黄曲霉毒素检测中电化学传感器的应用范文

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摘要:黄曲霉毒素具有高毒性和致癌性，极易污染各种食品和农产品，因此建立快速有效的分析方法对于其监测和检测具有重要意义。电化学生物传感器以其操作简便、成本低廉、灵敏度高、特异性强、无需对样品进行复杂处理等优势，在黄曲霉毒素检测中得到了广泛应用。文章综述了免疫传感器、核酸适体传感器、酶传感器在黄曲霉毒素中的应用及研究进展，并对电化学生物传感器在黄曲霉毒素中的应用前景进行展望，为进一步发展简便、快速、灵敏的新型电化学传感器提供参考。

关键词:电化学生物传感器，黄曲霉毒素，免疫传感器，核酸适体传感器，酶传感器

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，目前已分离鉴定出18种，主要为AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2［1－3］。黄曲霉毒素具有高毒性和强致癌性，其毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍;致癌力为已知致癌物二甲基亚硝胺的70倍、奶油黄(甲基偶氮苯)的900倍［4－6］。在湿热条件下，黄曲霉毒素极易污染玉米、花生、大豆、小麦、坚果等农产品和制品，极少剂量就可使人和动物受到严重的危害，例如畜禽食用含有黄曲霉毒素的饲料后会使其生长缓慢，采食量降低，发病率上升［7－8］。人误食含有黄曲霉毒素的食品后也会对身体造成很大的危害，如运动失调、排泄停止、肝炎、黄疸等，严重时可导致肝癌、骨癌、肾癌、乳腺癌甚至死亡［9－10］。鉴于黄曲霉毒素的危害巨大，世界各国对食品和饲料中的黄曲霉毒素含量都制定了限量标准，欧盟委员会规定人直接食用的食品或者用作食品配料的制品(不包括开心果、杏仁、榛子、巴旦木和巴西坚果)AFB1含量≤2μg/kg，AF总量(B1+B2+G2+G2)≤4μg/kg［11］。美国联邦政府有关法律规定，饲料中的AF≤15μg/kg，牛奶中AFM1≤0.5μg/kg［12］。我国现行业标准中对食物中AFB1的含量也进行了严格规定，乳及乳制品中AFM1≤0.5μg/kg，婴幼儿食品及乳粉中的AF不得检出，玉米、花生、花生油中AFB1≤20μg/kg，大米、其他食用油为AFB1≤10μg/kg，豆类、发酵食品为AFB1≤5μg/kg［13］。这些极其严格的限量要求，使得黄曲霉毒素的检测成为食品和饲料中的研究热点。目前国内外报道的测定黄曲霉毒素的方法主要有:薄层色谱法(TLC)［14］、高效液相色谱(HPLC)［15－16］、酶联免疫法(ELISA)等［17］。虽然这些方法灵敏度高、重现性好，但是样品处理复杂，检测仪器昂贵，检测成本较高，且需专业人员操作，不适合对黄曲霉毒素进行快速有效的检测分析。然而，电化学生物传感器不仅能满足以上要求，还具有成本低廉、应用范围广、自动化程度高等独特的优势，在临床检验、药品分析、环境监测、生命科学和食品安全等方面得到了广泛的应用，已成为分析界中最活跃的领域之一［18－20］。近年来，在黄曲霉毒素传感器的构建领域，国内外学者进行了多方面的研究，分别构建了以抗体、酶和核酸适体作为识别元件的电化学生物传感器，并将酶催化技术、滚环扩增技术、DNA自组装放大技术、离子液体、纳米材料、导电聚合物、过渡金属化合物等应用于黄曲霉毒素的检测中［21－27］，极大地提高了传感器的灵敏度、特异性、重现性和再生性。本文主要综述了近年来电化学酶传感器、电化学免疫传感器、电化学适体传感器在测定食品中黄曲霉毒素的研究进展，介绍了各类电化学生物传感器的原理、检测范围及检出限，并对当前的研究状况进行探讨和展望，以期为黄曲霉毒素的检测提供新的电化学生物传感分析方法，为霉菌毒素的食品现场快速检测方法的研究提供新思路。

