中药化学含量测定方法实践证明范文

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本文作者：王鹏宋宗华李清果德安钱忠直毕开顺单位：沈阳药科大学药学院沈阳国家药典委员会北京中国科学院上海药物研究所上海

在质量标准研究中,一项重要的工作就是要对质量标准中涉及到的分析方法进行方法学验证,以保证所用的分析方法能够准确可靠地控制药品质量。5中国药典62005年版一部新增了中药质量标准分析方法验证指导原则[1],该指导原则将范围与线性分列,线性指测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度,而范围指能达到一定精密度、准确度和线性时,测试方法适用的高低限浓度或量的区间。原则中对需要验证的分析方法与验证的具体指标做了比较详细的阐述,但中药化学成分复杂,被测成分含量往往较低,且含量差异较大,考察范围如何确定与其验证方法目前尚无统一的说明。文中亦未涉及各具体指标在验证时可接受的标准,国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求[2]。本文以厚朴药材为例,主要研究精密度、准确度和范围的具体考察方法,为中药质量标准分析方法验证指导原则的修订提供数据支持。

1仪器与试药

Agilent1100系列高效液相色谱系统,Agilent1100高效液相色谱化学工作站;SARTORIUSCP225D型天平(德国赛多利斯公司);YB-1A真空恒温干燥箱(天津市鑫洲科技有限公司);SZ-93A自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。对照品厚朴酚(批号110729-200310)和厚朴酚(批号110730-200609)均购自中国药品生物制品检定所,供含量测定用;厚朴药材经沈阳药科大学孙启时教授鉴定为厚朴MagnoliaofficinalisRehd1etWils;甲醇为色谱纯(山东禹王实业有限公司);水为二次重蒸水。

2色谱条件

色谱柱:KromasilC18柱(416mm@200mm,5Lm);流动相:甲醇-水(78B22);检测波长:294nm；流速:110mL#min-1;柱温:35e;进样量:5LL。在此条件下,厚朴酚、和厚朴酚色谱峰与相邻峰之间分离度均大于115,峰形对称,理论板数按厚朴酚计算不低于3800,色谱图见图1。

3溶液的制备

3.1对照品溶液的制备取厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品适量,精密称定,加甲醇分别制成含厚朴酚11125g#L-1、和厚朴酚01996g#L-1的对照品储备液。分别精密量取厚朴酚、和厚朴酚对照品储备液适量置50mL量瓶中,加甲醇制成含厚朴酚13510mg#L-1、和厚朴酚79165mg#L-1的混合对照品溶液。

3.2供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约012g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,摇匀,密塞,浸渍24h,滤过,精密量取续滤液5mL,置25mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。

4方法学考察

4.1线性关系考察精密量取对照品溶液015、110、210、410、810、10mL,分别置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成标准系列溶液,按上述色谱条件进样分析,记录色谱峰面积,以对照品浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标,绘制标准曲线。厚朴酚回归方程为:A=61786C-11764(r=11000);和厚朴酚回归方程为:A=61686C-11008(r=11000)。结果表明:厚朴酚、和厚朴酚分别在61750~13510mg#L-1、31982~79165mg#L-1范围内峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。

4.2精密度试验

4.2.1仪器精密度精密吸取低、中、高浓度混合对照品溶液(含厚朴酚浓度分别为61750、27100、10810mg#L-1;含和厚朴酚浓度分别为3198215193、63172Lg#mL-1),在上述色谱条件下,分别重复进样6次,计算色谱峰面积RSD,厚朴酚分别为018%、019%、018%;和厚朴酚分别为019%、017%、110%。

4.2.2方法重复性考察¹制备同一浓度6份样品的测定结果(n=6)。取同一批厚朴样品约012g,精密称定,按/3120项下方法平行制备供试品溶液6份,按上述色谱条件进样分析,记录色谱峰面积,计算厚朴酚、和厚朴酚的含量和RSD,结果见表1。º制备三个不同浓度共9份样品的测定结果(n=9)。在10倍范围内,按/3120项下方法平行制备低、中、高浓度供试品溶液,重复3次,按上述色谱条件进样分析,记录色谱峰面积,计算厚朴酚、和厚朴酚的含量和RSD,结果见表2。

4.3加样回收率考察

4.3.1制备同一浓度6份样品的测定结果(n=6)。称取已知含量的厚朴样品011g,精密称定,共6份,每份分别精密加入厚朴酚对照品溶液2ml与和厚朴酚对照品溶液112mL,按/3120项下方法平行制备供试品溶液,按上述色谱条件进样分析,计算加样回收率,结果见表3。

4.3.2制备三个不同浓度共9份样品的测定结果(n=9)。称取已知含量的厚朴样品011g,精密称定,共9份,平均分为3组,每组分别精密加入对照品溶液适量,按/3120项下方法平行制备成低、中、高3个浓度的供试品溶液,按上述色谱条件进样分析,计算加样回收率,结果见表4。分别称取已知含量的厚朴样品0103g、011g、013g,各3份,精密称定,共9份,每份分别精密加入对照品溶液适量,按/3120项下方法平行制备成低、中、高3个浓度的供试品溶液,按上述色谱条件进样分析,计算加样回收率,结果见表5。称取已知含量的厚朴样品0105g,精密称定,共9份,平均分为三组,每组分别精密加入对照品溶液适量,按/3120项下方法平行制备成低、中、高3个浓度的供试品溶液,按上述色谱条件进样分析,计算加样回收率,结果见表6。0、2、4、6、8、12h进样,按上述色谱条件测定,厚朴酚、和厚朴酚峰面积RSD分别为018%、017%,表明在12h内供试品溶液稳定。

5结果与讨论

5.15中国药典62005年版一部厚朴项下规定,本品按干燥品计算,含厚朴酚与和厚朴酚的总量不得少于210%。据文献报道厚朴中这两种成分含量差异较大[3,4],本文选取药典规定低限的50%为最低点,扩大至10倍范围,考察重复性和回收率。结果表明重复性RSD值随考察范围增大而增大,且同一浓度6份供试品溶液的测定结果与低、中、高浓度9份供试品溶液的测定结果方差非齐性(P<0105)。范围扩大后,测得高浓度样品含量降低,说明对于含量高的样品存在溶剂不能提取完全的可能。回收率RSD值亦随考察范围增大而增大。当药材取样量不同,根据被测成分含量按1:1添加对照品时,误差影响相对较小。而当确定相同取样量,通过改变对照品加入量考察回收率时,发现当考察范围扩大后,低浓度供试品溶液回收率明显降低,9份样品测定结果RSD明显增大,加入对照品的量相对于药材中原含量越少,回收率越低,所得RSD值越大。对照品加入量过低,相对误差较大。建议中药化学成分定量分析时建立分析方法适用范围不宜过宽,对于含量相差较大样品可进行稀释后在适宜范围内进行测定。

5.2重复性试验结果显示,RSD值随考察范围增大而增大,而样品含量降低,但加样回收试验结果并未显示相应范围内回收率降低。说明直接添加对照品与从细胞中提取被测成分是两个不同的过程,被测成分的提取过程会受到其他成分和细胞结构等的影响。

5.3中药化学成分复杂,被测成分含量往往较低,且含量差异较大,考察范围如何确定与其验证方法目前尚无统一的说明。本文对范围的确证进行了初步探讨,在所建立的范围内,考察6份和9份测定结果评价的差异和RSD值,研究9份评价高低浓度的选择方法,对扩大考察范围后的精密度和准确性进行评估,以期为中药质量标准分析方法验证指导原则的修订和完善提供数据支持。