柴胡生物技术与皂苷合成生物学研究范文

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[摘要]合成生物学是解析中药活性成分生物合成途径、发掘参与生物合成功能基因的一门新兴学科。柴胡是我国常用大宗中药材，药用价值显著。柴胡皂苷是其指标性成分，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等显著活性。但目前野生柴胡资源遭到破坏，人工栽培过程中存在一定问题。生物培养技术及合成生物学的应用可扩大柴胡皂苷的来源，保护柴胡资源。不同植物的培养条件没有固定模式可遵循，不同药用活性成分的生物合成途径也是不一致的。目前，尚无柴胡组织培养技术及柴胡皂苷生物合成途径研究的综述报道。本文拟介绍合成生物学过程中用到的愈伤组织培养、不定根培养、毛状根培养与悬浮细胞培养等生物培养技术与柴胡皂苷生物合成途径及其关键酶功能基因的研究进展，建议通过借鉴其他传统根类药材的组织培养技术，对柴胡的生物培养技术进行优化，为深入研究柴胡皂苷的生物合成途径与代谢调控提供参考。

[关键词]柴胡；生物培养技术；柴胡皂苷；合成生物学；不定根；培养条件；组学

合成生物学是利用基因组测序技术、计算机模拟技术、生物工程技术和化学合成技术等设计生物工厂进而产生高价值化合物的学科。许多药用植物生长受环境影响较大且生长周期长，药用活性成分在原植物中含量低[1]。将合成生物学灵活应用到现代中药中，用于研究中药药用活性成分，是获得部分中药有效成分的重要方法之一，从而使中药资源得到有效保护与可持续利用。现已有多种中药药用活性成分进行合成生物学研究，例如丹参酮[2]、青蒿素[3]、紫杉醇[4]、柴胡皂苷[5]等。柴胡是我国常用大宗中药材，药用历史悠久，始载于《神农本草经》，列为上品，具有解热、抗炎、镇痛、免疫调节、保肝等功效，是传统中医治疗少阳证的首选药物。柴胡药用价值显著，是柴胡疏肝丸、小柴胡颗粒、逍遥丸、感冒清热颗粒等中成药的主要成分。其市场需求量逐步增大，野生柴胡资源遭到开采，蕴藏量逐渐下降。此外，野生柴胡资源存在来源地不明、种质混杂等弊端，药材均一性差、药材市场混乱导致药效不稳定。目前应用的柴胡多为人工栽培品，发芽率低、出苗不整齐、周期长、产量低；且在栽培中通常使用农药，易造成农药残留和重金属残留等问题。为了保护日渐枯竭的野生柴胡资源，保证药材质量和药效，应用现代生物技术，特别是组织培养技术，进行大规模工业化培养，对解决这些问题具有重要意义[6]。合成生物学的飞速发展，也可进一步扩大柴胡皂苷的来源，进而保护柴胡资源；其借助于人工设计或改造的微生物细胞工厂合成自然界中不易得到的天然产物，对于获取成本较高的中药活性成分的工业化生产具有重要意义。应用组织培养技术、生物合成技术皆可有效应对当今柴胡资源出现的问题。在不同植物中应用的生物培养技术是类似的，但不同植物的培养条件没有固定模式可遵循。不同药用植物中的药用活性成分不同，在不同植物体内的生物合成途径也是不一致的。目前，尚无柴胡组织培养技术及柴胡皂苷生物合成途径研究的综述报道，本文通过介绍合成生物学过程中用到的愈伤组织培养、不定根培养、毛状根培养与悬浮细胞培养等生物培养技术，柴胡皂苷生物合成途径及其关键酶功能基因的研究进展，对柴胡的生物培养技术提出可能的优化方案，为深入研究柴胡皂苷的生物合成途径与代谢调控提供参考。

1柴胡的生物培养技术研究进展

我国有柴胡属植物36种，柴胡药材来源广泛，各地使用品种不一。据调查，中国现在使用的柴胡主要有25种之多，广泛分布于除海南省以外的全国各省[7]。然而2015年版《中国药典》（一部）收载的柴胡来源仅为柴胡Bupleurumchinese或狭叶柴胡B.scorzonerifolium，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡为传统的根类药材，可以采用不定根培养、毛状根培养、悬浮细胞培养等技术获取柴胡中柴胡皂苷等药用活性成分。在生物培养过程中，可通过调节培养基成分、添加适宜浓度的外源物质、激素等促进生长、提高产量及其药用活性成分的含量。

