黑胆质成熟剂范文

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异常黑胆质成熟剂是维吾尔医常用复方制剂，由破布木CordiadichotomaForst.，红枣ZiziphusjujubaMill.，甘草GlycyrrhizauralensisFisch.，牛舌草AnchusaitalicaRetz.，小茴香FoeniculumvulgareMill.，地锦草EuphorbiahumifusaWilld.等药材组成,用于治疗由异常黑胆质所导致的肿瘤、糖尿病和心血管疾病等。现代研究已证实，异常黑胆质成熟剂可清除自由基、提高患者抗氧化功能、保护羟自由基引发的DNA氧化损伤和线粒体氧化损伤等，具有较强的抑制HepG2细胞体外生长、抑制HepG2细胞DNA、RNA和蛋白质生物合成等作用。以往的研究结果还表明，异常黑胆质成熟剂的总黄酮部位能明显抑制癌细胞生长、诱导癌细胞凋亡及调控凋亡基因表达等［1～3］。研究报道破布木、地锦草、甘草、牛舌草等含丰富的黄酮类化合物外，还含有其他非黄酮类多酚化合物［4～7］。本文采用分光光度法对异常黑胆质成熟剂水提物总黄酮及总酚含量测定的方法进行了系统研究。现报道如下。

1器材

1.1药材组成异常黑胆质成熟剂复方制剂的每味药材均购自新疆维吾尔医医院制剂中心，并由该中心鉴定。

1.2仪器Cintra40紫外可见分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器公司)；SartoriusBS110S精密电子天平（德国Sartorius）；旋涡振荡器；离心机。

1.3试剂芦丁标准品购自中国药品生物制品鉴定所，批号为0080-9705；没食子酸购自天津市光复精细化工研究所，批号为20060508；其它试剂均为A.R级。

2方法与结果

2.1总黄酮的测定

2.1.1样品溶液的制备精密称取异常黑胆质成熟剂干燥粉末0.5g，置10ml具塞试管中，加入4ml沸水，搅拌，充分溶解后加入无水乙醇6ml，置于漩涡振荡器上振荡3min，4000r/min离心5min，取上清液；沉淀物再加沸水4ml，搅拌，充分溶解后加入无水乙醇6ml，置于漩涡振荡器上振荡3min，4000r/min离心5min，取上清液；两次上清液合并，置于25ml容量瓶中，加60%乙醇至刻度，备用。

2.1.2对照品溶液的配制精确称取已烘干至恒重的芦丁标准品（纯度≥98%）18.6mg，置于50ml容量瓶中，用60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（每毫升含无水芦丁0.372mg）。

2.1.3氢氧化钠溶液及乙醇用量的选择本实验室用比色法进行异常黑胆质成熟剂水提物中黄酮含量测定时发现若按照常规的比色法进行测定样品溶液中会出现一些随时间延长逐渐增多的红色絮状的漂浮物，造成吸光度显著波动，影响测定结果的稳定性、准确性和重复性，发现仅含相同浓度显色试剂和乙醇的空白溶液同样有絮状物(白色)存在，因此可以认为这种现象是由溶液中氢氧化钠、水和乙醇三元体系不适当配比所造成，而不是样品中含有的干扰性杂质引起，这种在乙醇的盐析作用下析出的氢氧化钠絮状物因孔隙多具有很强的吸附能力，将溶液中的有色物质吸附在其表面上，从而产生红色絮状的漂流物，造成总黄酮浓度的测定结果偏高且不稳定。通过将4%氢氧化钠溶液的用量从4ml减到2ml并选择水作为补充溶剂，彻底排除了红色絮状物，大大改善了总黄酮测定方法的稳定性和准确度（见图1）。实验结果还表明，氢氧化钠溶液新调整的用量仍为过量，完全可以确保黄酮类成分充分反应。

2.1.4测定波长的选择精密吸取对照品溶液1.0和0.0ml及供试品溶液1.0，1.0和1.0ml，分别置10ml量瓶中，5份溶液分别标记为1，2，3，4，5号，按表1和表2定量加入水和/或显色剂，注意控制显色试剂加入时间：加入5%NaNO20.3ml，摇匀,放置6min;分别加入10%Al(NO3)30.3ml，摇匀，放置6min；再分别加入4%NaOH溶液2ml，最后用蒸馏水分别稀释至刻度,摇匀。不加显色试剂的以等量水来代替，以使溶液含醇量始终保持不变。

然后在可见紫外分光光度计上在300～600nm波长范围内，以2号溶液作为空白对照，对3，4和5号溶液进行扫描，分别绘制待测溶液的3种吸收光谱图。见图2。

图2表明，样品在此波长处却无明显吸收峰。但已被显色的待测溶液（样品3）与未加入硝酸铝溶液的样品溶液(样品2)在510nm波长处的吸光度之差ΔA值最大，因此，以5号溶液为空白，在400～600nm波长范围内对4号溶液进行扫描，得样品溶液的吸收光谱图(Munziq)。与芦丁溶液显色之后的吸收光谱图(Rutin，以1号溶液为空白，对2号溶液进行波长扫描)绘制在同一坐标上，得图3。

由图3确定，在510nm处，对照品和样品有共同的最大吸收峰，因此，我们以510nm作为测定波长。对照品测定时，以1号溶液为空白，测定2号溶液的吸光度；供试品测定时，以5号溶液为空白，测定4号溶液的吸光度。

2.1.5标准曲线的制备分别精密吸取对照品溶液0，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，3.5ml标准品溶液分别置于10ml容量瓶中,接着向容量瓶中依次加入4.7，4.5，4.0，3.0，2.0，1.5ml蒸馏水,使各容量瓶中的溶液总体积均变成5ml，加入5%NaNO20.3ml，摇匀，放置6min；分别加入10%Al(NO3)30.3ml，摇匀，放置6min；再分别加入1mol/LNaOH溶液2ml，最后用蒸馏水分别稀释至刻度,摇匀。以第1瓶溶液作为空白参照,分别在分光光度计上测A510。结果见表3。

表11号和2号溶液的组成ml（略）

表23～5号溶液的组成ml（略）

图1改进前后的吸光度动力学测量曲线比较（略）

图2待测溶液的吸收光谱图（略）

图3样品与芦丁溶液的吸收光谱图比较（略）

表3不同浓度芦丁的吸光度及LOD，LOQ值（略）

实验结果表明，芦丁浓度在0.011～0.130mg/ml范围内线性关系良好。得回归方程：A=11.356C-0.008，相关系数r=0.9999。最低检测限为0.06μg/ml，最低定量限为0.18μg/ml。

2.1.6加样回收率实验精密量取同一批已知浓度的样品溶液5份，每份1.0ml，分别加入芦丁标准品溶液0.2，0.4，0.7，1.0和1.5ml，分别按“2.1.5标准曲线的制备”项下方法显色后，以各自不含10%Al(NO3)3的溶液作为空白对照，进行含量测定，重复3次，并计算回收率。

表4供试品溶液的加样回收率（略）

结果表明，该方法加样回收率为95.1%～97.5%。

2.1.7精密度实验精密量取同一批已知浓度的样品溶液5份，每份1.0ml，分别按“2.1.5标准曲线的制备”项下方法显色后，以各自不含10%Al(NO3)3的溶液为空白对照，进行含量测定。结果见表5。

结果表明，该方法加样回收率为95.1%～97.5%。

表5供试品溶液的精密度（略）

结果表明，该方法精密度小于2%。

2.1.8异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物中总黄酮含量测定及重现性实验精密称取异常黑胆质成熟剂水提物和醇提物的干燥粉末各5份，每份约0.50g