抑制端粒保护蛋白TPP1表达诱导ATM依赖DNA损伤反应范文

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作者：郭晓兰，袁国华，周京国，唐中，刘宁涛，杨明辉，青玉凤，吴凤霞，朱道银

【摘要】目的：构建端粒保护蛋白TPP1短发夹RNA表达载体，探讨抑制TPP1表达后对端粒DNA损伤及细胞增殖的影响.方法：体外构建端粒保护蛋白tpp1shRNA逆转录病毒表达载体shTPP101，shTPP102，与表达外源性TPP1的TPP1HA质粒共同转染293T细胞，WesternBlot检测shTPP1抑制外源性TPP1蛋白表达；RTPCR检测shTPP1抑制小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast,MEF）内源性TPP1mRNA的表达.再用shTPP1分别感染ATM＋/＋MEF和ATM－/－MEF细胞后，分别采用细胞生长曲线和BrdU掺入法检测细胞增殖，免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交法（IF/PNAFISH）检测端粒功能障碍诱导损伤灶（TIF）的形成.结果:shTPP101和shTPP102均能明显抑制外源性TPP1蛋白和内源性TPP1mRNA的表达，shTPP101和shTPP102作用于原代培养的MEFs后细胞生长缓慢，BrdU阳性细胞数量分别占8.0%和8.7%，显著低于对照细胞的29.3%(P<0.01,P<0.01)；而细胞表现为体积变大，形态扁平等类似细胞衰老的形态学改变；IF/PNAFISH法检测结果显示，shTPP1作用于atm＋/＋MEF细胞后导致端粒DNA损伤标志物-磷酸化的H2AX（γH2AX）和53BP1损伤灶（TIF）的形成，定量结果显示约50%的ATM+/+细胞中出现至少5个TIF；而在shTPP1作用后的ATM-/-细胞中，端粒γH2AX和53BP1形成的TIF数量显著减少，出现5个TIF的细胞数量不足5%，与对照组细胞相比无显著性差异.结论：抑制TPP1表达后诱发端粒ATM依赖的dna损伤反应，进而抑制细胞增殖，促进细胞衰老.

【关键词】端粒;短发夹RNA;DNA;损伤反应

0引言

端粒位于真核细胞染色体的末端，由串联重复的DNA和端粒结合蛋白组成，其主要功能是保持染色体的完整性，同时也是细胞生存期限的关键调控因子［1］.对肿瘤的研究发现，大多数肿瘤细胞在分裂增殖过程中保持稳定的端粒长度，因而通过干涉端粒的结构和功能有可能控制肿瘤发展［2］.目前发现端粒保护蛋白主要有6个亚单位：TRF1，TRF2，TIN2，Rap1，POT1和TPP1，他们共同组成端粒保护蛋白复合体（Shelterin）［3］，其中TPP1是形成蛋白复合体的关键因子之一［4-5］.我们通过采用靶向端粒结合蛋白TPP1小片段干扰RNA（siRNA）技术，构建TPP1短发夹RNA（shRNA）逆转录病毒介导的表达载体，观察抑制TPP1表达后所诱导的端粒DNA损伤反应以及对细胞增殖和衰老的影响.

1材料和方法

1.1材料构建TPP1的shRNA寡核苷酸和PCR引物由美国Sigma公司合成；RNA提取试剂盒、RTPCR反应试剂盒、转染试剂lipofectamine（Invitrogen公司）；限制性内切酶BglⅡ,EcoRⅠ,HindⅢ（Biolabs公司）；γH2AX鼠mAb（美国Upstate公司）；凝胶成像系统（美国AlphaInnotech公司）；PCR扩增仪PTC200EngineCycler（美国MJResearch公司）；BX41型显微镜（日本Olympus公司）.

1.2方法

1.2.1TPP1shRNA表达载体的构建小鼠TPP1的mRNA序列来自GenBank(GI:22823923)，参照siRNA靶点设计原则，设计如表1.合成的正义链和反义链经变性和退火反应后形成双链DNA，用限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ将其定向克隆至逆转录病毒载体RetropSuper（含有嘌呤霉素抗性筛选标记），经EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定得到的阳性克隆RetropSupershTPP1，简称shTPP1.表1shTPP101和shTPP102的碱基序列

1.2.2细胞培养和转染将质粒shTPP101和shTPP102分别转染病毒包装细胞293T，转染操作按lipofectaminePlus说明进行：①接种1×105个293T细胞于10cm细胞培养盘中，37℃，50mL/LCO2培养过夜；②更换为无血清DMEM，逐滴加入转染试剂Lipofectamine（含4μgshTPP1质粒DNA），培养4～6h后，更换为完全DMEM培养基培养；③分别于培养24，48h后收集293T细胞培养上清感染MEF细胞，72h后加入2mg/L嘌呤霉素进行筛选.

