蔬菜中有机酸与磺胺类抗生素探析范文

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《分析试验室》2016年第10期

摘要:

建立了同时提取和测定蔬菜中有机酸与磺胺类抗生素的方法。通过对液相色谱分析条件的优化，建立了以PenomenexC18为分析柱，以0.5%(NH4)2HPO4-H3PO4溶液(pH3.0)为流动相，柱温30℃，流速1.0mL/min，紫外检测器检测波长为210nm和270nm的检测方法。并比较了水提取，0.1%H3PO4，0.5%(NH4)HPO4，0.5%KH2PO44种不同溶液对有机酸和磺胺的提取效果。结果表明:4种提取方法下，乙酸、柠檬酸提取率无显著性差异，草酸、苹果酸、富马酸、磺胺(SA)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)均以水提的效果较好。7种有机酸和2种磺胺类抗生素线性关系良好，检出限为0.21～1.95ng/g，样品的加标回收率81.2%～96.2%，相对标准偏差(RSD)小于8.6%，方法适用于蔬菜中有机酸和磺胺类抗生素快速、高效的分离。

关键词:

高效液相色谱;蔬菜;有机酸;磺胺类抗生素

有机酸广泛存在于植物体内、根际区域和土壤环境中。一方面，有机酸作为水果、蔬菜中的特有成分，它的种类和含量不单决定着果蔬的风味以及品质的好坏，也是果蔬加工贮藏的重要依据。另一方面，当植物处于不良环境中时，植物根系会分泌一些物质(特别是有机酸)以适应胁迫环境，其在环境污染和修复方面发挥着重要作用。磺胺类药物(SAs)造成土壤污染，孔晶晶等［1］发现，磺胺氯哒嗪钠、磺胺甲恶唑等磺胺类药物的吸附能力随土壤pH的升高而降低，与土壤中有机质和含量呈正相关。朱斐雯等［2］发现，苹果酸和乙酸是影响磺胺嘧啶在玉米根系土壤中降解的关键因素。有机酸影响着污染物从土壤向植物的迁移，对防止SAs类药物经由植物体吸收进入人体危害人类健康具有重要意义。目前有机酸的测定通常采用气相色谱法(GC)［3］、离子色谱法(IC)［4，10］、高效液相色谱法(HPLC)。而HPLC操作简单、准确度高、重现性好，可同时定量测定多种有机酸，已获得广泛的应用［5］。检验环境中抗生素污染的方法主要有液相色谱分析法和色谱－质谱联用分析法［6，11］。本文建立了同时测定蔬菜中有机酸和SAs的高效液相色谱分析法，既为判断植物性食品的品质以及评价SAs随植物性食品进入食物链的风险提供了前提条件［7～9］，也为展开环境中有机酸的动态变化、SAs降解等机理研究提供了理论支撑。

1实验部分

1.1仪器与材料

Agilent1290液相色谱系统(美国Agilent公司);H-1650台式高速离心机(上海穗康公司);Milli-Q超纯水制备系统(美国Millipore公司);StrataC18-E固相萃取小柱(3mL，Phenomenex)公司;HLB固相萃取小柱(3mL，Phenomenex公司)。7种有机酸标准品(纯度＞99%，中国标准物质中心);磺胺(SA)和磺胺二甲基嘧啶(SM2)标准品(纯度＞99%，上海阿拉丁公司);乙腈(色谱纯);H3PO4，NaOH(AR);K2HPO4，(NH4)2HPO4标准品(纯度＞98.5%，国药集团化学试剂公司);实验用水均为超纯水(18.2MΩ•cm)。

1.2标准溶液配制

准确称取草酸、苹果酸、柠檬酸各500.0mg，富马酸、α－酮戊二酸各50.0mg，用超纯水溶解并定容至50mL;准确量取乙酸2.0mL，丙酮酸100μL，用超纯水定容至50mL;准确称取50mgSA，SM2标准品，溶于1mL0.05moL/LNaOH溶液，调节pH至中性，用超纯水稀释定容至50mL，配制成有机酸和磺胺类标准储备液，在4℃下避光保存，根据实验需要稀释成不同浓度的工作溶液。

1.3样品前处理

将青菜、菠菜叶片用超纯水洗净，擦干，剪碎混匀后各称取2.50g，加入2.0mL提取液研磨匀浆，将均浆液全部移入50mL离心管中，再用1mL提取液洗涤并转至离心管，重复3次，总体积为5mL，每组设置平行样3个，30℃下振荡提取30min，提取液于12000r/min转速下离心20min，收集上清液，取上清液过0.22μm滤膜后，待测。

1.4色谱条件

色谱柱:PenomenexC18(150×4.6mm);柱温:30℃;流动相:A为0.5%(NH4)2HPO4-H3PO4(pH3)缓冲液，B为乙腈;流速为1mL/min;紫外检测波长210，270nm;进样量20μL。洗脱梯度见表1。

2结果与讨论

2.1色谱条件的优化

2.1.1流动相的选择

分别采用乙酸－乙腈、KH2PO4－乙腈、(NH4)2HPO4溶液－乙腈作为流动相进行分析测定。结果表明，以乙酸溶液为流动相时，色谱峰不能实现有效分离;以KH2PO4溶液为流动相时，单个化合物出现双峰;以(NH4)2HPO4为流动相时有机酸和SAs都能得到较好的分离，色谱峰的峰形尖锐，对称性好。因此，选择(NH4)2HPO4为流动相。配制了质量分数分别为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的(NH4)2HPO4的溶液(用H3PO4调pH3)。色谱分离结果表明，当(NH4)2HPO4溶液为0.5%时，有机酸和SAs均可获得较好的分离效果和色谱峰形。因此本实验选择0.5%(NH4)2HPO4溶液作为流动相。

