海洋酸化对脊尾白虾抗氧化酶活性研究范文

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摘要：采用高纯度CO2和空气的混合气体调配试验所需酸化海水，研究不同海水酸化条件胁迫对脊尾白虾超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活性和丙二醛（MDA）浓度的影响．结果表明，1000μL／LCO2酸化组SOD，CAT和GSH－Px活性表现为先上升后下降的趋势，其中SOD和CAT活性分别在7d和14d时受到显著诱导（P＜0．05），而GSH－Px活性在7d和14d时显著高于对照组（P＜0．05）；1900μL／L酸化组SOD，CAT和GSH－Px活性在暴露过程中受到不同程度的抑制，其中SOD活性在14d和28d时均显著低于对照组（P＜0．05），CAT和GSH－Px活性均在14d时受到显著抑制（P＜0．05）；1000μL／L和1900μL／LCO2酸化组的MDA浓度均呈现先增加后回落的趋势，1000μL／L组在14d时MDA浓度显著增加（P＜0．05），而1900μL／L组则在7d和14d时MDA浓度均显著高于对照组（P＜0．05）且在14d时达到最大值．由此可见，海洋酸化对脊尾白虾的抗氧化酶活性具有明显的刺激作用，且在轻度酸化胁迫时抗氧化酶活性受到诱导，而在较高强度的酸化胁迫时其活性被抑制．

关键词：海洋酸化；脊尾白虾；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；谷胱甘肽过氧化物酶；丙二醛

引言

自工业革命以来，化石燃料燃烧等人类活动导致大气中CO2从工业革命前的280μL／L增长至2013年的394μL／L，增长了约40％［1］．据IPCC（联合国政府间气候变化专门委员会）预测，2100年大气中CO2将会达到1000μL／L，表层海水pH将继续下降0．3～0．4；至2300年时有可能达到1900μL／L，pH可能将再下降0．7～0．8［2－3］．多年来，人们认为海洋酸化的进程是缓慢而不易察觉的，但调查结果大大超乎人们的预料．据调查，在海洋酸化的影响下，意大利那不勒斯附近海域的有孔虫种类急剧减少，由24种减少到6种［4］．美国Tatoosh岛附近海域海水pH实际上升的平均速度也比预测的速度快10倍以上［5］．由此可见，海洋酸化正以人们无法估计的速度加剧影响着海洋化学变化，对海洋生物的生存及海洋生态系统的平衡构成严重的威胁．目前，对海洋酸化的研究主要集中在海洋酸化对无脊椎动物（腔肠动物、软体动物、棘皮动物、节肢动物）及鱼类的生长率、成活率、钙化率、感官能力、繁殖能力等的影响方面［6－7］，特别是关于海洋酸化对海洋生物的受精、胚胎早期发育及幼体存活率影响开展了较多的研究．研究表明，海洋酸化会导致许多无脊椎动物的早期胚胎和幼体发育迟缓，甚至产生致畸、致死效应．刘文广等［8］的研究结果表明海洋酸化对马氏珠母贝的受精率无显著影响，但会导致其幼虫发育受阻，存活率降低．在甲壳动物中也存在类似的现象，如海洋酸化处理帝王蟹（Paralithodescamtschaticus）胚胎，结果发现有4％的眼变大和5％的卵黄变小，而且平均孵化周期延长33％；酸化处理幼体时，其存活率下降［9］．但不同物种间甚至同一物种的不同发育阶段对海洋酸化的响应也存在差异．如在同样的较高CO2浓度条件下，梅氏长海胆（Echinometramathaei）和马粪海胆（Hemicentrotuspulcherrimus）的受精率有所不同［10］．由此可见，生长环境的差异和不同海洋生物自身机能、生活习性及发育特点等方面的不同使不同海洋生物产生了不同的酸碱调节能力，其机制也存在很大的差异．脊尾白虾（Exopalaemoncarinicauda）是我国沿海重要的经济虾类之一，具有环境适应性广、繁殖周期短、生长速度快等优点，而且能在室内通过控温促使其繁育而不受季节的影响，可以在较短的时间内获得不同发育时期的试验材料．因此，脊尾白虾是一种理想的测试生物体，可用于监测和评价海洋水体环境和质量变化．本文研究脊尾白虾在海水酸化暴露胁迫下，体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）等酶活性的变化及其体内丙二醛（MDA）浓度的变化，评价SOD，CAT，GSH－Px和MDA作为海水酸化暴露的生物标志物的适用性，为预测未来海洋酸化对海洋生物和生态系统的影响提供依据．