1.1愈伤组织培养技术植物愈伤组织是薄壁松散的细胞团。愈伤组织培养是植物组织培养中的基础技术，操作步骤相对简单，且有重要的应用价值。愈伤组织培养技术指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体培养在人工配制的培养基中，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织[8]。研究发现愈伤组织在适宜的培养条件下，可产生比原外植体更多的次生代谢产物[9]。柴胡愈伤组织的常见培养方法是取柴胡无菌苗的不同部位，在添加了适宜浓度植物激素的培养基中进行诱导，即脱分化的过程。姚智等[10]发现在MS培养基中添加4mg•L-1萘乙酸（NAA）及0.2mg•L-1激动素（KT）是最适宜无菌苗诱导产生愈伤组织的条件。愈伤组织在培养过程中易出现褐化问题，研究表明采用N6培养基并在其中加入3.0mg•L-12,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），0.5mg•L-16-苄氨基腺嘌呤（6-BA）及1.5g•L-1抗褐化剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可减少培养过程中褐化问题，同时提高愈伤组织的诱导率[11]。愈伤组织不仅可以进一步再分化，诱导产生不定根、毛状根等，同时也是制备原生质体的理想材料。原生质体是去除坚韧细胞壁后裸露的植物细胞，在快速繁殖、远缘遗传重组、选育优良突变体方面有重要作用。应用柴胡的原生质体分别与胡萝卜[12]、葡萄、石防风及川西獐牙菜[13]等原生质体杂交已见报导。程玉鹏等[14]使用2%纤维素酶+1%离析酶酶解细胞壁，采用0.6mg•L-1甘露醇为稳渗剂，27℃避光预裂解2h后酶解4h时可获得较多的狭叶柴胡原生质体，为进一步研究提供了材料。

1.2不定根培养技术不定根是指从植物的非根组织上形成的根，如从茎叶等位置上长出的根。不定根的发生方式分为2种，一种为直接生发，即从茎，叶，枝条上直接生长出不定根；另一种为间接生发，即先产生愈伤组织，再进行分生、分化，最后产生不定根原基。不定根培养的增殖速度快，获取量多[15]。杨东方等[16]通过直接生发实验，在MS或1/2MS培养基中分别添加不同浓度的吲哚丁酸（IBA）进行北柴胡的带侧芽茎段不定根诱导，不定根诱导成功率在80%以上，效果显著。在间接生发实验中，培养基中通常可加入各种植物激素、前体物质、诱导子、抑制剂等诱导愈伤组织，可以提高柴胡不定根中有效成分含量[15]。实验发现NAA更适于诱导愈伤组织产生不定根，并且宜在黑暗条件下诱导产生愈伤组织和不定根[10]。若选择丛生芽诱导不定根的方法，余马等[17]选择北柴胡带叶嫩茎段为外植体，在基本培养基中加入1.0mg•L-16-BA诱导产生的不定芽数量多、鲜重及干重高、叶绿素含量高。剥离丛生芽放入0.1mg•L-1NAA的基本培养基中，诱导产生的不定根个数多、叶绿素含量高。在不定根诱导产生次生代谢物柴胡皂苷实验中，关倩[15]发现在基础培养基中添加不同浓度前体物质、诱导子均可不同程度的提高北柴胡中柴胡皂苷含量。采用分步控糖法，控制蔗糖质量分数为5%时适宜北柴胡不定根生长和皂苷合成。通过补加培养基的方法也可延长不定根生长及柴胡皂苷合成的时间。王梅等[18]以3种产于山西万荣、左权、芮城的柴胡为原植物体，在基础培养基中添加乙酸钠、水杨酸（SA）和Cu2+，均有利于不定根合成柴胡皂苷。战晴晴等[19]利用茉莉酸甲酯处理北柴胡不定根，发现其对柴胡皂苷的积累有明显促进作用。Hilo等[20]研究指出，铁元素及铵根离子（NH4+）可以加速不定根的生成，进而提高次生代谢物的合成速率。目前，关于柴胡不定根培养技术的研究相对较多[10,15-20]，培养条件日益成熟。选择不同的生物反应器、尝试添加不同的诱导子，不定根的生长速率及其柴胡皂苷的含量可能会进一步提高。