1电化学免疫传感器在黄曲霉毒素检测中的应用

电化学免疫传感器主要是通过抗原抗体的特异性识别能力，实现定性和定量的分析检测，其按照在免疫分析过程中是否使用标记物可分为:非标记型的免疫传感器和标记型免疫传感器;电化学免疫传感器按照测量信号的种类则可分为:电势型、电导型、阻抗型和电流型四种，其中电流型免疫传感器是目前研究最为成熟、应用最广泛的一种［28］。表1列出了近十年的用于黄曲霉毒素检测的电化学免疫传感器的应用。

1.1电流型免疫传感器电流型免疫传感器是一种标记性的免疫分析，常用的标记酶有碱性磷酸酯酶(alkalinephosphatase，ALP)［29－31］、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)［32－33］，检测方法有夹心法和竞争法两种。竞争法可以分为直接竞争法和间接竞争法，直接竞争法主要是电极表面的抗原与待测的抗原竞争结合酶标抗体，导致电流信号发生改变的过程。Azri等［34］采用直接竞争法对棕榈仁饼干和饲料样品中AFB1进行测定，用多壁碳纳米管和离子液体修饰电极，通过共价键将牛血清蛋白(bovineserumalbumin，BSA)与AFB1复合物(BSA－AFB1)固定在电极上，该传感器的检测范围为(1×10－4～10)ng/mL，检出限为0.0001ng/mL。同样是以直接竞争法的原理对牛奶中的AFM1进行测定，Parker等［35］用HRP作标记，将AFM1抗体固定在丝网印刷电极上制备的传感器的检测范围为(3.9×10－4～1)ng/mL，检出限为3.9×10－4ng/mL。Tang等［36］也采用直接竞争法对AFB1进行检测，通过戊二醛将BSA－AFB1复合物固定在核－壳结构的磁性纳米颗粒上(CoFe2O4－SiO2)，在外加磁场的作用下BSA－AFB1聚集在铟锡氧化物的电极表面，该方法已成功应用于红甜椒样品中AFB1的检测中，检测范围为(0.05～12)ng/mL，检出限为0.006ng/mL，与经典的ELISA法相比，结果稳定，且简化了样品的前处理。由于制备酶标抗体比较复杂，所以一般采用间接竞争法来检测物质的含量。间接竞争法电极表面的抗原和待测抗原竞争结合了待测溶液中的抗体(一抗)后，然后加入标记的二抗结合溶液中的一抗，加入底物后测量电信号的变化的过程［37］。Tan等［38］在间接竞争原理的基础上，报道了一种银沉积信号放大传感器，用于检测大米中的AFB1，通过测定银离子的量，进而获得溶液中AFB1的量。在最佳条件下，该免疫传感器测定范围(0.1～10ng/mL)，检出限为0.0602ng/mL。Piermarini等［39］基于同样的原理，通过96孔丝网印刷微电极测定AFB1，对于玉米中AFB1的检测范围为0.05～2ng/mL，相比于单个的丝网印刷微电极，该方法提高了分析通量，减少了分析时间，降低了分析成本，具有很大的可行性。夹心法是用酶标记抗体，与固定在电极表面的抗体相结合的抗原形成夹心结构，从而催化氧化还原反应，导致电流的变化。Zhang等［40］采用双抗夹心法对AFB1进行检测，将BSA－AFB1固定在单层碳纳米管/壳聚糖薄膜修饰的玻碳电极上，在最佳条件下检测范围为0.01～100ng/mL，检出限为0.0035ng/mL。此传感器已经被应用于玉米粉中AFB1的检测，检出限低至0.0135ng/mL，远远低于国家的验收标准。王瑞鑫等［41］将AFB1抗体物理包埋在壳聚糖－金溶胶(CS－GNPs)复合材料中，以K3［Fe(CN)6］为探针进行检测，检测范围为0.1～1.1ng/mL，检出限为0.05ng/mL。虽然该传感器简便、快速，但是物理吸附的AFB1抗体会在分析过程中发生脱落，导致传感器的灵敏性和重现性降低。