1材料与方法

1．1试验材料脊尾白虾取自连云港忠玉水产养殖场，虾体长（4．97±0．14）cm，体质量（2．75±0．12）g．试验前选择健康的脊尾白虾放入室内水族箱中驯养7d以上，驯养期间，每日换水一次，并在自然死亡率低于2％的情况下选择身体健康、大小基本一致的脊尾白虾供试验用．

1．2海水酸化暴露试验CO2体积分数分别设定为400μL／L（对照组）、1000μL／L和1900μL／L，对应的pH分别为8．1，7．7和7．4．采用“一种获取不同二氧化碳浓度的装置”（ZL201720578617．0）将空气与纯CO2气体混合得到相应CO2体积分数的混合气体，通入到30L养殖容器的过滤（0．45μm微孔滤膜过滤）海水中，待海水酸化稳定后用于试验．将驯养后的180尾脊尾白虾随机分到9个养殖容器中，每个养殖容器内放置20尾，每个CO2体积分数组设置3个重复．在酸化海水暴露期间的1，3，7，14和28d时分别取3尾虾，解剖后取肝胰腺置于离心管中，做好标记并在－20℃冰箱中冷冻保存．

1．3组织匀浆制备及酶活性测定将各个时期取样的肝胰腺在冰浴中与质量分数0．86％的生理盐水（配方）用玻璃匀浆器制成质量分数10％的匀浆，4℃10000r／min离心15min，取上清液用于总蛋白、SOD活性、CAT活性、GSH－Px活性及MDA浓度测定．1．3．1总蛋白的测定采用南京建成生物工程研究所提供的考马斯亮蓝法总蛋白（TP）测试盒的操作步骤测定组织蛋白含量，用于计算SOD，CAT和GSH－Px酶活性及MDA浓度．1．3．2SOD，CAT和GSH－Px活性的测定按南京建成生物工程研究所提供的SOD测试盒（WST－1法）、CAT测试盒（可见光法）和GSH－Px测试盒（比色法）的操作步骤测定该3种酶的活性．1．3．3MDA浓度的测定按南京建成生物工程研究所提供的MDA测试盒（TBA法）操作步骤测定组织中MDA浓度．

1．4数据处理酶活性用“平均数±标准偏差（means±SD）”表示．试验结果使用SPSS22．0统计软件进行数据分析，用方差分析（ANOVA）法分析试验组与对照组之间差异，并用Student－Newman－Keul’s检验法分析组间显著性，P＜0．05表示差异显著．

2结果与分析

2．1海水酸化对脊尾白虾SOD活性的影响由图1可见，随着暴露时间的延长，1000μL／L酸化组的脊尾白虾SOD活性表现出先上升后下降的趋势．暴露1d和7d时1000μL／L酸化组SOD活性与对照组之间的差异并不显著（P＞0．05）；暴露14d时酸化组SOD活性受到显著诱导（P＜0．05）且达到最大值；暴露28d时，其SOD活性高于对照组，但差异不显著（P＞0．05）．暴露于1900μL／L酸化组的脊尾白虾SOD活性在暴露过程中受到不同程度的抑制．1d和7d时1900μL／L组与对照组的SOD活性无显著差异（P＞0．05）；14d和28d时1900μL／L组SOD活性均显著低于对照组（P＜0．05），且在14d时达到最低值．

