茶树CsANS基因的生物信息学分析范文

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《茶叶科学杂志》2016年第二期

摘要：

采用RACE技术，获得茶树武夷奇种C18叶片花青素合成途径中的花青素合成酶（ANS）基因的cDNA全长序列。采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同遮光处理下的表达动态。结果表明，csans全长cDNA为1000bp，其中ORF（OpenReadingFrame）为957bp，编码320个氨基酸，含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能结构域；分离得到CsANS基因上游调控序列1010bp，其含启动子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1（光响应元件）、circadian（生物钟相关元件）等与花青素合成途径相关的重要顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明，该基因在全光照处理（CK）时表达量较高，75%遮光时表达量较低。说明该基因的表达受光照强弱的控制。

关键词：

茶树；CsANS基因；启动子；生物信息学分析

茶树武夷奇种C18，无性系。灌木型，中叶类，中生种。是福建省武夷山市茶叶研究所从武夷群体种中选育的优良品系。芽叶紫红色，茸毛较密，节稍长。且芽叶生育力强，发芽较密，持嫩性较强，是一种稀有的特色茶树资源。武夷奇种C18芽叶呈现红紫色，花青素含量较高[1-2]。研究表明，花青素是茶树叶片呈现“红紫色”的主要原因[3]。植物花青素的生物合成途径已有较为深入的研究，其中花青素合成酶（Anthocyaninsynthase，ANS）是将无色花青素经氧化脱水形成红紫色花青素的关键酶[1]。环境信号激活花青素合成途径中相关基因的表达[4]。在花青素合成的前期，光能调控相关基因的表达，弱光可以抑制或下调基因的表达，从而减少花青素的合成；而强光可以诱导花青素合成相关基因的表达，使花青素的含量增加[5]。光信号调控转录因子与启动子结合的强弱，并影响结构基因的表达，其表达量也会随之发生相应的变化[1]。目前在茶树上，ANS基因的启动子还未克隆。本研究根据已有的茶树ANS基因的EST（Expressedsequencetags）序列，采用同源克隆和GenomeWalking方法，克隆了紫叶茶树的ANS基因及分离5′调控序列，再利用生物信息学法，预测了启动子的顺式作用元件，采用荧光定量PCR技术，分析ANS在不同光照条件下的表达模式，有助于揭示ANS在紫色茶树叶片对环境信号响应过程中的作用，解析光强对武夷奇种C18ANS基因的调控机理，为紫芽茶树特异种质的创制和利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与处理1.1.1植物材料试验材料为武夷奇种C18，由福建省武夷山市茶叶研究所资源圃提供。选取武夷奇种C18的成熟叶片，迅速用液氮处理，置－80℃冰箱保存,用于基因组DNA的提取，克隆CsANS启动子序列。

1.1.2遮光处理试验在福建省武夷山市茶叶研究所资源圃中完成。2015年4月中旬，挑选生长发育良好、整齐一致、树形基本相似的植株27株，分为3组（每9株为1组，每重复3株），挂牌标记，并对其进行同一高度的修剪。待茶树芽头萌动之时，开始遮光处理。设2个处理：分别用75%和60%的黑色遮荫网遮光，以全光照处理为对照。经过15d的遮光处理，取经遮光处理和全光照处理（CK）的武夷奇种C18叶片（第一叶位），经锡箔纸分装于－80℃保存，用于荧光定量PCR检测。

1.1.3试剂FHPlantDNAKit(北京德曼特尔生物科技有限公司)；PrimerStar(TaKaRa公司)；AgaroSeGelDNAExtractionKit(TaKaRa公司)；SMARTerRACE5′/3′Kit(TaKaRa公司)；染色体步移试剂盒(TaKaRa公司)；pEASY-BluntZeroCloningKit(福州都拜特生物技术有限公司)；引物合成及样品测序由铂尚生物技术（上海）有限公司完成。

1.2方法

1.2.1茶树叶片总RNA及基因组DNA的提取本试验参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取茶树总RNA；采用FHPlantDNAKit(北京德曼特尔生物科技有限公司)试剂盒提取紫叶茶树基因组DNA。

