毒性化学品对线虫感知行为的影响范文

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1材料与方法

1.1实验用化学品和仪器耗材野生型线虫N2和大肠杆菌OP50均由北京生命科学研究所惠赠。氯化镉、氟化钠、二水重铬酸钠、氯化锰、敌敌畏、二溴敌草快、五水硫酸铜、硫酸阿托品、苯、氯化钾、氯化钠、乳酸、硼酸、乙醇、乙二醇、无水-2-丙醇、甘油、甲醇、三氯乙酸、次氯酸钠、柠檬酸等试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。主要仪器:电子天平、漩涡震荡仪、离心机、摇床、超净工作台、20℃恒温培养箱、15℃恒温培养箱和体视显微镜(MoticSMZ-140series)。

1.2线虫的培养和试剂的配制常规方法培养线虫，将线虫同步化到L4期备用。趋避和趋向实验用培养基(2.5g蛋白胨、17g琼脂加超纯水至1L，高压灭菌)、叠氮化钠(1mol/L)、五水硫酸铜(100mmol/L)、丁二酮(1%体积分数)、K-medium溶液(51mmol/L氯化钠，32mmol/L氯化钾)、线虫染毒液(以K-medium溶液为溶剂，2.15倍比稀释至所需浓度)。

1.3线虫的染毒剂量用K-medium溶液洗下L4期的线虫至50ml的离心管中，沉淀后立即用20ml的K-medium溶液洗3次。体视显微镜下调配线虫的只数，使线虫的密度在每20μl50只左右。向24孔板中加入等量的化学品和线虫液，6h后观察线虫死亡情况，以线虫无非正常死亡的最高浓度为趋避和趋向实验的最高剂量浓度，并依次按2.15倍比稀释，每化学品4个浓度梯度(表1)。

1.4趋避实验参考Li等］及Stephen等的实验方法，具体步骤如下:将9cm的含有培养基的培养皿等分为4个区域;在十字区域的一对侧培养基上各涂布25μl的100mmol/L的五水硫酸铜溶液，静置1～2h，等五水硫酸铜溶液渗入到培养基，在另一对侧各滴加50只左右L4期的染毒线虫(K-medium溶液处理过的线虫作为阴性对照)。实验6h后，分别计数两对侧培养基上的线虫数(压在十字线上的不计数)，分析线虫是否进入含有Cu2+的区域;实验组和对照组各4个平行样，计算趋避指数=含Cu2+培养基上线虫数目/培养基上线虫总数。

1.5趋向实验参考Li等、Bargmann等、Bargmann和HorvitzHR［8］的实验方法，具体步骤如下:在含有培养基的培养皿中标记距离培养皿圆心均为2cm的两点;在其中一个标记点上加1μl1%丁二酮(体积分数)和1μl1mol/L叠氮化钠，另一标记点加1μl1mol/L叠氮化钠，在距离上述两点3cm处滴加100只左右L4期的染毒线虫(K-medium溶液处理过的线虫作为阴性对照);静置6h后，计数距离两标记点

1.5cm范围内的线虫数和线虫总数;实验组和对照组各4个平行样，计算趋向指数=(丁二酮侧线虫数－叠氮化钠侧线虫数)/培养基上线虫总数。

1.6实验数据处理组内两两比较:以不同浓度化学品的铜离子侧线虫平均数(趋避实验)/丁二酮侧－叠氮化钠侧线虫平均数、线虫总数平均数、对照组铜离子侧线虫平均数/丁二酮侧－叠氮化钠侧线虫平均数和对照组线虫总数平均数，构建四格表资料，应用SPSS软件中的卡方检验(Crosstabs)做统计分析，检验水准α=0.05。组间比较:以铜离子侧线虫平均数/丁二酮侧－叠氮化钠侧线虫平均数、线虫总数平均数，应用SPSS软件对化学品的5个浓度(包含对照组)做R乘C列的卡方检验，检验水准α=0.05。

