸,可以用来制备低分子透明质酸和透明质酸寡糖[4].透明质酸酶与注射液合用可以消除血肿或水肿,通过对透明质酸的解聚作用,促进局部积贮的血液、渗出液或注射液的快速扩散和吸收[5G7].在抗肿瘤药物的使用方面,局部注射透明质酸酶能够有效防止紫杉醇外渗性损伤的发生[8].此外,在整形美容领域,透明质酸酶也常被用于面部注射透明质酸除皱后不良反应的后处理[9].

1．2透明质酸酶的分类

依据透明质酸酶序列同源性之间的关系,透明质酸酶可分为真核生物来源透明质酸酶和原核生物来源透明质酸酶两个大类.来源于动物和人(例如睾丸、精子、皮肤、蛇毒和水蛭等)的真核生物透明质酸酶属于水解酶,主要是从动物组织中提取的,应用最广泛的是牛睾丸透明质酸酶.2005年12月,FDA批准重组人类透明质酸酶注射剂作为其他注射药物的辅助药物.商品化的重组人透明质酸酶在医药领域有一定应用,其氨基酸序列是PH20[10].PH20除能够降解透明质酸外还能够微弱地降解硫酸软骨素GA,但不降解硫酸软骨素GB和硫酸软骨素GC,而牛睾丸透明质酸酶对这些底物均有不同程度的降解作用[11].原核生物来源(例如溶血链球菌、金黄色葡萄球菌和气单胞菌等)的透明质酸酶属于裂解酶.这些透明质酸酶大多数除了可以降解透明质酸外,还能降解其他种类的糖胺聚糖(例如软骨素和硫酸软骨素等),可通过筛选产透明质酸酶的菌株并从其发酵液或菌体细胞中分离到.

2特异性透明质酸酶

2．1水蛭透明质酸酶

水蛭透明质酸酶首次被发现是在1937年,CLAUDE[12]在水蛭提取液中发现了这种“扩散因子”,后来被证实为水蛭透明质酸酶.分离纯化后研究其酶学性质发现,水蛭透明质酸酶能够特异性降解透明质酸,不降解除了透明质酸以外的黏多糖,属于水解酶,作用于βG1,3糖苷键,降解的主产物是饱和透明质酸四糖[13].水蛭透明质酸酶的最适反应温度是38℃,最适反应pH值为5．5,在50℃以下稳定[14].2014年,JIN等[15]采用随机引物扩增的方法从水蛭的全基因组中扩增到第一个水蛭透明质酸酶的基因,通过蛋白质工程技术和高密度发酵,成功在毕赤酵母表达系统里实现了水蛭透明质酸酶的高产,酶活力达到8．42×108U/L.2015年,KANG等[16]对重组水蛭透明质酸酶在毕赤酵母中的发酵条件进行优化,将酶活力从8．42×108U/L提升到1．24×109U/L.早在1941年,HIRST[17]就证实水蛭透明质酸酶具有很强的抗菌性能.此外,水蛭透明质酸酶具有与其他哺乳动物透明质酸酶类似的活性,能够促进药物扩散,在青光眼等眼科手术中具有很好的治疗效果[18].2016年,LV等[19]利用高效液相色谱和质谱对水蛭透明质酸酶降解透明质酸的终产物进行分析,清楚地展示了终产物中四糖和六糖的比例,并获得了大量的透明质酸四糖.与其他的一些寡糖(平均分子量4000)相比,透明质酸四糖和六糖在促进血管生成方面显示出高的生物学活性,这与牛睾丸透明质酸酶产生的四糖和六糖的作用效果相似.这种由水蛭透明质酸酶降解产生的高纯度透明质酸四糖和六糖将会吸引很多科学家的兴趣,并有很大的潜在应用价值.

2．2动物毒液透明质酸酶

许多动物如蛇、蜥蜴、蜜蜂、蜘蛛等的毒液中都发现了透明质酸酶的存在[20].大部分动物毒液透明质酸酶不仅能够降解透明质酸,还能以其他糖胺聚糖如软骨素和硫酸软骨素等作为底物[21G22].2004年,GIRISH等[23]在眼镜蛇毒液中发现了对透明质酸绝对特异性降解的动物毒液透明质酸酶,该酶分子量为70406,属于中性活性的酶,其降解主产物是饱和透明质酸四糖.该酶切割βG1,4G糖苷键,属于内切GβGNG乙酰氨基己糖苷酶.随后在蜘蛛毒液、蛇毒液等动物毒液中均发现了这种专一性降解透明质酸的透明质酸酶.2007年,NAGARAJU等[24]从蜘蛛毒液中分离纯化到底物专一性动物毒液透明质酸酶,该酶的分子量为42260,最适反应温度为37℃,最适pH值为5．8,属于中性活性的酶,在反应中存在300mmol/LNaCl时活性最高.2012年,WABBY等[25]在最危险的埃及角蝰毒液中分离到一种新型透明质酸酶CcHaseⅡ,该酶分子量为33000,最适反应温度为37℃,最适pH值为5．5,同样Na＋对酶活性有促进作用.动物毒液是酶和蛋白质的混合物,透明质酸酶是其重要的组成成分,在促进毒素扩散方面起到至关重要的作用.蜜蜂毒液、蝎子毒液等中的透明质酸酶是使人体产生IgE介导的致命过敏反应的过敏原[26].动物毒液透明质酸酶的结构和作用机制研究具有重要临床意义,能够为毒液螫入人体产生病理学反应提供治疗依据,同时可以进一步研究有价值的无毒透明质酸酶抑制剂,将其作为急救药物对被释放毒液动物咬伤的人员进行紧急救治.