1.2.2茶树CsANS5′RACE、3′RACE及全长ORF的PCR扩增cDNA第一链的合成按RevertAidTMFirst-StrandcDNASynthesisKi试剂盒说明书进行。根据已报道的拟南芥、葡萄、茶树等ANS基因序列，用DNAMAN设计同源克隆引物。上游引物：5′-CAACAATGATGACTACAGTGGCTG-3′，下游引物：5′-GCGCCTTTAGAGCCAAGTTCTTG-3′。PCR扩增体系：12.5µLEx-Taqmix，2µLcDNA模板，0.5µLANS-R，0.5µLANS-F，补ddH2O至25µL体系。94℃预变性4min，94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸3min，35个循环，最后72℃延伸10min进行PCR扩增。在其ORF两端设计特异引物qANS-R：5′-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3′；qANS-F：5′-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3′扩增全长序列。

1.2.3CsANS基因启动子的克隆根据TaKaRaGenomeWalkingKit引物设计原则，在已知的茶树ANS基因（GenBank收录号为AY830416.1）的已知序列区（最好不少于500bp）分别设计3条反向且退火温度较高的特异性引物SP1、SP2和SP3，再与试剂盒中提供的4种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4进行热不对称PCR反应[6]，经过3次巢式PCR反应获得已知序列的侧翼序列。用于扩增ANS基因启动子序列的特异性引物情况详见表1。以提取的武夷奇种C18茶树叶片DNA为模板，按照TaKaRaGenomeWalkingKit说明和林玉玲等[7]的方法进行ANS基因启动子的克隆。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带克隆至pMD18-T载体，37℃连接过夜后进行转化测序（铂尚生物技术有限公司）。

1.2.4荧光定量PCR表达分析分别提取遮光75%、60%和全光照处理（CK）的武夷奇种C18第一叶位总RNA，用逆转录试剂盒（TaKaRa）反转录成cDNA，稀释10倍作模板。以18S-rRNA基因为内参（18SⅠ：5′-CCTGAGAAACGGCTACCACA-3′，18SⅡ：5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′）。运用DNAMAN软件，按照荧光定量PCR引物设计原则，设计荧光定量PCR引物（ANS-R：5′-GTTGCTGTAATAGGCGATGGTG-3′，ANS-F：5′-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3′）。参照SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKit（TaKaRa）说明书，进行荧光定量PCR扩增体系：cDNA模板1µL，2×SYBRPremixEx-TaqTM5µL，上下游引物（10µmol•L-1）各0.2µL，用RNase-freeH2O补足至10µL。95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃复性34s，共40个循环。每份样品设3次重复。试验数据应用MicrosoftExcel2007软件，采用2-ΔΔCt法计算其相对表达量[8]；应用SPSS软件对结果进行差异显著性分析。应用MicrosoftExcel2007软件作柱状图。

1.2.5生物信息学分析CsANS序列通过在线NCBI的Blast功能进行氨基酸序列同源性比较；通过Protparam软件对基因的分子量、等电点进行预测，初步分析目的基因的功能；通过TMHMM和TMPred软件进行蛋白质跨膜结构的预测；SignalP4.1进行信号肽预测；在线SOPMA预测蛋白质二级结构。ProtCompVersion9.0进行亚细胞定位预测。启动子序列通过在线PlantCAR[9]及Place软件[10]预测其顺式作用元件的种类、分布情况和生物学功能[11]。通过在线软件BDGP[12]预测转录起始位点及可能的核心启动子区域。

2结果与分析

2.1茶树CsANS基因cDNA全长克隆

2.1.1茶树CsANS基因PCR结果分析经PCR扩增回收测序及使用DNAman软件拼接获得CsANS基因全长序列1000bp（GenBank收录号为KT215319）。（图1）该序列包含1个完整的阅读框（15~977bp），编码320个氨基酸，该基因含有起始密码子ATG、终止密码子TAA，并含有保守功能结构域DIOX-N、20G-Fell-Oxy，属于DIOX-N和20G-Fell-Oxy超级家族。