2结果与分析

2.1趋避实验结果与对照组比较，若任一剂量的双侧P值＜0.05，即判断该化学品为趋避实验阳性。趋避实验为阳性的化学品共7个:二水重铬酸钠、氟化钠、乙二醇、二溴敌草快、次氯酸钠、乳酸和苯(表2)。

2.1.1化学品的趋避指数与GHS分级:随着GHS级别的升高，不同毒性等级趋避实验的阳性率有降低的趋势(表3)。

2.1.2趋避实验阳性剂量与GHS分级:随着GHS级别的升高，不同毒性等级出现趋避实验阳性的最高剂量值有增大的趋势(表3)。

2.1.3趋避实验最高剂量与24hLC50值:出现趋避实验阳性的7个化学品中，GHSIII到V级，其24hLC50值约为本趋避实验最高剂量的2～7倍;GHSVI级，其24hLC50值约为本趋避实验最高剂量的10～12倍(表4)。

2.2趋向实验结果与对照组相比较，若任一剂量的双侧P值＜0.05，即判断该化学品为趋向实验阳性。趋向实验为阳性的化学品共15个:二水重铬酸钠、氟化钠、三氯乙酸、甲醇、乙二醇、硫酸阿托品、甘油、次氯酸钠、乳酸、柠檬酸、氯化锰、氯化钠、氯化镉、硼酸、苯(表2)。

2.2.1化学品的趋向指数与GHS分级:随着GHS级别的升高，不同毒性等级趋向实验阳性率有升高的趋势(表3)。

2.2.2趋向实验阳性剂量与GHS分级:随着GHS级别的升高，不同毒性等级出现趋向实验阳性的最高剂量值有增大的趋势(表3)。

2.2.3趋向实验最高剂量与24hLC50值:出现趋向实验阳性的15个化学品中，GHSⅢ到Ⅵ级，多数化学品的线虫24hLC50值约为本趋向实验最高剂量的2～12倍(表5)。

3讨论

作为具有诸多优势的体内模式生物，线虫在毒理学研究中的应用越来越广泛，如应用线虫研究重金属［9］及农药的生态毒理学效应及其机理。在化学品的毒性筛检方面，线虫的应用也有了一定的研究成果［1，3-4］，另外，王晓祎等利用线虫对农药废水开展了相关分离组分的毒性评价研究，显示了线虫在化学品毒性评价中的重要作用。线虫的趋避实验及趋向实验是研究线虫感知行为的经典方法。2000年，Stephen等［6］通过线虫对Cu2+的趋避作用，探讨了突变体以及动力蛋白重链的缺失对线虫趋避行为的影响。Saeki等［12］通过趋向性实验，将线虫暴露于高剂量重金属离子，证明了重金属离子对线虫的感知行为有破坏作用。在本实验室前期对21种化学品进行了急性毒性研究的基础上，本研究采用GHS不同毒性等级的21个化学品的不同浓度对线虫进行6h亚急性染毒，通过趋避实验和趋向实验，观察化学品对线虫感知行为的影响，初步探讨趋避指数与趋向指数这2个非致死性亚急性指标与化学品毒性分级的联系，以及该两项指标与线虫急性毒性指标(24hLC50)的内在联系及剂量关系，并据此推荐适于今后线虫亚急性毒性研究的初始检测指标及可供参考的剂量范围。由于GHS6个毒性等级中的Ⅰ和Ⅱ级的化学品属于特殊管制类化学品，本研究只选取了Ⅲ到Ⅵ毒性等级的化学品。