2．3微生物来源底物专一性透明质酸酶

原核生物来源的透明质酸酶又称为透明质酸裂解酶,能产生透明质酸裂解酶的微生物种类有很多.微生物来源的透明质酸酶属于多糖裂解酶第8、16家族.有些噬菌体也能产生透明质酸酶,但是其分子量远小于细菌透明质酸酶,而且在胞外环境下测得的活性很低[27].这些透明质酸酶大多数不具有底物特异性,还能降解软骨素和硫酸软骨素.但是来源于链霉菌的透明质酸裂解酶具有很强的底物特异性,能够专一性降解透明质酸[11].某些细菌的噬菌体也能产生专一性降解透明质酸的透明质酸酶.目前,微生物来源的透明质酸酶仅在革兰阳性菌(链霉菌)和噬菌体中发现了这种底物特异性透明质酸酶.

2．3．1链霉菌透明质酸裂解酶

链霉菌透明质酸酶在1970年被OHYA等[28]首次发现,由于其特殊的底物特异性吸引了很多学者进行研究.后续研究发现,该酶与已知微生物来源的透明质酸酶在作用机制和最终降解产物上是不同的,其他种类微生物来源的透明质酸酶降解透明质酸的终产物是不饱和二糖,而链霉菌透明质酸酶降解透明质酸的主产物则是不饱和四糖和六糖[29],不能降解产生二糖.虽然其降解机制也是通过βG消除反应进行,但它不是进行性降解,而是采用随机内切的方式.2015年,PAVAN等[11]从StreptoGmyceskoganeiensis链霉菌中获得了重组的链霉菌透明质酸酶rHyal_Sk,该酶分子量为21600.rHyal_Sk是一种高度专一性降解透明质酸的原核生物透明质酸酶,而且硫酸化的透明质酸和硫酸软骨素对其活性没有任何抑制作用,体内和体外实验均证明rHyal_Sk具有很好的扩散作用,是一种新型“扩散因子”.

2．3．2噬菌体透明质酸酶

链球菌透明质酸酶(如无乳链球菌、中心链球菌和停乳链球菌透明质酸酶等)可以非特异性地降解一种黏多糖,并且通常能够作用于透明质酸和硫酸软骨素[30].然而,寄生于链球菌的噬菌体产生的透明质酸酶却对底物具有强烈的专一性,只能降解透明质酸,它们利用合成的透明质酸酶依附于透明质酸丰富的细菌膜表面.目前发现的噬菌体透明质酸酶并不多,有报道的产透明质酸酶的噬菌体只有酿脓链球菌10403[31]、H4489A[32]和马疫链球菌前噬菌体7047[33].1997年,BAKER等[30]发现酿脓链球菌噬菌体透明质酸酶专一性降解透明质酸,对其他种类糖胺聚糖都没有降解作用,属于裂解酶,但其降解方式不是进行性降解,降解的主产物是不饱和四糖和六糖.

2006年,MISHRA等[31]阐明了酿脓链球菌10403中的噬菌体透明质酸酶HylP2底物特异性的影响因素,HylP2C末端的结构域是催化结构域,而且仅有C端本身也能催化反应的进行,但是仅有C端的HylP2不仅能够降解透明质酸,还能够以硫酸软骨素作为底物,C端结构域和N端之间特殊的相互作用可能是实现噬菌体透明质酸酶最大酶活力和底物特异性所必需的.该研究首次详细地说明了蛋白质结构与噬菌体透明质酸裂解酶功能之间的关系.

3展望

透明质酸酶的生物学活性很多,重要的应用领域之一是在经皮给药中的应用.经皮给药安全性高、易操作,可作为静脉给药的替代或备选方案.研究证明,透明质酸酶对细胞外基质中透明质酸的降解作用不仅与其对透明质酸的解聚作用效力有关,还与其空间位阻、催化机制和酶的底物特异性有关,因此这些底物特异性透明质酸酶可能在经皮给药促进药物扩散方面具有更为重要的应用,筛选新型底物特异性透明质酸酶将会成为今后研究透明质酸酶一个重要方向.底物特异性透明质酸酶的研究将为预防和治疗透明质酸酶相关疾病提供新的途径和理论依据.

作者:张晓娟 宫倩红 单位:中国海洋大学医药学院糖生物学实验室