端粒长度在辐射损伤研究中的应用范文

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《辐射防护通讯杂志》2016年第3期

摘要：

介绍了端粒长度主要检测方法TRF、Q-FISH、FlowFISH、Q-PCR、STELA的基本原理及其优缺点，端粒检测在辐射损伤研究及辐射流行病学调查和临床研究中的应用，以及本实验室改进后的Q-PCR方法及其应用。

关键词：

端粒;长度变异;检测;辐射损伤

端粒是位于真核细胞线状染色体末端的一段DNA蛋白质复合体。它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，其作用是维持染色体的完整性，防止染色体末端被DNA损伤修复系统意外识别为DNA双链断裂［1］。端粒长度能够反映端粒保持和消蚀状态以及细胞的复制潜能，长度变异是研究端粒辐射损伤的一个重要指标。本文介绍端粒长度的主要检测方法及其在辐射损伤研究中的应用，以期为端粒辐射生物学研究提供新的方法学借鉴。

1端粒长度检测方法

端粒长度的主要检测方法包括:端粒限制性片段(TRF)、定量荧光原位杂交(Q-FISH)、流式荧光原位杂交(FlowFISH)、定量聚合酶链式反应(Q-PCR)、单个端粒长度分析(STELA)。

1．1方法

1．1．1TRF［2］

TRF方法是通过索瑟恩印迹法来评估细胞群的平均端粒长度。多年来，它是端粒研究领域的唯一定量的方法，是其它方法的参考，被视为金标准。TRF方法的基本检测原理是将待检样本的基因组DNA用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并按其在凝胶中的位置转移至硝酸纤维素膜上，固定后与荧光标记的端粒DNA特异探针进行杂交，将游离探针洗涤后检测荧光信号。根据端粒DNA条带荧光信号强弱，可获得待检样本的平均端粒长度。并且由于不同的限制性核酸内切酶作用位点不同，获得的端粒长度也不同。TRF由于所用的限制性核酸内切酶、起始DNA的数量和质量，以及斑点分析技术方面的差异，可能导致TRF多次测出的端粒长度数据不易横向比较。

1．1．2Q-FISH［2］

Q-FISH方法的检测原理是利用对DNA寡聚核苷酸具有选择性高亲和力的荧光标记(CCCTAA)3肽核苷酸(PNA)探针与中期染色体端粒DNA序列进行杂交，通过激光共聚焦显微镜获得中期染色体及其端粒的荧光图像，检测一个中期相中所有端粒的总荧光强度，并与参考细胞的染色体中期相的总荧光强度进行比较，获得相对端粒平均长度(包括纯端粒区和部分可变区)。每个样本需要分析15～20个中期相。Q-FISH方法也可用于检测＜0．5kb的端粒序列以及染色体融合，但是不适于检测有丝分裂指数非常低的细胞类型。

1．1．3FlowFISH［2］

与Q-FISH相似，FlowFISH方法的检测原理是用荧光标记PNA探针与细胞在混悬液中杂交，洗涤掉游离的探针后，杂交产物的荧光信号被流式细胞仪测量，可获得细胞群所占比例及其相对端粒长度。FlowFISH能够测量同一样本内不同细胞亚群的端粒长度，包括纯端粒序列和部分可变区序列。FlowFISH方法仅限于使用新鲜的血液样本。自动化的多色FlowFISH是当前最快速和最敏感地测量人血各类白细胞平均端粒长度的方法。利用FlowFISH测量弱于细胞免疫表型的荧光信号，需要对方法进行必要的校准和控制，这一过程相对费时。

1．1．4Q-PCR［2］

Q-PCR方法费时短，成本低，具有快速和高通量的特点，可检测细胞群平均端粒长度，包括纯端粒序列和部分可变区序列。Q-PCR的检测原理是对用端粒(T)引物扩增的端粒产物的荧光信号与用单拷贝基因(S)引物扩增的单拷贝基因产物进行比较，用含等量样本的两个反应管同时扩增T和S，检测产物荧光信号，利用特定分析软件可获得相对端粒长度。Aviv1等［3］采用TRF和Q-PCR方法测量的白细胞端粒长度，TRF检测的端粒平均长度为Y，Q-PCR检测同一样本端粒的平均长度为X，对二者结果进行比较分析，建立的回归方程为Y=2．16X+4．02，二者间相关显著(相关系数为0．847)。TRF方法的批间误差约为2%，Q-PCR为6%。Q-PCR方法的缺点是样本内和样本间的变异性相对较高。1．1．5STELA［2］STELA方法的检测原理是通过单分子PCR检测特定染色体的端粒长度，包括纯端粒序列和可变区序列，由于引物位点是已知的，亚端粒区长度可被扣除。STELA能够对有限的样本量进行高度精确的单个端粒长度测量，适用于少见细胞亚群和非分裂的衰老细胞的端粒缩短分析和融合作用分析。但是由于STELA方法的技术难度大、劳动强度高以及低通量，使其不能大规模临床应用。