3.1化学品的线虫趋避指数与其GHS分级、24hLC50有一定关联趋避实验结果显示:与对照组相比，21个化学品中有7个出现趋避实验阳性;随着GHS分级升高(化学品毒性降低)，趋避实验的阳性率有降低的趋势，趋避实验阳性的最高剂量值有随GHS级别升高而升高的趋势;GHSⅢ到Ⅴ级，线虫24hLC50值约为本趋避实验最高剂量的2～7倍，GHSⅥ级，24hLC50值约为趋避实验最高剂量的10～12倍。未染毒的对照组线虫对五水硫酸铜有一定的趋避能力，由于染毒化学品对线虫感知行为的影响扰乱了线虫的趋避能力，使线虫进入了含有铜离子的区域。本实验21个化学品中的7个有趋避能力，可以推断趋避指数可以在一定程度上反映化学品对线虫的感知行为的毒害作用。GHS毒性等级的分类是根据大小鼠的毒性实验得出的，随着GHS分级的升高，趋避实验阳性率有下降趋势，而出现趋避阳性的最高剂量则有升高的趋势，说明利用线虫的趋避指数对化学品开展感知行为的毒性评价与利用大小鼠开展毒性评价有一定的相关性。

3.2化学品的线虫趋向指数与其GHS分级、24hLC50有一定关联趋向实验结果显示:与对照组相比，21个化学品中有15个出现趋向实验阳性;随着GHS分级升高，趋向实验的阳性率有升高的趋势，且趋向实验阳性的最高剂量值也有随GHS级别升高而升高的趋势;GHSⅢ到Ⅵ级，线虫24hLC50值约为本趋向实验最高剂量的2～12倍。未染毒的对照组线虫有一定的趋向能力，染毒后的线虫由于化学品的不同或浓度的不同会对线虫的趋向能力产生一定的影响，这种影响可能是增大线虫的趋向能力，也可能是减弱这种能力。本研究中线虫趋向阳性的概率较高，说明利用线虫的趋向指数评价化学品对线虫感知行为的毒性影响有一定的价值。随着GHS分级的升高，趋向实验阳性率和出现趋向阳性的最高剂量均有升高的趋势，说明利用线虫的趋向指数对化学品开展感知行为的毒性评价与利用大小鼠开展毒性评价有一定的相关性。3.3化学品的线虫亚急性毒性检测推荐指标及推荐染毒剂量范围综上所述，本研究中的趋避指数和趋向指数与化学品毒性大小相关联，可以将这2个指数作为研究化学品的线虫亚急性毒性初始检测的推荐指标。线虫6h染毒的趋避实验的推荐染毒剂量:GHSⅢ到Ⅴ级，最高剂量为线虫24hLC50值的1/7～1/2，GHSⅥ级，最高剂量为线虫24hLC50值的1/12～1/10;线虫6h染毒的趋向实验的推荐染毒剂量:GHSⅢ到Ⅵ级，最高剂量为线虫24hLC50值的1/12～1/2。基于本实验结果，推荐今后线虫的亚急性毒性实验的最高染毒剂量为其24hLC50的1/12～1/2。

4结论

21个化学品中，二水重铬酸钠、氟化钠、乙二醇、硫酸阿托品、次氯酸钠、乳酸和苯7个化学品同时出现趋避和趋向实验阳性，且这7个化学品分布在GHSⅢ到Ⅵ级的4个毒性等级中，可以进一步说明线虫的趋避指数和趋向指数与化学品毒性大小有一定的关联性，可以将这2个指标作为研究化学品的线虫亚急性毒性检测的初始检测指标。但是，每一毒性等级并不是所有化学品均对上述两项指标敏感，说明在化学品亚急性染毒条件下，趋避指数和趋向指数作为线虫的亚急性毒性评价指标有一定的局限性，故推荐其用于评价那些对线虫感知行为有影响的化学品的亚急性非致死性毒性效应。同时，本研究的染毒剂量范围和评价模式为今后化学品的线虫亚急性毒性其他指标的评价研究提供了实验研究基础，具有一定的参考价值。

作者：曾迎新孔庆征李煜敬海明马玲宁钧宇谭壮生高珊李国君单位：首都医科大学公共卫生学院北京市疾病预防控制中心/北京市预防医学研究中心食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室