1.3毛状根培养技术毛状根培养于1980年展起来，是将基因工程与细胞工程相结合的一项生物技术，1977年首次用发根农杆菌侵染高等植物获得毛状根，通过将发根农杆菌中Ri质粒的转移DNA（T-DNA）整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生毛状根。毛状根具有生长迅速、生长条件简单、次生代谢物合成产量高且稳定、不需外源激素、在无激素培养基上也能快速生长等优点。例如可培养罂粟毛状根来获得苄基异喹啉类生物碱，以此减少罂粟的种植，且安全有效[21]。影响毛状根生长及有效成分积累的因素很多，如物理因素、化学因素、诱导子等[22]。物理因素常见的有光照、温度、水、溶氧情况和pH等，化学因素常见的有培养基类型、外源激素、前体物质[23]等，诱导子可分为生物诱导子（如细菌、真菌）和非生物诱导子[如茉莉酸甲酯（MeJA），SA及重金属等]。孙晶等[24]研究指出在添加0.5mg•L-1IBA的B5培养基中，毛状根和柴胡皂苷产量最高，分别为2.4g和9.05mg。YANG等[25]研究显示，酵母抽提物（YE）和Ag+可提高丹参毛状根中次生代谢物含量，因此可尝试在柴胡毛状根培养基中加入不同的诱导子来提高柴胡皂苷的含量。柴胡毛状根培养方面所做的研究较少，特别是南柴胡毛状根的培养，这可以作为下一步的重点研究方向。

1.4悬浮细胞培养技术植物悬浮细胞培养技术是将植物愈伤组织加入装有特定培养基的培养瓶中，并在摇床中振荡培养，来得到植物代谢产物。影响柴胡悬浮细胞生长速率的因素有愈伤组织接种量、培养基体积和外源物质种类及其浓度等。在悬浮细胞培养过程中，其生长分裂需具有一定的初始细胞密度，但细胞密度过高则细胞液泡膨胀，容易积累有害物质进而影响次生代谢物的合成。程玉鹏等[26]验证狭叶柴胡悬浮细胞的最佳生长条件是无菌条件下取狭叶柴胡愈伤组织2.0g，将其放入装有MS发酵液100mL的250mL锥形瓶中，细胞鲜重增加2.342g。周永强[27]分析狭叶柴胡悬浮细胞干重随时间变化的曲线，得知在第15天时，细胞干重最大，若在培养基内添加250mg•L-1水解酪蛋白可得细胞最佳收获量。另外，也可尝试添加不同的外源物质如Mg2+等来提高细胞收获量。悬浮细胞培养技术步骤简单，但相关实验开展不多，可进一步优化其培养条件，得到稳定的培养体系。

2柴胡皂苷合成生物学研究进展

合成生物学的研究包括解析化合物的生物合成途径，明确其中关键酶基因功能，进而构建人工系统，优化培养方案，实现大规模生产。目前柴胡皂苷详细的生物合成途径尚不完全明晰，但合成途径上游中间体及相关酶基因已经有所报道，下游细胞色素P450酶基因与糖基转移酶（UGT）基因还未研究透彻。