2.1.2茶树CsANS基因的进化分析将武夷奇种C18茶树ANS基因的氨基酸序列与已知的茶树、高丛越橘（Vacciniumcorymbosum）、和甘薯（Ipomoeabatatas）等11种植物ANS基因的氨基酸序列进行同源进化树分析（图3）。发现所克隆的ANS蛋白与同属茶树ANS蛋白（登录号：AY830416.1）的一致性高达100%。与其他物种比较，发现茶树ANS蛋白在亲缘关系上与高丛越橘最近，同源性为78%。

2.1.3CsANS基因氨基酸生物信息学分析通过ProtParam软件对CsANS氨基酸进行基本信息分析可知，CsANS基因编码320个氨基酸；相对分子量36113.6kD；理论等电点pI为6.23；负电荷残基（Asp+Glu）为46个，正电荷残基（Arg+Lys）为43个；不稳定指数为41.05，属于不稳定蛋白；脂溶系数为：88.97，平均疏水性（GRAVY）为－0.397；分子式：C1626H2576N432O472S12，总原子数为5118，氨基酸组成中谷氨酸含量最高，占总氨基酸的10.3%；其次为甘氨酸，占6.9%，其他氨基酸占82.8%。利用在线软件TMHMMServerv.2.0工具预测CsANS蛋白的跨膜螺旋区，如图4显示，该蛋白不是膜蛋白，无跨膜螺旋区。使用TMpred预测也显示蛋白都分布在膜外，无跨膜蛋白。通过在线软件COILS对CsANS氨基酸预测，在CsANS蛋白的25个氨基酸左右预测到强超螺旋信号。经过SignalP-4.1预测信号肽显示，CsANS编码的氨基酸不含信号肽，不是分泌蛋白。对氨基酸的二级结构预测显示CsANS编码的氨基酸中α螺旋结构较多，有125个占所有氨基酸的39.06%，其次为无规则卷曲占31.87%，延伸链占17.81%，β折叠所占比例最低为11.25%。通过ProtCompVersion9.0软件进行亚细胞定位预测，其亚细胞定位在细胞质。

2.2CsANS基因启动子克隆

2.2.1CsANS基因启动子扩增结果以武夷奇种C18的DNA为模板，经3轮巢式PCR反应后，扩增到1条大于1000bp的目的片段（图5）。将该片段进行克隆、测序，结果显示，获得的片段实际长度为1236bp。序列经过分析整理后，以ATG为起始位点，得到茶树CsANS上游长度为1010bp的DNA序列。

2.2.2茶树CsANS启动子转录起始位点的预测经过启动子转录起始位点在线预测，茶树CsANS基因1010bp的5′端调控序列可能存在3处核心启动子区域，位于35~85、316~366、480~530bp，分值分别为0.96、1和0.88，可能的转录起始位点分别为G、C和T。此结果可推测位于316~366bp的序列很可能就是该基因真正的核心启动子区域，转录起始位点为位于第357bp的C（图6）。

2.2.3茶树CsANS基因启动子顺式元件分析启动子生物学功能的在线预测结果表明，CsANS基因启动子区域中，除了含有大量的核心启动子元件如CAAT-box和TATA-box之外，还存在多种顺式元件，如脱落酸相关元件ABRE，厌氧诱导相关的元件ARE，热应激反应相关元件HSE，昼夜控制调节元件circadian，低温应答元件LTR，光响应相关元件Sp1、ACE、I-box及MYB结合位点等（表2）。

2.3相对荧光定量PCR表达分析以18S-rRNA为内参，采用实时荧光定量PCR对不同遮光处理及未处理的武夷奇种C18叶片CsANS基因表达进行了分析，结果（图7）表明，其表达量在全光照处理（CK）时较高，75%遮光时较低。随着遮光度增加，呈现下调趋势。说明茶树叶片在光照强时花青素合成酶（ANS）表达量高，光照弱时表达量低。

