多种雌激素残留的质谱分析范文

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《分析测试技术与仪器杂志》2016年第2期

摘要:

建立了同时测定7种雌激素残留的液相色谱－串联质谱法．在最优条件下，待测物呈现良好的线性关系，相关系数均大于0．9957，检测限介于0．5000～50．00ng/mL范围．鱼肉组织经C18小柱净化浓缩，4．0mL乙腈－水(体积比5∶95，%)淋洗，2．0mL乙腈－水(体积比95∶5，%)洗脱．三类鱼肉样品中(鮦鱼、龙胆鱼、多宝鱼)均检出双酚A和己二烯雌酚，部分样品中检出雌二醇和雌酮，加标回收率为85．70%～120．9%．方法快速、准确，适用于水产品中雌激素多残留的高效测定．

关键词:

雌激素;固相萃取;液相色谱;串联质谱;水产品

雌激素是一类常见的内分泌干扰物，会扰乱机体内分泌物的正常生成、转化、代谢和结合，造成生物体免疫、生殖功能异常［1－2］．近年来，避孕药和畜牧养殖用药使用量激增，在湖泊、河流、污水中均存在雌激素富集的现象，导致鱼类出现严重性畸形［3］．对人类而言，雌激素通过食物链转移，进入人体可诱发儿童性早熟，对成人生育功能也有影响，尤其对女性影响最为明显，易造成流产、婴儿出生缺陷等问题，甚至诱发卵巢癌、乳腺癌等疾病［4－5］．因此，雌激素对环境、生态和人类的影响备受关注，有必要建立灵敏、科学的方法分析雌激素．目前，雌激素多残留检测分析方法已有综述［6－7］，主要包括气相色谱［8］、气相色谱－质谱联用法［9－10］、液相色谱法［11－12］、液相色谱－质谱联用［13－16］等．其中，液相色谱－串联质谱(HPLC－MS/MS)以选择性强、灵敏度高的特点，应用最广．四级杆飞行时间质谱(QTOF－MS)灵敏、分辨率高、特异性强，基于碰撞诱导解析和二级质谱功能，提供化合物的结构断裂原理，在雌激素等药物残留检测中具有良好的应用前景．

1试验部分

1．1仪器与试剂

1200系列液相色谱－6520型四级杆飞行时间串联质谱仪(Agilent，USA);Milli－Q超纯水系统(Milipore，USA);7018－00固相萃取装置(JTBaker公司)．雌三醇(E3)、双酚A(BPA)、雌二醇(E2)、2，4－二氯苯酚(2，4－dcp)、己二烯雌酚(DE)购自Sigma－aldrich公司，炔雌醇(EE)、雌酮(E1)购自德国DrEhrenstorferGmbh公司．乙腈为色谱纯(Sigma－aldrich公司)，乙酸铵购自天津市福晨化学试剂厂，试验用水为超纯水．所有试剂使用前过滤．

1．2溶液配制及工作曲线绘制

标准溶液:准确称取适量标准品，乙醇溶解，配制成1000μg/mL储备液，4℃贮存．乙酸铵溶液:称取0．77g乙酸铵，定容至1000mL，稀释成5．0、1．0mmol/L溶液，用于后续试验．工作曲线绘制:混合标准母液用超纯水逐级稀释，获得一系列混标工作溶液．在最优条件下测定，根据峰面积与相应浓度的关系绘制工作曲线．

1．3液相色谱－质谱条件

色谱柱AgilentZorbaxSB－C18(Φ5μm，4．6×150mm);流动相为H2O(A)－乙腈(B)二元体系;梯度洗脱;流速0．4mL/min;进样量8μL;柱温35℃．质谱选择ESI(－)和多反应监测模式;干燥气温度350℃、流速10L/min;雾化气压力0．276MPa;毛细管电压3500V;碎裂电压140V;2GHz动态拓展采集模式;m/z100－310．试验所用气体为氮气(纯度＞99．9%)，碰撞气为高纯氮气(纯度＞99．999%)．

1．4样品处理

样品提取:鮦鱼、龙胆鱼、多宝鱼购自福州马尾水产品批发市场．鱼类去头、鳞、骨及内脏，取鱼肉组织，液氮中研磨成鱼粉．称取0．50g鱼粉，加入5．0mL乙腈，超声提取10min，10000r/min下离心10min，取上清液．残渣再用2．0mL乙腈重复提取，合并两次上清液．提取液用正己烷脱脂，每次用量3．0mL，重复操作二次，弃去正己烷，氮气吹干，用2．0mLH2O溶解待用．固相萃取(SPE):BondElut－C18小柱(200mg/3mL，Agilent公司)用3．0mL甲醇活化、3．0mL水平衡，提取液过柱，4．0mL乙腈－水(体积比5∶95，%)淋洗、2．0mL乙腈－水(体积比95∶5，%)洗脱，收集洗脱液，氮吹浓缩，H2O定容至1．0mL，过滤后供HPLC－MS分析．