1.2阻抗型免疫传感器阻抗型免疫传感器主要是通过检测抗原抗体反应后引起的电子转移阻抗的变化来检测分析物，相比于其它免疫传感器，阻抗型免疫传感器一般不需要酶标记抗原或抗体，也无需使用二抗放大信号，大大简化了传感器的制备。Ma等［42］通过一步法在金微电极表面电沉积壳聚糖－AuNPs复合纳米材料，将AFB1抗体共价固定在电极上后，结果显示，AFB1抗体的固定以及抗原与抗体的结合增大了电子转移电阻。该传感器的检测范围为0.1～30ng/mL，检出限为0.06ng/mL，此方法检测时间较短，且一步法电沉积不仅大大简化了传感器的制备也制造更多的可控性和可重复性。Costa等［43］将AFB1抗体固定在多壁碳纳米管修饰的金电极，基于抗原与抗体的特异性结合构建了一种免标记的传感器，其检测时间为15min，检测范围为0.0001～0.02ng/mL，检出限为0.79pg/mL。该传感器不仅操作简便，且灵敏度较高，为黄曲霉素的现场快速检测分析提供了可能。Yu等［44］用多壁碳纳米管/离子液体修饰玻碳电极，通过共价结合将AFB1的抗体固定在电极上，抗原抗体的结合阻碍了电子的转移。该传感器的检测范围在(0.1～10)ng/mL，检出限达0.03ng/mL，相比传统的TLC或HPLC法，此方法成本低廉，且离子液体的修饰为抗体固定提供良好的微环境，大大提高了传感器的稳定性和使用寿命。Owino等［45］通过直接吸附作用，将AFB1抗体固定在聚苯乙烯磺酸－聚苯胺修饰的铂电极上，阻抗分析显示抗体的固定阻碍了电子转移。该传感器的检出限为0.1ng/mL，且传感器的稳定性比较好，但由于通过吸附作用固定抗体，抗体固定量少，传感器特异性差，灵敏度低，难以满足实际测定要求。

1.3电势型、电导型免疫传感器电导型免疫传感器和电势型免疫传感器的最大区别在于测量方式的不同，电导型免疫传感器通过测定电极间电导的变化从而确定待测物的浓度;而电势型免疫传感器通过测定工作电极和参比电极之间电流为零时的电势变化与电化学反应中离子活性的关系来测量分析物［46］。由于电导型和电势型传感器选择性较低，在实际中未得到广泛的应用。Rameil等［47］在丝网印刷电极上电聚合聚吡咯，物理吸附多克隆抗体，构建了电势型免疫传感器，该传感器的检测范围为0.25～2ng/mL，检出限为0.04ng/mL。Liu等［48］在微梳状电极上自组装纳米金、AFB1抗体和辣根过氧化物酶后，由于抗原与抗体发生特异性结合，导致溶液的电导发生改变，电导变化和溶液中AFB1的量存在线性关系，从而可以测得AFB1的浓度。该免疫传感器检测范围为0.5～10ng/mL，检出限达0.1ng/mL。虽然纳米金的修饰，明显提高了传感器的灵敏度，但是，其在电极上的分布和尺寸难以控制，而且自组装金粒层的机械稳定性差，势必会影响传感器的可重复性。

2电化学核酸适体传感器在黄曲霉毒素检测中的应用

核酸适体是一段人工合成的能够与目标分子(离子、蛋白质、毒素、核酸或整个细胞等)进行高亲和性和高特异性结合的单链DNA或RNA［49］。与抗体相比，核酸适体具有体外制备简便、易于修饰、选择性高、稳定性好等优点［50］，已广泛应用于黄曲霉毒素的检测当中。表2为目前研究者所筛选出关于黄曲霉毒素的适配体，表3为文献报道的有关电化学适体传感器在黄曲霉毒素的应用。