2.1柴胡皂苷的生物合成途径根据现有研究推测柴胡皂苷合成主要包括3个阶段，分别为前体形成、三萜骨架的搭建、结构修饰。柴胡皂苷的生物合成途径见图1。

2.2柴胡皂苷合成途径中关键酶功能基因研究2.2.13-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）基因由乙酰辅酶A（乙酰CoA）形成3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A（HMG-CoA），然后在其还原酶HMGR的催化作用下生成甲羟戊酸（MVA）。生成的MVA是类异戊二烯生物合成途径中的重要前体，HMGR基因是此途径中的第1个限速酶[28]，此过程是不可逆反应。董乐萌等[5]采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从北柴胡植株中克隆了HMGR基因互补脱氧核糖核酸（cDNA）片段，并对获得的序列进行初步分析，通过DNAMAN软件，在HMGR氨基酸序列中发现了2个功能烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）结合基序，分别为DAMGMNM和GTVGGGT。2.2.2异戊烯基焦磷酸异构酶（IPPI）基因柴胡皂苷属于类异戊二烯化合物，是由异戊烯基焦磷酸（IPP）与其烯丙基异构体二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）缩合后经一系列催化反应而形成[29]。其中IPP和DMAPP的相互转化由IPPI催化。IPPI是类异戊二烯化合物生物合成过程中的关键酶[30]，大多数植物体细胞内存在2种不同亚细胞定位的IPPI[31-32]。董乐萌等[5]报道了北柴胡柴胡皂苷合成途径中关健酶基因IPPI的cDN段，获得了新的基因片段序列，并通过构建植物IPPI的分子进化树表明，北柴胡IPPI基因与伞形科植物（胡萝卜和三岛柴胡）亲缘关系最近。隋春等[33]利用PCR矩阵法快速筛选出北柴胡全长cDNA文库，并首次克隆出生物合成途径中关键酶之一的IPPI的全长cDNA，此基因核苷酸序列长1117bp，编码了319个氨基酸。2.2.3鲨烯合酶鲨烯合酶（SS或SQS）是植物甾醇和三萜化合物生物合成的关键酶，其定位于细胞内质网膜，催化两分子的法呢酰基二磷酸（FPP）缩合生成植物甾醇和三萜类化合物形成的第一个前体——鲨烯。隋春等[34]等根据氨基酸序列的同源性构建了32种植物中43条蛋白序列的系统发育树，结果表明不同植物来源的氨基酸序列长度差别不大，同一种植物的2条氨基酸序列差异也不大，由此得出氨基酸在进化过程中相对保守。以北柴胡不定根为材料，运用Trizol法提取总RNA，从北柴胡中扩增出鲨烯合酶cDNA特异性片段，并进行了克隆与测序。测序结果显示得到了2个序列不同的cDNA（BcSS1和BcSS2），序列长度分别为1245bp和1248bp，分别编码了414，415个氨基酸。2.2.4β-香树脂醇合成酶（β-AS）β-AS是合成各类三萜类产物的前体，由于大多数三萜类皂苷是由齐墩果烷和达玛烯衍化而来的，因此β-AS对三萜类皂苷的合成有举足轻重的作用。董乐萌[35]利用RT-PCR从北柴胡中扩增出了β-AS，并发现β-AS基因在根中的含量最高，是叶子中含量的11.5倍。2.2.5细胞色素P450酶植物细胞色素P450酶具有广泛的催化活性，参与了苯丙烷类、植物激素、生氰糖苷类、萜类、生物碱等化合物的生物合成，被称为“万能生物催化剂”。其催化作用的共同特点是在前体分子中加入1个氧原子。在三萜皂苷的生物合成中，细胞色素P450酶主要催化三萜骨架惰性甲基和亚甲基的氧化。但细胞色素P450酶催化反应很复杂，对其的研究为数不多。徐洁森[36]利用454高通量测序获得5'和3'端部分cDNA序列基础上，利用长距离-PCR（LD-PCR）获得全长cDNA，扩增到了北柴胡细胞色素P450酶基因BcCYP87E并构建了这一基因的过量表达载体，但该基因功能尚未验证。2.2.6UGTUGT位于三萜皂苷生物合成途径下游，其可催化三萜骨架糖基化。UGT在生物体内将糖基催化活化并连接到不同的受体分子如蛋白、核酸、寡糖等。糖基化的产物具有很多生物学功能，现普遍认为代谢物和外源物的糖基化可调整其稳定性、生物活性、溶解度以及信号存储或者内部运输、胞间运输等[37-38]。在植物体的调控和代谢途径中UGT通过对一系列化合物的激活、抑制或者是溶解度调节而发挥作用。三萜皂苷的苷元糖基化是决定三萜皂苷生物活性的重要一步。三萜皂苷的糖基通常是由寡聚糖链和2~5个单糖单元构成，糖链和单糖较多连接在皂苷元的C-3或C-28位置。徐洁森[36]在454高通量测序已获得部分cDNA序列基础上，通过cDNA末端快速扩增技术（RACE）和LD-PCR扩增全长cDNA克隆。得到北柴胡其中1个UGT基因，并命名为BcUGT10。构建了这一基因的过表达和抑制表达转基因载体，但北柴胡中还有部分UGT基因尚未发掘。

