化学品皮肤刺激性实验的评估范文

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1方法

该皮肤模型的所有生物性成分及其培养环境均经过病毒、细菌和支原体的测试。皮肤模型最终产品都要经过MTT＆SDS细胞毒素测试和生物组织检查。基于质量控制的指标，“EpiSkin”表皮模型的IC50值均大于或等于1mg/ml，可用于正式皮肤刺激性测试。用HematoxylinEosinSaffron染色来评价表皮模型是否良好分化。该皮肤模型评分均高于或等于18.0，表明表皮模型的表皮分化良好，具备基底层、网状层、颗粒层和较厚的角质层，允许用于刺激性测试。

对于每一种化学品，需要3轮不同批次的皮肤模型来对其进行皮肤刺激性的测试。参照OECD439欧盟标准测试方法，具体步骤如下:(1)化学品10μl(固体10mg研成粉末，同时加蒸馏水5μl)局部接触面积约0.38cm2的皮肤模型表面15min。(2)阴性对照加10μlPBS、阳性对照加10μl5%SDS。(3)与化学品接触15min后用25mlPBS冲洗活性皮肤，浸入2.0ml维持培养基内。1～3步需在通风安全柜中进行。(4)继续在饱和湿度、5%CO2、37℃的条件下孵育42h。(5)浸入2.0ml浓度0.3mg/ml的MTT溶液(用测试培养基配制)内，在饱和湿度、5%CO2、37℃孵育3h。(6)MTT反应完的皮肤模型，浸入500μl酸化异丙醇的锥形底离心管内，用振荡混合仪混匀，在室温、避光的条件下过夜。(7)振荡混合仪混匀每个离心管，每管中取200μl标本加入96孔板微量比色池中，在570nm用酶标仪读取A值，以酸化异丙醇溶液作为空白对照。将本实验结果按照下列公式，将所得A值换算为细胞相对活力值，用细胞相对活力值来判断化学品是否具有刺激性，阴性对照的平均A值相当于100%的细胞活力(计算细胞相对活力值方法参照OECD439)。相对细胞活力百分比(%)=100×(某化学物的A值/阴性对照的平均A值)。求取3轮测试的相对细胞活力值的平均值，得到该化学品的细胞相对活力值。评判化学品刺激性的标准:细胞相对活力＜50%判断为有刺激性(I)，≥50%为无刺激性(NI)。

2结果

20种化学品的相对细胞活力百分比见表1。根据本研究实验结果，对所测试的20种化学品与欧洲替代方法验证中心(ECVAM)的化学品分类标准(这20种化学品分类标准是依据兔皮肤实验体内测试)测试结果进行比较，同时也与欧盟认可皮肤模型EpiSkin在欧洲的体外测试结果比较，结果见表2。在20种化学品中，ECVAM体内测试分类数据表明刺激性化学品为10种，本实验皮肤模型能正确分类9种;非刺激性化学品为10种，能正确分类7种。将本研究的结果数据与ECVAM体内测试结果进行比较，“EpiSkin”皮肤模型的灵敏度为90%，特异性为70%，刺激性结果预测率90%，非刺激性结果预测率70%;准确率达到80%。其灵敏度与特异性均达到欧盟经济合作与发展组织OECD认可的要求，即灵敏性70%，特异性90%。此皮肤模型有望作为评价化学品皮肤刺激性的替代方法。

3讨论

动物实验在研究疾病、开发检测医药和疫苗、评价化学物质的危险性等诸多方面，有着不可或缺的重要作用。但动物实验也有实验周期长、耗时费力、动物间存在个体差异等缺点。随着各国有关动物福利法律的完善，寻找替代动物实验的科学方法得到了各国政府和科学工作者的关注。许多发达国家广泛开展了体外替代方法的研究和验证工作，已涉及到皮肤刺激和腐蚀性实验、眼刺激和腐蚀性实验、光毒性实验、皮肤致敏性实验以及热原检验等。EpiDerm(MatTekCorpor-ation，Ashland，MA，USA)和EpiSkin(EPISKINSNC，Lyon，France)已被正式授权在欧盟范围内成为皮肤腐蚀性与刺激性检测的工具。

本研究采用3D人工皮肤模型“EpiSkin”采用MTT方法定量细胞活力，以相对细胞活力值为标准，与ECVAM体内测试分类结果相比较，能正确判定所选10种刺激性化学品中的9种，灵敏度达到90%;能正确判定10种非刺激性化合物中的7种，该皮肤模型特异性为70%。和被欧盟认可的EpiSkin皮肤模型在欧洲的评价结果相一致。因此，本实验的测试方法的预测能力完全符合OECD439的要求。根据本研究结果得出3D人工皮肤模型“EpiSkin”可以评估化学品的皮肤刺激性。

作者：马丹赵晓娟付溥博张西萌魏海燕刘莉曾静单位：北京出入境检验检疫局