1．2小结

图1给出了各种方法的检测区域［2］。表1汇总了各种方法的主要特点［4］。

2端粒检测在辐射损伤研究中的应用

2．1实验研究

端粒长度影响细胞的辐射敏感性。人喉鳞癌细胞株、人乳腺癌细胞株、辐射抗性细胞株等不同癌细胞株的端粒长度与其辐射敏感性呈负相关［5］。Berardinelli等［6］采用X射线4Gy量照射TK6淋巴母细胞，检测结果表明，受照TK6淋巴母细胞初始克隆的端粒长度显著大于未受照射细胞;15个独立的TK6克隆中，4个克隆有长端粒，4个克隆有短端粒，短端粒克隆细胞更具辐射敏感性。Drissi等［7］对正常人成纤维细胞端粒的研究结果显示，短端粒细胞具有更高的辐射敏感性，并且传代延迟。端粒变异包括染色体断裂、端粒嵌入、端粒俘获及染色体重排等。Slijepcevic等［8］采用γ射线1．0Gy照射仓鼠细胞株CHE和CHOK1、小鼠细胞株SCIDST和CB17，结果表明，CHE、CHOK1、SCIDST和CB17细胞株间隙端粒位点断裂分别为8．6%、11．8%、1．7%和0%;端粒俘获分别为2．3%、0．5%、4．7%和0%;染色单体断裂处端粒嵌入分别为7．3%、8．7%、10．6%和10．6%。哺乳动物细胞中DNA双链断裂(DSB)修复的主要途径是典型的非同源末端融合。Muraki等［9］研究端粒损失机制及其对染色体不稳定性的后果，结果发现，端粒附近不能进行非同源末端融合，造成该位点DSB修复缺陷，使得端粒附近DSB更易于形成染色体重排。由于人类端粒是高度非均一性的，端粒损失诱发可遗传的染色体重排通常涉及遗传疾病。这是电离辐射诱导正常细胞衰老的重要机制之一［10］。端粒酶活化是保持端粒长度的主要途径。邹跃等［11］研究发现，X射线(1～5Gy，1．48Gy/min)能诱导人A549细胞株端粒酶活性表达;端粒长度分别与照射剂量和照射后时间依赖性增强和延长;照射剂量越高，端粒延长出现越早。郭月凤等［12，13］研究表明，60Coγ射线(0．2～6．0Gy，0．96Gy/min)和12C6+离子(0．1～2．0Gy，0．3～0．5Gy/min，165MeV)均可导致培养人淋巴细胞端粒增加;56Fe17+离子照射(0．1～1．0Gy，0．1～0．4Gy/min，165MeV)可诱发人淋巴细胞平均端粒长度在照后12h随吸收剂量增加而减小，在照后24～72h恢复至正常或接近正常水平。低LET辐射(γ射线、X射线)、12C6+离子辐射诱发培养人淋巴细胞平均端粒长度增加，与文献［8］结果一致，其机制可能是诱发了染色单体断裂并在修复过程中发生了端粒俘获和嵌入。56Fe17+离子辐射诱发培养人淋巴细胞平均端粒长度缩短，其机制可能是诱发了涉及端粒位点及附近DNA双链断裂的染色体断裂及端粒DNA断片丢失。结果可见，对于某一种细胞，在一定的剂量范围内辐射诱发的端粒长度变化主要取决于射线种类和性质。