2．2海水酸化对脊尾白虾CAT活性的影响不同程度酸化暴露对脊尾白虾CAT活性的影响如图2所示．暴露于1000μL／LCO2的脊尾白虾CAT活性表现为先升后降的趋势，在1d时1000μL／L组与对照组的CAT活性无显著差异；在7d时CAT活性受到显著诱导（P＜0．05）且达到最大值；14d和28d时1000μL／L组CAT活性高于对照组，但差异不显著（P＞0．05）．暴露于1900μL／LCO2的脊尾白虾CAT活性随着暴露时间延长先抑制后逐渐回升．暴露1d和7d时酸化组CAT活性略低于对照组，但差异不显著（P＞0．05）；暴露14d时酸化组CAT活性受到显著抑制（P＜0．05）且达到最低值；暴露28d时酸化组CAT活性低于对照组，但无显著差异（P＞0．05）．

2．3海水酸化对脊尾白虾GSH－Px活性的影响由图3可以看出，随着暴露时间的延长，1000μL／L酸化组脊尾白虾GSH－Px活性呈现先增加后逐渐下降的趋势．暴露1d时酸化组GSH－Px活性与对照组无显著差异；7d和14d时酸化组GSH－Px活性显著高于对照组（P＜0．05），且在7d时达到最大值；暴露28d时酸化组GSH－Px活性虽然高于对照组，但差异不显著（P＞0．05）．暴露于1900μL／L酸化组的脊尾白虾GSH－Px活性与SOD及CAT活性类似，在暴露过程中受到不同程度的抑制．1d和7d时1900μL／L组与对照组的GSH－Px活性无显著差异；14d时1900μL／L酸化组GSH－Px活性受到显著的抑制（P＜0．05）且达到最低值；28d时1900μL／L组GSH－Px活性低于对照组，但差异不显著（P＞0．05）．

2．4海水酸化对脊尾白虾MDA浓度的影响在不同CO2体积分数酸化条件下，脊尾白虾MDA浓度变化如图4所示．暴露于1000μL／LCO2的脊尾白虾MDA浓度随着暴露时间的增加呈现先上升后下降的变化趋势．暴露1d和7d时MDA浓度与对照组无显著差异（P＞0．05）；暴露14d时MDA浓度显著增加（P＜0．05）且达到最大值；暴露28d时MDA浓度与对照组无显著差异（P＞0．05）．在1900μL／LCO2酸化条件下，脊尾白虾MDA浓度随着暴露时间的延长表现为先增加后回的趋势．1d时1900μL／L组的MDA浓度低于对照组但无显著差异（P＞0．05）；7d和14d时MDA浓度均显著高于对照组（P＜0．05）且在14d时达到最大值；28d时1900μL／L酸化组MDA浓度高于对照组，但差异不显著（P＞0．05）