2结果与讨论

2．1色谱流动相选择

选定ZorbaxSB－C18色谱柱(Φ5μm，150×4．6mm)，考察乙腈－水、乙腈－1．0mmol/L乙酸铵及乙腈－5．0mmol/L乙酸铵作为流动相的效果，结果如图1(a)所示．试验结果表明，乙酸铵浓度增大，雌激素峰面积总体呈下降趋势．故采用乙腈－H2O为流动相，此时色谱峰响应高、分离效果理想．在分离复杂混合物时，梯度洗脱能提高分析效率、改善分离度．尝试了多种梯度方案对混合物分离的影响．结果发现，最优的梯度洗脱程序为:0～4．0min，维持65%B;4．0～4．1min，65%～97%B;4．1～8．0min，维持97%B;8．0～8．5min，97%～65%B，流速为0．4mL/min．在单次分析结束后，充分冲洗和平衡色谱柱．

2．2MS条件的优化

7种雌激素的化学结构式如图2所示，其结构中含有不同数量的羟基或氯原子，首选ESI(－)检测．为保证母离子良好的传输效率，优化了质谱碎裂电压的影响，如图1(b)所示．当碎裂电压介于140～150V之间，大部分物质的响应值基本恒定，故选取碎裂电压为140V．其他质谱参数的选择是为了改善喷雾效果和电离状况，提高方法的灵敏度．经优化，确定干燥气温度350℃，干燥气流速10L/min．最优条件下，待测物在8min内实现分离，且形成很强的［M－H］－母离子峰和明显的同位素峰(如图3所示)．

2．3前处理方法探索

对比了两种C18小柱的萃取效果．结果发现，ProElut－C18小柱对E3和BPA的回收率不理想(低于50%)．提取液经BondElut－C18小柱过柱，采用5%、10%、20%的乙腈－水溶液淋洗．乙腈含量越高，淋洗液的洗脱能力越强．5%乙腈－水淋洗时，后续检测杂质稍多，但利用质谱提取离子功能，目标物测定不受影响且回收率较高．考察乙腈质量分数在80%～100%的洗脱效果．当乙腈质量分数低于90%时，后续浓缩步骤耗时长、回收率不高;乙腈质量分数为95%时的洗脱效果与100%乙腈接近，因此选择95%乙腈将目标物洗脱．优化了洗脱液体积(1．0～3．0mL)，发现用量为2．0mL时，目标物回收效果较好．因此，BondElut－C18小柱以4．0mL5%乙腈－水淋洗，2．0mL95%乙腈洗脱．相较于液液萃取，SPE法操作简便、节省有机溶剂．

2．4二级质谱解析

利用串联质谱对分析物进行结构分析(如图4所示)．E2、E3、EE和E14种组分具有相同母核，形成共同的碎片离子峰m/z145．0637(或143．0491)、183．0798，上述物质的断裂原理与文献［17－18］相符．BPA苯环侧链上两个甲基空间位阻大，推测丢失—CH3、—C6H6O、—C3H4等自由基碎片．2，4－dcp对应的碎片离子m/z124．9776、89．0034为连续丢失—Cl所得．DE是苯二烯类化合物，分别形成［M－H－CH3］－．、［M－H－C3H6］－．、［C6H5O］－．等碎片．后3种物质的多级质谱断裂途径鲜见报道(如图5所示)．

2．5方法验证

精确配制7种雌激素的系列标准混合液，考察线性关系，以3倍信噪比为检测限，结果如表1所列．方法的检测限为0．5000～50．00ng/mL，相关系数介于0．9957～0．9999范围内．以200ng/mL标准混合液(BPA40ng/mL，EE400ng/mL，其余组分为200ng/mL)进行精密度试验，连续5天进样，日间RSD小于9．074%，表明方法稳定且重现，适合于7种雌激素的定量分析．

2．6鱼肉样品分析

鱼肉样品中雌激素的计算公式为:Cx=Ci×V/m，其中，Ci为各化合物质量浓度(由标准曲线计算，ng/mL)，V为样品处理最后定容的溶液体积(mL)，m为鱼粉质量(g)．试验发现，鱼肉样品基质复杂，虽经SPE净化，在质谱总离子流图中干扰峰仍较多．利用QTOF质谱的提取离子功能结合保留时间、精确质量数等信息，3种鱼肉中均检出BPA和DE，部分样品检出E2和E1残留(如表2所列)．向龙胆鱼样品添加两个不同质量浓度的目标物，每个水平测定3份样，计算回收率(如表3所列)．由表3可得，目标物回收率大于85．70%，RSD为0．8370%～3．568%，表明方法可靠，满足分析检测的要求．

3结论

建立了固相萃取－液相色谱－串联质谱快速测定7种雌激素残留的方法．结合Q－TOF－MS/MS定性精确、结构信息丰富的特点，推测了部分雌激素的裂解途径．此研究能为水产品中激素类药物残留的快速鉴定提供分析手段，也有助于了解雌激素残留分布的规律，为保证食品安全提供方法借鉴．

参考文献:

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作者:卢巧梅 单位:福州大学食品安全与检测重点实验室