2．2流行病学调查和临床研究

Lin等［14］调研结果表明，人外周血淋巴细胞中，B细胞的端粒酶活性最高且端粒最长，衰老的CD8+CD28－T细胞的端粒酶活性最低、端粒最短，CD8+CD28－T细胞比例升高与淋巴细胞的平均端粒长度缩短显著相关。说明端粒酶活性是维持淋巴细胞端粒长度的必要条件。Das等［15，16］研究高水平天然辐射地区印度西南部喀拉拉海岸新生儿和健康成人的端粒长度。将新生儿和成年人分别按年吸收剂量分为＜1．50mGy/年(正常水平天然辐射组)和1．51～3．00mGy/年、3．01～5．00mGy/年、＞5．00mGy/年。结果表明，新生儿4个吸收剂量组的平均相对端粒长度分别为1．10±0．03、0．98±0．01、1．05±0．02和1．07±0．03;成年人4个吸收剂量组的平均相对端粒长度分别为1．22±0．15、1．12±0．15、1．08±0．08、1．12±0．11。高水平天然辐射地区新生儿/成年人各组平均相对端粒长度和正常水平天然辐射地区无显著差异。说明高本底地区天然辐射对新生儿和成年人端粒长度无显著影响。职业照射引起端粒长度变化可能受到射线种类和性质的影响。Ilyenko等［17］用FlowFISH和Annexin-V试验法分别检测了83名切尔诺贝利核事故净化工人、在掩蔽物体内工作的建筑工人和健康对照人员的外周血淋巴细胞端粒长度和凋亡率。结果发现，与健康对照人员相比，切尔诺贝利净化工人相对端粒长度显著减少，而在掩蔽物体内从事建筑工作的暴露量在职业限值以下的放射性工作人员则有降低的趋势。在剂量大于职业限值时，凋亡早期的淋巴细胞数目和端粒长度呈负相关。研究结果显示，受到低剂量辐射端粒缩短，且这一变化可能保持超过20年。来自拉脱维亚的切尔诺贝利核事故净化工人中与年龄相关的退行性疾病和癌症发病率升高，且心血管疾病的死亡率升高。Reste等［18］采用Q-PCR方法测量了595例净化工人及236例健康对照人员外周血淋巴细胞相对端粒长度，研究迁延辐照对切尔诺贝利净化工人淋巴细胞端粒长度的远期效应。结果显示，切尔诺贝利净化工人的相对端粒长度比对照人员显著增加;从事挖掘、灭活等“较脏”工作的工人以及患有癌症的工人，其端粒长度显著大于对照人员。而那些患有白内障、动脉硬化、骨质疏松和冠心病的工人则显示端粒缩短。这两项研究，不同的工人在净化工作中受到辐射的类型、剂量是不同的，可能是导致净化工作中的职业照射所致淋巴细胞端粒长度变异的不同，同时也可能受到原有疾病种类的影响。Sabatino等［19］研究发现缩短的淋巴细胞端粒可以预测心血管疾病和死亡率，并且端粒在电离辐射诱发的染色体和染色单体畸变中有重要作用。结果提示，职业电离辐射导致的端粒消蚀可能引起血管老化进而导致心血管疾病。M＇kacher等［20］研究证明，放疗后端粒显著缩短的患者后来发展成了心血管疾病。提示外周血淋巴细胞端粒缩短与心血管相关的发病率和死亡率有关联。端粒长度可作为一个帮助确定患者放疗后发生冠心病高风险的独立预后因素，对于放疗与诱发的冠心病的早期检测和预防具有重要意义。

3本实验室对Q-PCR方法的改进及应用

通过比较和分析TRF、Q-FISH、FlowFISH、Q-PCR、STELA检测方法，结果认为，Q-PCR方法操作简单、快速、灵敏、高通量、高度可重复性、样本DNA可保存且需求量少，但是，只能获得相对端粒长度，并且样本内和样本间的变异性相对较高，无法对不同时间和不同实验室的端粒长度检测结果进行比较。本实验室将端粒标准DNA的使用与Q-PCR技术结合起来，建立了可用于细胞群绝对端粒长度测量的绝对Q-PCR方法，并用于γ射线辐射对人淋巴细胞端粒长度影响研究［11］。与Q-PCR方法相比，本实验室建立的绝对Q-PCR方法优点如下:①建立了端粒标准DNA的标准曲线，达到了对该方法的校准和控制;②可在不使用TRF方法对Q-PCR的测量结果进行校正的情况下，获得绝对端粒长度的检测结果;③该方法使得不同时间和不同实验室间的检测结果进行比较成为可能。但是，本实验室建立的绝对Q-PCR方法的可操作性、精确度和重复性都有待于在今后的研究中得到进一步验证。

参考文献：

［5］曹振，周云峰，骆志国，等．不同癌细胞株放射敏感性与端粒长度的关系［J］．武汉大学学报(医学版)，2005，26(4):470．

［11］邹跃，周湘艳，杜雏霞，等．电离辐射诱导端粒延长作用的研究［J］．中华放射医学与防护杂志，2005，25(6):254．

［12］郭月凤，张睿凤，张慧芳．γ射线辐射对人淋巴细胞端粒长度影响研究［J］．中国职业医学，2015，42(4):421．

［13］张睿凤，郭月凤，党旭红，等．12C离子辐射对人淋巴细胞端粒长度的影响［J］．辐射防护通讯，2014，34(4):29．

作者:郭月凤 张睿凤 单位:中国辐射防护研究院