3讨论

抗氧化酶系统在清除体内活性氧物质、使细胞免受氧化损伤过程中发挥着重要作用．当生物体受到外界不利因素胁迫时，其体内将产生过量的活性氧，打破机体内抗氧化防御性功能酶与活性氧自由基之间的平衡关系，过量的活性氧将攻击各种生物大分子，引发生物膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，对细胞和机体产生毒害作用［11］．SOD和CAT是生物体内两种重要的抗氧化酶，正常情况下，SOD，CAT和GSH－Px协同作用可以有效清除胁迫所产生的活性氧自由基，从而使机体细胞免受自由基损伤［12－14］．已有研究表明，生物体的SOD和CAT等抗氧化酶在不同pH的环境胁迫下，其酶活性可能会受到诱导或抑制两种现象．金头鲷（Sparusaurata）在用CO2模拟海水酸化的试验中，SOD活力随酸化梯度呈现出规律性变化［15］．樊甄姣等［16］研究发现，略低于正常值（pH8．0）的pH胁迫下，栉孔扇贝（Chlamysfarreri）血清中SOD和CAT活性明显升高，但低pH（7．0）时，SOD和CAT活性受到显著抑制．与此类似的情况在背角无齿蚌（Anodontawoodiana）中也存在，低pH（6．0）或高pH（8．5）均会使背角无齿蚌血清中SOD和CAT活性有不同程度的降低［17］；马广智等［18］研究发现草鱼（Cteno－pharyngodonidellus）在低pH环境胁迫下SOD活性被抑制．克林雷氏鲶（Rhamdiaquelen）在pH5．0的环境下胁迫其肝、鳃和肌肉中的CAT活力也显著低于pH7．0对照组［19］．本研究发现，1000μL／LCO2酸化组，脊尾白虾的SOD，CAT及GSH－Px酶活性先上升后下降，3种酶活性在1d时酸化组与对照组均无显著差异，在7d时CAT和GSH－Px两种酶活性受到显著诱导且达到最大值，SOD酶活性则在14d时显著高于对照组．与此类似的是菲律宾帘蛤（Ruditapesphilippinarum）在海水CO2酸化条件下，pH7．6组的SOD活性显著高于pH7．9对照组［20］．这是由于CO2溶解于海水后引起水体环境pH的下降，破坏了脊尾白虾体内体液的酸碱平衡，而机体酸碱平衡失调伴随氧化应激反应，同时激活抗氧化防御机制，从而影响抗氧化酶的活性［21］．本研究中，暴露于1900μL／LCO2酸化组的脊尾白虾，其SOD，CAT及GSH－Px酶活性则受到不同程度的抑制；该3种酶活性在1d和7d时酸化组与对照组均无显著差异，而在14d时这3种酶活性均受到显著抑制且达到最低值．这可能是随着CO2体积分数的升高，环境pH进一步降低，使机体H＋浓度增加，而多余的H＋促机体生成更多的活性氧自由基，破坏机体活性氧平衡，引起SOD等酶活性降低［21］．此外，本研究结果与李信书等［22］发现随着Cd和Cu浓度增加亚心形扁藻（Platynonassubcordi－formis）的SOD酶活性也随之增加，但浓度过高时反而下降的研究结论基本一致；与此类似的是，日本囊对虾（Marsupenaeusjaponicus）在pH7．2水体胁迫下其SOD的活性随胁迫时间延长而逐渐降低［23］．这可能是生物机体的SOD，CAT及GSH－Px等抗氧化酶活性在受到严重胁迫时被抑制，而在轻度胁迫时往往受到诱导而升高［24］．樊甄姣等［16］的研究结果也表明，pH在一定范围内随刺激强度的增加对栉孔扇贝呈现免疫活性的正调节；但在高强度pH刺激下，免疫活性呈现出负调节，这种调节可能与高强度刺激引起的免疫机能疲劳或损伤有关．但Flexopectenglaber扇贝暴露于pH7．4的海水酸化环境中，其消化腺和鳃组织的CAT活性均高于对照组［25］，厚壳贻贝（Mytiluscoruscus）暴露于低pH（7．3）的海水酸化中时，其鳃组织的SOD，CAT和GSH－Px活性均受到显著诱导［26］．上述研究结果表明，海水酸化对机体抗氧化酶的反应是比较复杂的，具体的机理还需更加深入研究．MDA作为脂质过氧化的终产物之一，正常生理状态下，体内的MDA浓度是极低的，其浓度可间接反映机体的活性氧自由基和脂质的过氧化水平，从而间接反映出细胞受损伤的程度，因此MDA被广泛地作为指示生物体内脂质过氧化程度的检测指标［27－28］．研究表明，在有机磷农药的暴露下，沼水蛙蝌蚪的MDA浓度会随着暴露浓度的增加而上升［29］；磺胺类药物暴露也会使罗非鱼（Oreochromisniloticus）肝脏组织的MDA显著提高［30］．陶易凡等［31］研究发现pH胁迫克氏原螯虾（Procambarusclarkii）时其MDA浓度在肝胰腺中的积累量会显著增加．本研究结果显示，暴露于体积分数1000μL／LCO2的脊尾白虾MDA浓度先升后降且暴露14d时MDA浓度显著增加；1900μL／LCO2时MDA浓度先增加后减少，7d和14d时MDA浓度均显著高于对照组且在14d达到最大值；28d时其MDA浓度也略高于对照组．这可能是由于pH的胁迫会诱导机体内产生的大量活性氧自由基通过与生物膜发生脂质过氧化反应，从而产生大量的MDA［17］，而且随着pH的进一步降低，抗氧化酶SOD，CAT和GSH－Px活性明显降低，使胁迫过程中产生的活性氧堆积而导致MDA浓度不断增加，导致机体免疫功能的进一步下降或受损。

作者：李晨辉 王梦杰 彭艳青 高焕 王怀忠 王海华 陈建华 单位：淮海工学院