3讨论

CsANS是紫叶茶树花青素合成的最后一个酶，也是将无色花青素经氧化脱水形成红紫色花青素的最关键酶，此中间产物进一步与3-O-葡萄糖基转移酶（3GT）偶联并且被传送到液泡中，形成显色的3-O-糖苷化花青苷[13]，在植物色泽形成中具有重要作用[14]。ANS基因最初是利用转座子标签技术从玉米的A2突变体中鉴定和克隆得到[15]，近年来在茶树（AY830416.1）、拟南芥（AT4G2288）、小麦（T.aestivum，AB247921）[16-17]等多种植物中也已经得到其克隆。本研究从武夷奇种C18中克隆得到了CsANS的cDNA全长序列，该基因编码的蛋白具有典型ANS蛋白的保守结构域：DIOX-N、20G-Fell-Oxy。DIOX-N（吗啡合成非血红素加氧酶的N-末端）是蛋白质与2-酮戊二酸/铁（Ⅱ）依赖性双加氧酶活性的高度保守的N-末端区域。2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶结构域由2-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)-依赖的氧化酶超家族组成，该家族包括脯氨酰4-羟化酶α亚基的C末端。全酶由一个α2β2复合物组成，α亚基是其主要的活性位点。能够催化反应：前胶原L-脯氨酸+2-酮戊二酸+O2=前胶原反式-4-羟基-L-脯氨酸+琥珀酸+CO2[14]。与其他已知的ANS蛋白相比，CsANS编码的氨基酸具有较高的同源性，它与高丛越橘（JN654701.1）的同源性较高，一致性为78%。所以推断CsANS与高丛越橘中典型的花青苷元合成酶基因的生物学功能类似。环境信号激活花青素苷合成途径，并促使茶树叶片开始积累花青素[18-20]。

不同的外界环境因子下，叶色会随之改变。光照是影响花青素苷合成最重要的环境因子之一。Hong等[21]对茶树进行暗光处理后发现ANS基因表达水平下降。Rosati等[17]从连翘中克隆得到ANS基因，并证明在Forsythin的花瓣中由于缺少ANS基因，所以形成无花色素苷。结合实时荧光定量PCR数据可以看出：不同遮光处理及全光照处理的武夷奇种C18叶片中CsANS基因均有表达；全光照处理下，ANS基因表达量较高，75%遮光时较低，且遮光度增加，ANS基因表达量减少。这表明光照强时ANS基因表达量较高，光照弱时ANS基因表达量较低；CsANS基因对于武夷奇种C18叶片色泽形成过程可能起主要作用，推断与其基因的催化功能吻合。近年来ANS启动子在洋葱（AlliumcepaL.）、三色堇（Viola×wittrockianaGams.）、紫心甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]中已经得到克隆[22-24]。洋葱、紫心甘薯和三色堇的ANS启动子除含有多个CAAT-box、TATA-box等基本启动子元件外，还含有与MYB转录因子结合的元件，以及参与光响应、逆境、激素应答的顺式作用元件。这与本研究中武夷奇种C18的ANS启动子发现的顺式作用元件相符，说明不同植物间ANS基因功能类似。武夷奇种C18的ANS启动子中发现了6种与光反应调控有关的顺式作用元件，结合CsANS基因在不同光强下表达量的变化，可以推测ANS是个受光照调控的基因。ANS基因在其他物种中参与光反应的研究已有报道[25-26]，而从启动子角度来研究这类基因功能还鲜有报道，本实验下一步可以构建ANS基因的启动子缺失载体，转化到植株中，通过光照处理研究该启动子是否为光诱导型启动子，确定启动子核心启动区，对光照调控ANS基因的原理加以阐释。

作者：金琦芳 陈志丹 孙威江 林馥茗 薛志慧 黄艳 唐秀华 单位：福建农林大学园艺学院 福建农林大学安溪茶学院 闽台特色作物病虫害生态防控协同创新中心