1.2.3WesternBlot检测shTPP1抑制外源性TPP1表达细胞转染72h后收集293T细胞，超声破碎细胞后，4℃,10000g离心20min，收集上清进行蛋白质定量测定.取50μg蛋白质经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移至PVDF膜，以抗HA抗体检测TPP1HA的表达水平.

1.2.4RTPCR检测shTPP1抑制MEF内源性TPP1mRNA的表达收集含有逆转录病毒的293T细胞培养上清，以MOI=500的病毒滴度感染MEF细胞，48h后重复感染1次，72h后收集细胞提取总RNA，采用RTPCR检测shTPP101和shTPP102对MEF细胞内源性TPP1在转录水平表达的干扰作用.TPP1上游引物序列：5′ATGTCCGATTCAGGGTTGCTGG3′，下游引物序列：5′TCATACCTGGGTTAACTCAGACTCTG3′.同时扩增GADPH作为内参.GADPH上游引物序列：5′TCACCACCATGGAGAAGGC3′,下游引物序列：5′GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA3′.PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共25个循环.

;1.2.5细胞生长曲线和BrdU掺入实验MEF细胞经含有shTPP101和shTPP102表达质粒的逆转录病毒感染后，加入2mg/L嘌呤霉素筛选2wk获得稳定表达shTPP101或shTPP102的细胞.然后按5×104/孔接种于细胞培养6孔板中，分别于第0，2，4，6，8日作细胞计数，绘制细胞数量-时间的生长曲线.同时按2×104/孔的细胞接种8孔的chamberslide，培养过夜后加入BrdU（终浓度为10μmol/L），继续培养1h，固定细胞后以抗BrdU抗体检测掺入BrdU后的细胞及其数量.

1.2.6免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交法（IF/PNAFISH）检测端粒功能障碍诱导的损伤灶（TIF）将逆转录病毒介导的shTPP1分别感染ATM+/+MEF和ATM-/-MEF细胞，2mg/L嘌呤霉素筛选2wk.按2×104/孔接种chamberslide培养过夜，按文献［6］行IF/PNAFISH法检测端粒上磷酸化的H2AX和53BP1的TIF形成.同时WesternBlot检测细胞中磷酸化的H2AX（γH2AX）水平.

统计学处理:实验结果中两组计量资料之间的比较，采用x±s进行t检验.

2结果

2.1逆转录病毒介导的shTPP1质粒的鉴定和功能检测按上述描述的方法构建逆转录病毒介导的shTPP1质粒.shTPP1质粒经限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果显示约为300bp的片段，而空载体酶的片段为240bp左右，与预期值一致，即shTPP1的大小为60bp左右（图1A）.shTPP1与表达外源性的TPP1HA质粒共同转染293T细胞后，WesternBlot结果显示shTPP101和shTPP102均能明显抑制外源性TPP1蛋白的表达（图1B）.RTPCR结果表明shTPP101和shTPP102分别有效地降低了MEF细胞内源性TPP1在转录水平的表达（图1C）.

A:shTPP1经EcoRⅠ和HindⅢ酶切；B:WesternBlot检测shTPP1作用后外源性TPP1蛋白的表达水平;C:RTPCR电泳.M:标准分子质量;V:空载体;1:shTPP11;2:shTPP12;Tubulin:加样的蛋白量；GAPDH:内参.

图1shTPP1质粒的构建和鉴定及其功能检测

2.2抑制TPP1表达对细胞增殖的影响与对照组细胞相比，shTPP1作用于原代培养的MEFs后，细胞生长明显减缓.BrdU细胞增殖掺入实验进一步证实，BrdU阳性细胞数量在空载体质粒转染的对照细胞组中占29.3%，在shTPP101或shTPP102作用后的细胞分别仅占8.0%(t=11.49,P<0.01)和8.7%(t=10.96,P<0.01).增殖受到抑制的细胞在显微镜下表现为体积变大、形态扁平等类似细胞衰老的形态学改变（图2）.