2.1电流型核酸适体传感器电流型核酸适体传感器是在恒定电压下，由于适配体与待测物质发生特异性结合引起电信号的变化，从而实现对目标物检测的装置。Goud等［53］用功能化的氧化石墨烯修饰丝网印刷电极，将亚甲基蓝修饰的适配体固定在电极上，当待测液中不存在AFB1时，亚甲基蓝远离电极表面，产生弱的电化学信号，当待测液中存在AFB1时，其与适配体结合导致构象改变，亚甲基蓝靠近电极表面，引起电流值发生变化。该方法的检测范围为0.05～6.0ng/mL，检出限为0.05ng/mL。同样对于AFB1的检测，Yugender等［54］将适配体固定在氨基苯甲酸修饰的电极上，利用适配体对AFB1的特异识别进行检测，其检测范围为0.125～16ng/mL，检出限达0.12ng/mL，该方法操作简便、成本低廉，且适用性在啤酒和葡萄酒样品中已得到验证。Abnous等［55］基于适配体开发了一种π型电化学传感器，以Fe［(CN)6］3－/4－为指示剂，在没有AFB1的情况下，π形结构的大部分是完整的，并且Fe［(CN)6］3－/4－远离电极表面，产生微弱的电流信号，当待测物中有AFB1时，AFB1与适配体特异性结合，π形结构被破坏，释放出互补链。核酸外切酶消化互补链，导致Fe［(CN)6］3－/4－更多地进入电极表面，并产生强电流信号。该传感器的检测范围为0.007～5μg/mL，检出限达0.002μg/mL，π形结构的使用显著提高适体传感器的灵敏度。Zheng等［56］采用端粒酶和核酸外切酶Ⅲ(EXOⅢ)双重信号放大策略来提高检测的灵敏度，一重放大用端粒酶来延长固定在纳米金表面的DNA，使信号响应范围扩大，二重放大用EXOⅢ可以水解适体识别AFB1后形成的3'，使AFB1释放到检测系统中，参与下一个识别检测周期，进行信号放大。该传感器的检测范围为0.6×10－4～100ng/mL，检出限为0.6×10－4ng/mL。这种基于异源酶的双向信号放大电化学适体传感器为其它真菌毒素的超灵敏检测提供了理论参考。

2.2其它电化学核酸适体传感器Evtugyn等［57］针对适体的固定过程，用电聚合的中性红和环芳烃修饰玻碳电极，将AFB1的适配体共价固定在环芳香烃上，当溶液中存在目标物AFB1时，适配体与AFB1发生特异性的结合，由于表面位阻的原因，电荷转移的电阻值增加，中性红与电极表面之间电子交换能力减弱，进而导致电化学信号的变化，使用该方法可检测的最低浓度为0.0561ng/mL。基于同样的原理，Dinckaya等［58］将巯基修饰的AFB1的适配体固定到半胱胺和纳米金颗粒修饰的电极上，虽然该传感器的检测范围只有1～14ng/mL，但重现性好、灵敏度高。Castillo等［59］针对适体和目标物识别过程，将PAMAMG4树状大分子固定在半胱氨酸修饰的金电极上，通过戊二醛固化AFB1适配体，利用循环伏安法和电化学阻抗光谱法通过氧化还原反应指示剂Fe［(CN)6］3－/4－来采集电化学信号响应，该传感器已经被应用于花生样品的实际检测当中，检测范围为0.4～10nmol/L，检出限为0.4nmol/L。Karapetis等［60］采用同样的方法来检测牛奶中的AFM1，欧盟对牛奶中AFM1的限量标准为0.05ng/mL，而在最佳实验条件下，此方法的检出限可达0.015ng/mL。同样是对于牛奶中的AFM1的检测，Smolko等［61］将AFM1适配体固定在中性红和羧酸盐柱芳烃修饰的玻碳电极上，AFM1检测范围可达0.005～0.12ng/mL，检出限达0.0005ng/mL，该方法操作简单，灵敏度高，能够与ELISA法相媲美。