2.1.2流动相pH、配比的选择

用H3PO4分别调节流动相pH为2，2.5，3，3.5。结果发现，流动相的pH变化直接影响化合物的分离效果，当流动相pH3时，各化合物获得最佳分离效果。因此选择pH3的(NH4)2HPO4溶液。考察了在磷酸盐缓冲体系中加入有机相对有机酸和SAs的洗脱速度和分离度的影响。有机相中乙腈的含量越高，洗脱速度越快;磷酸盐的含量越高洗脱速度越慢，分离度越高，因此可以调节乙腈和(NH4)2HPO4的比例将目标峰在较短的时间分离。对于有机酸分离，选择(NH4)2HPO4(0.5%，pH3):乙腈=100:0(V:V)作为流动相时，7种有机酸在6min内能实现完全分离，各组分间分离度大，峰形尖锐，且对称性好。对于SAs的分离，选择(NH4)2HPO4(0.5%，pH3):乙腈=15:85(V:V)作为流动相时，使SA的出峰时间由12min缩短到7.4min，SM2出峰时间由24min缩短到20.7min。有机酸和SAs的标准品的色谱图如图1所示。

2.1.3检测波长、柱温和柱压条件

通过紫外检测器扫描了有机酸和SAs在190～400nm范围内的吸收，确定有机酸的最大吸收波长为210nm，SAs的最大吸收波长为270nm，因此，选择检测波长为210，270nm。选择了25℃，30℃，35℃3个柱温进行比较，发现有机酸和SAs的分离均不受柱温变化的影响，综合考虑确定柱温箱温度为30℃。本实验所用的HPLC色谱系统柱的最高压限值为6MPa，为保持在合理范围内，实验过程中流速控制在1mL/min，柱压基本保持不变，范围在2MPa左右。

2.2提取条件的选择

2.2.1提取液

考察了蒸馏水、0.1%H3PO4溶液以及不同pH的磷酸盐溶液对青菜和菠菜中有机酸和磺胺抗生素的提取效果。结果发现，水提取和0.1%H3PO4溶液对青菜和菠菜中有机酸和SAs提取效果较好，而采用不同pH(pH2.2，3，5，6，7，8)的0.5%(NH4)2HPO4和0.5%KH2PO4为提取液时提取率均较低。以蒸馏水和0.1%H3PO4(pH2.2)为提取液时，有机酸的提取率无显著差异，但蒸馏水直接提取的SAs回收率有所提高。因此，实验选择蒸馏水作为提取液。

2.3标准工作曲线

标准样品质量浓度范围为0.01～1000mg/L之间，设置10个浓度梯度，在上述色谱条件下进行检测，以质量(x)与峰面积(y)进行线性回归，得出各有机酸和SAs的标准曲线(见表2)，相关系数R2＞0.9999，以3倍信噪比(S/N=3)求得7种有机酸的检出限为0.21～1.95μg/kg，2种SAs的检测限为0.82～1.08μg/kg，并以线性范围的下限浓度作为本实验实测样品的定量限。结果表明，有机酸和SAs分别在1～1000mg/L和0.01～1mg/L范围内线性良好，可满足定量分析的要求。

2.4回收率和精确度

取相同的青菜样品3组，其中1组作本底，测定各有机酸和SAs的含量;另外2组分别添加2个浓度水平的7种有机酸和2种SAs的混合标准溶液，加标后放置12h进行老化平衡，按1.3节方法进行前处理，每组样品做6次平行实验，根据加入标准品的质量浓度与检出质量浓度计算回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表3。

3结论

建立了一种同时测定蔬菜中有机酸和SAs的高效液相色谱法:7种有机酸和2种SAs在0.01～1000mg/L范围内线性良好，相关系数R2＞0.9999，有机酸的检测限为0.21～1.95μg/kg，SAs的检测限为0.82～1.08μg/kg，本方法准确可靠，提高了灵敏度。分析结果表明，不同提取方法对不同试验材料的提取效果存在差异，综合考虑发现采用蒸馏水直接提取的方法既能有效保证有机酸和SAs的提取量，又避免了不同的介质提取带来的实验误差，调高了实验效率。加标回收率试验表明，青菜中7种有机酸和2种SAs的回收率在81.2%～96.3%之间，RSD范围为3.3%～8.6%，可用于蔬菜样品中有机酸和SAs的检测。针对市售青菜和菠菜检测发现，蔬菜中SAs均有检出，虽然其含量相对较低，但存在潜在的健康风险。

参考文献：

［1］孔晶晶，裴志国，温蓓，等．环境化学，2008，27(6):737

［2］金彩霞，朱斐雯，李明亮，等．环境科学学报，2013，33(3)，814

［3］张霞，刘志华，杨光宇，等．分析测试学报，2014，33(5):545

［4］胡静，赵瑞峰，施文东，等．分析测试学报，2011，30(10):1171

［5］金高娃，章飞芳，薛兴亚，等．分析化学，2006，34(7):987

［6］李学德，鲜啟明，刘红玲，等．分析化学，2010，38(3):429

［7］王平，周荣，色谱，2006，24(3):239

［9］包艳萍，李彦文，莫测辉，等．环境科学，2010，29(5):513

［10］李桂镇，范伢，穆凯艳，等．分析试验室，2015，34(8):913

［11］张婷婷，王静静，巩志国，等．分析试验室，2016，35(3):287

作者:徐慧敏 施婷婷 檀华蓉 司雄元 单位:安徽农业大学茶与食品科技学院 安徽农业大学资源与环境学院 安徽农业大学生物科技中心