2.3抑制TPP1表达对端粒DNA损伤反应的影响shTPP1作用于ATM+/+细胞后，γH2AX明显增高，而在ATM-/-细胞中则未检测到(图3A)；在空载体质粒转染的ATM+/+细胞中γH2AX形成TIF的阳性率为5%，在shTPP101或shTPP102作用后的ATM+/+细胞则分别为45%(t=15.49,P<0.01)和40%(t=11.26,P<0.01)；53BP1在空载质粒转染的ATM+/+对照细胞中形成TIF的阳性率为4.0%，而在shTPP101或shTPP102作用后的ATM+/+细胞中TIF分别为42%(t=14.72,P<0.01)和35%(t=9.97,P<0.01)；TPP1受到抑制后，ATM+/+细胞中γH2AX形成TIF的信号（绿色）、53BP1形成TIF的信号（绿色）与端粒PNAFISH杂交的信号TTAGGGFISH（红色）相重合，表明DNA损伤反应发生在染色体的端粒.定量分析显示，大约50%的ATM+/+细胞中出现至少5个由γH2AX或53BP1形成的TIF（图3B，C）；ATM-/-细胞在shTPP1作用后的细胞中形成TIF的数量与空载体转染细胞相比无明显差异，ATM-/-细胞中出现5个TIF的细胞数量不足5%（图3D），表明抑制TPP1表达后诱导端粒发生了ATM依赖的的DNA损伤反应.

3讨论

端粒除保持染色体的完整性外，在调控细胞的增殖能力方面起着关键性作用.哺乳动物细胞通过端粒上特有的蛋白区分正常染色体末端不被识别为损伤的DNA而诱发ATM（ataxiatelangiectasiamutated）或ATR（ataxiatelangiectasiaandRad3related）介导的DNA损伤反应［7］，出现DNA损伤蛋白53BP1和γH2AX在端粒的聚积，导致细胞增殖衰竭或凋亡［8］.端粒功能障碍引起的细胞增殖衰竭和凋亡是机体清除衰老细胞的一个重要途径，也是机体构成的一道重要癌变防御屏障.大多数肿瘤细胞在分裂增殖过程中保持稳定的端粒长度，因而在肿瘤细胞中诱导端粒功能障碍有可能成为新的治疗策略.

A:WesternBlot检测ATM+/+和ATM-/-细胞中的γH2AX；B:IF/PNAFISH显示ATM+/+和ATM-/-细胞端粒中γH2AX形成的TIF；C:IF/PNAFISH显示ATM+/+和ATM-/-细胞端粒中53BP1形成的TIF；D:定量分析γH2AX和53BP1在ATM+/+和ATM-/-细胞端粒中TIF的形成.V:空载体;1:shTPP11;2:shTPP1.

图3抑制TPP1表达诱发细胞端粒ATM依赖的DNA损伤反应

端粒保护蛋白在调控端粒的结构和功能方面起着关键性作用.最近OConnor等［9］发现，TPP1表达的缺失可以导致端粒保护蛋白复合体的形成障碍，Chen等［10］则发现TPP1具有调控胞核输出通路信号作用，直接调节其他端粒保护蛋白亚单位在核内水平.鉴于TPP1在端粒保护蛋白复合体中的重要功能，我们设

想是否可以通过抑制TPP1表达而诱导端粒功能障碍、抑制细胞增殖，为此我们构建了针对TPP1的siRNA表达载体（shTPP1），并观察其对端粒DNA损伤反应的影响.

MEF细胞经shTPP1作用后，内源性TPP1mRNA表达受到完全抑制，伴随细胞生长明显迟缓，BrdU摄入细胞的阳性率较空载质粒转染的细胞减少3倍左右；同时shTPP1作用后细胞出现体积变大，形态扁平等细胞衰老的形态学表现.结果说明经shTPP1抑制内源性TPP1表达后可以抑制细胞增殖，导致细胞衰老.

真核细胞的端粒DNA隐藏于保护蛋白复合体之中，从而避免被细胞自身的DNA损伤检控机制识别为DNA双链断裂（doublestrandbreak,DSB）而诱导DNA损伤反应.抑制TPP1表达导致细胞衰老是否可以归因于DNA损伤反应而引起的端粒功能障碍呢？为此我们对端粒DNA损伤反应进行了检测，结果显示，经shTPP1作用抑制TPP1表达后，DNA损伤蛋白H2AX的磷酸化水平明显增高，TIFs发生率在shTPP1作用后的ATM+/+细胞中达到40%~45%，明显高于转染空载质粒的ATM+/+对照细胞的4.0%~5.0%；而且γH2AX和53BP1形成的TIF信号与端粒PNAFISH杂交信号相重合，表明DNA损伤反应发生在染色体的端粒.在TPP1缺失的ATM+/+细胞中大约50%的细胞中出现至少5个TIF，但ATM敲除（ATM-/-）细胞在TPP1表达抑制后，γH2AX并无显著改变，也极少见到γH2AX或53BP1在端粒上形成TIF，表明抑制TPP1表达诱导的端粒DNA发生损伤反应依赖于ATM.

【参考文献】

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