3电化学酶传感器在黄曲霉毒素检测中的应用

电化学酶传感器是利用电化学装置将酶反应所产生或者消耗的物质的量转化成电信号的一种检测装置，是目前应用较广、数量较多的一类生物传感器。根据产生的电信号方式，电化学酶传感器可以分为电位型和电流型，由于近几年来，电位型酶传感器在黄曲霉毒素检测方面报道较少，文章按其作用原理主要分为两类:一类是基于黄曲霉毒素对乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制作用;另一类是基于黄曲霉毒素氧化酶(AFO)对AFB1上双呋喃结构不饱和碳键的催化作用。Rejeb等［62］通过交联作用将胆碱氧化酶(cholineoxidase，Chox)固定到普鲁士蓝修饰的丝网印刷电极表面上，构建了一种基于AChE和胆碱氧化酶的双酶传感器，该传感器的检测范围为10～60ng/mL，样本经浓缩后，检出限达2ng/mL。刘晓伟等［63］将炭气凝胶与AChE混合后固定到硼掺杂金刚石电极表面，AFB1能抑制AChE的催化活性，使底物生成的胆碱减少，进而导致氧化电流的降低，用循环伏安法和差分脉冲伏安法检测溶液中的AFB1，检出限为0.89μg/mL。Li等［64］利用AFO对AFB1的催化作用，在多层碳纳米管上固定AFO，当AFB1存在时，AFO作用于AFB1分子双呋喃结构上的不饱和碳键生成O2和H2O2。该传感器的检出限为1.6nmol/L。Liu等［65］将AFO固定在多壁碳纳米管上，用来检测AFB1，当把黄曲霉毒素氧化还原酶和AFB1抗体通过多壁碳纳米管共固定化制作修饰电极，传感器的灵敏度提高了10倍。该传感器的灵敏性、稳定性和重现性都较好。

4结论与展望

近年来，随着科学技术的不断进步，电化学生物传感技术也得到了快速的发展，并在实际样品的检测中呈现出良好的检测效果。本文综述了免疫传感器、核酸适体传感器、酶传感器在黄曲霉毒素中的应用及研究进展，笔者认为，基于目前电化学生物传感器所存在的缺陷，未来的改进方向主要集中在以下几个方面:一:在黄曲霉毒素的检测中实际样品的预处理会影响传感器的灵敏度，但是对于固体样品的免疫亲和柱净化方法等经典的样品预处理方法操作复杂、耗时、重现性差，已成为分析检测的瓶颈之一。而使用表面修饰有抗体或核酸适体的磁亲和固相萃取吸附剂，可以从复杂样品中选择性的提取待测物质［66］，有望提高预处理样品精度，进而提高传感器的灵敏度。二:在电化学传感器中识别元件通常只能够识别一到两种毒素分子，而实际生产中需要对多种毒素进行同时检测。例如，使用96孔丝网印刷微板或8个丝网印刷组成的传感器阵列，在阵列的不同行或不同列固定不同分析物的抗体，实现毒素的高通量检测，从而节省分析时间、降低分析成本。三:实际检测中对痕量及超痕量目标分子检测的要求使得科研工作者致力于提高传感器灵敏度的研究。纳米材料比表面积大、生物相容性好、电催化性能好、稳定性高，可以大大提高传感器的灵敏度和寿命。例如，碳纳米管、石墨烯、金纳米颗粒等纳米材料对于信号放大发挥了尤为明显的作用。因此，扩大纳米材料的选用范围，并将纳米技术、酶催化技术、生物放大等技术联合应用，有望为电化学生物传感器开拓新的领域。四:在电化学免疫传感器中抗体的制备周期长、价格高、易失活，且抗原与抗体容易出现交叉反应。使用分子印迹技术制备的与毒素特异性结合的分子印迹聚合物(molecularimprintedpolymer，MIP)不仅特异性好、成本低廉、耐高温、耐酸碱，还可重复使用。若在电化学的基础上联合使用分子印迹技术不但可以降低分析成本，而且能大大提高传感器的特异性。随着现代技术的不断发展，科学家将开发越来越多的电化学生物传感器，黄曲霉毒素电化学传感器的灵敏性、稳定性、特异性、重现性也将得到提高，价格低廉、微型化、自动化、便于携带、便于检测的新型电化学生物传感器将广泛应用于食品中真菌毒素的检测。

作者：惠媛媛 王毕妮 彭海霞 单位：陕西师范大学食品工程与营养科学学院