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1器材与方法
1.1动物与分组选用体重45～50g，鼠龄22d的未成年Wistar雌鼠（清洁级）20只，由河北医科大学实验动物中心提供，随机分为实验组和生理盐水对照组两组。
1.2试剂与仪器一抗VEGF和IL-6兔抗IgG多克隆抗体、购于santacruze公司，SP9001试剂盒及DAB显色剂购于北京中山生物技术有限公司。LEICARM2125石蜡切片机（莱卡上海分公司），Nikon尼康光镜显微照相机（日本株式会社尼康），Motic6.0数码医学图象分析系统（厦门麦克奥迪仪器仪表有限公司）。
1.3OHSS大鼠模型的建立按改良的Ujioka方法［1］在未成年鼠体内建立OHSS模型。每只大鼠从第22日龄起连续4d皮下注射含有10IU妊娠雌马血清促性腺激素(pregnancymareserumgonadotropin,PMSG,天津实验动物中心)的生理盐水0.2ml,第5天(最后一次注射PMSG后24h)注射含有100IUHCG(丽珠制药厂)的生理盐水0.2ml。48h后卵巢显著增大,表面紫褐色,有多个卵泡形成,出现腹水表明建立了大鼠OHSS模型。对照组同期皮下注射等量生理盐水。
1.4标本采集和贮存HCG注射72h后即29d龄时，肌肉注射氯氨酮（0.1mg/kg）麻醉大鼠，尾静脉注射1%的EvansBlue(EB,Sigma)0.1ml。30min后从大鼠眼眶采血1ml入抗凝管，离心（3000r/min，10min）取血浆-20℃保存备检。另采血1ml于试管中，待血液标本凝固后，离心（3000r/min，10min）吸取血清-20℃保存备检。脱颈处死大鼠。正中切开腹腔，观察有无腹水,然后按照Ujioka［2］和Khanna［3］的改良方法用5ml生理盐水冲洗腹腔。将冲洗液收集到试管中,稀释至10ml,加0.1mol/L氢氧化钠0.05ml过滤,并以3000r/min的速度在室温下离心10min。然后用分光光度计(国产721型)在波长590nm测定OD值。随后取出双侧卵巢组织，用生理盐水清洗干净。用4%多聚甲醛固定24h后,常规石蜡包埋,5～7μm连续切片,用于免疫组化染色。
1.5观察指标
1.5.1腹腔毛细血管通透性根据标准浓度及其OD值绘制标准曲线,算出腹腔冲洗液EB的含量。
1.5.2VEGF和IL-6蛋白质水平测定采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）。大鼠外周血清VEGF测定定量试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供，灵敏度为3pg/ml，板内板间变异系数均<9.5%。血浆IL-6定量试剂盒购自上海雄森科技实业有限公司,检测方法按照说明书进行。每个样品均设2个复孔,重复3次试验,结果用MK2型酶标仪读取吸光值，绘标准曲线求相应值（pg/ml）。
1.5.3VEGF和IL-6蛋白质免疫组化染色采用SP法。一抗VEGF和IL-6兔抗IgG多克隆抗体购于santacruze公司，SP9001试剂盒及DAB显色剂购于北京中山生物技术有限公司，具体操作过程按说明书进行,DAB显色,苏木素复染。每组试验重复至少3次。用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.5.4免疫组化结果判断光镜下观察和图像分析,VEGF定位于黄体细胞,胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。Il-6在卵巢和子宫内膜均有表达。选用同批染色切片,每张切片随机选取5个视野(200×),Nikon尼康光镜显微照相机采样，图像扫存后Motic6.0数码医学图象分析系统测定平均光密度进行分析。
1.6卵巢过度刺激综合征诊断标准根据Golan［4］标准,卵巢体积增大、腹腔毛细血管的通透性增加和腹水均出现方可诊断为卵巢过度刺激综合征。
1.7统计学处理统计方法所有计量资料采用±s表示,均数差异的显著性采用SPSS统计软件进行方差分析,P<0.05表示在统计学上有显著性差异。
2结果
2.1OHSS大鼠腹水EB含量的变化OHSS大鼠腹腔EB含量卵巢过度刺激组腹腔EB含量显著高于对照组，在统计学上有显著性差异（P<0.05）。见表1。
2.2OHSS大鼠血中VEGF和IL-6的改变OHSS大鼠血中VEGF和IL-6含量显著高于对照组，在统计学上有显著性差异（P<0.05），见表2。
表1OHSS对大鼠腹腔EB含量的影响（略）
与对照组比较,*P<0.05;n=10
表2OHSS大鼠血中VEGF和IL-6的改变（略）
与对照组比较,*P<0.05；n=10
2.3OHSS大鼠卵巢和子宫中VEGF和IL-6的改变大鼠卵巢和子宫切片经免疫组化染色光镜下观察，实验组VEGF在卵巢黄体、子宫内膜和腺体上皮均有表达，IL-6在卵巢黄体和子宫内膜均有表达，免疫组化染色阳性细胞较对照组表达较强，经Motic6.0数码医学图象分析系统分析光密度较对照组在统计学上有显著性差异（P<0.05）。见表3。
表3OHSS大鼠卵巢和子宫中VEGF和IL-6的免疫组化光密度值（略）
与对照组比较,*P<0.05；n=10
3讨论
OHSS是一种医源性疾病,是指促性腺激素HMG/HCG诱发排卵而引起的证候群,严重的OHSS甚可危及生命。由于近30年来生殖内分泌研究进展甚速,助孕技术在临床上被广泛应用,药物诱发排卵、超排卵引起OHSS发生率亦有所上升,如何有效地控制疾病的发展、同时提高患者受孕率成为新的课题。近来研究表明,VEGF是一种特异性地作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子,具有增加微血管与小静脉通透性、促进血管内皮细胞分裂、增殖等作用［5］。
本研究通过在未成年鼠体内建立OHSS模型,此时卵巢显著增大,表面紫褐色,有多个卵泡形成,有腹水形成,表明成功建立了OHSS模型。本研究显示，实验组血中VEGF和IL-6含量增高，VEGF和IL-6在卵巢和子宫内膜均有表达，较对照组在统计学上有显著性差异。表明在OHSS中,无论是多个卵泡发育和卵子的成熟,排卵后黄体的生成等,均可能导致卵巢和子宫产生和分泌大量的VEGF和IL-6，从而产生局部和全身相关的病理改变，但其发病的具体机理目前尚未明了,有待于进一步研究，从而为临床上进一步治疗OHSS奠定实验学基础。