3展望

生物培养技术与合成生物学的结合日益密切，二者之间相辅相成。例如在研究基因功能的实验中所用的基因沉默、过表达技术[39]，可用转入特定载体的发根农杆菌侵染外植体的方法获得毛状根来进行深入研究。此外也可在原生质体、毛状根中[40]转入外源如绿色荧光蛋白等蛋白质基因，以进一步研究基因功能。今后，生物培养技术势必将更广泛地运用于合成生物学中，加速柴胡皂苷生物合成途径的解析过程。在生物培养技术应用过程中，培养条件将逐渐被优化，方法也会更加成熟。毛状根、悬浮细胞等可导入或沉默相关代谢途径中的基因，以此来产生更多的次生代谢产物。二者的相辅相成可扩大柴胡皂苷的来源，进而提高和保证药材质量，这也是解决如今柴胡资源混乱、野生资源匮乏的重要途径。柴胡应用广泛，药效明显。因此其不定根培养、毛状根培养、悬浮细胞培养等技术的研究与应用具有广阔前景。但每种植物都有其特殊性，每种植物的诱导模式没有固定模式可循，且受多种因素影响，因此，在柴胡生物培养技术领域还有很多方向值得研究。由于不定根的特殊形态，在传统容器内培养可能不利于其增长，生物反应器可为不定根提供良好的生长环境[41]。同为根类入药的人参，在不定根培养过程中应用生物反应器的方式已经成熟，且研究得知应用生物反应器可提高人参不定根中皂苷类成分的含量[42]。目前利用生物反应器培养柴胡不定根、愈伤组织、毛状根的研究尚未见报道，可尝试应用此方法来提高柴胡组织的培养效率。毛状根培养技术发展时间较短，但柴胡的毛状根培养体系还需优化。目前柴胡大多采用外植体接种法产生毛状根，但此方法要求在严格无菌环境下操作且耗时较长。提示柴胡的毛状根培养体系优化及考察还需深入研究。药用植物丹参近期已有原位土培侵染产生毛状根的报道，在植株生长的自然条件下即可侵染产生毛状根，这种方法省时、简单、便于操作[43]。说明开发柴胡新的毛状根诱导途径成为可能，但柴胡毛状根是否可以代替传统柴胡药材应用还需要考证。黄志成等[44]在丹参毛状根与丹参药材进行对比的实验中发现，不添加诱导子或添加Ag+，脱落酸（ABA）和YE等诱导子产生的毛状根与丹参药材的指纹图谱相似度并不高，甚至很低，且有效成分含量大幅低于药材。研究柴胡内生真菌或许可开发新种类的抗生素、扩大柴胡次生代谢物生产途径，具有广阔的推广前景。植物内生真菌是指其在生活史中某一段时期生活在植物组织内，对健康植物组织不引起任何病害症状的所有真菌。和植物体存在一定的寄生关系，很多真菌带有植物体的酶系，不仅可以促进植株生长、赋予植株抗逆性，还可以产生和寄主植物相同的次生代谢产物。目前，已有初步分离野生柴胡[45]及狭叶柴胡[46]内生真菌的报道，并且初步验证其中一些菌类有抗菌活性，但还需更加深入的研究。研究柴胡内生真菌或许可开发新种类的抗生素、扩大柴胡次生代谢物生产途径，具有广阔的推广前景。随着技术的发展及研究的深入，基因组学和转录组学、蛋白质组学、生物信息学等生物技术的不断发展和融合[47-48]，其将越来越广泛地应用于柴胡皂苷生物合成途径研究中，为柴胡次生代谢工程的研究注入新活力，同时，技术的快速发展为柴胡次生代谢物的大量合成提供了新思路和新工具。合成生物学最终的目的是要用于生产，在投入生产前还需进行一些必要研究，首先要找到完整的合成途径，其次可利用最新的CRISPR/Cas等技术对工程菌进行改造，通过对调控柴胡皂苷有影响的因素进行研究，找到合适的高产载体作物，将合成工艺系统进行优化，最终实现生产。

作者：王晨 安立成 李剑超 戚文涛 刘长利 李莉 单位：首都医科大学