葛根素在新生鼠缺氧缺血性脑损伤中神经保护作用范文

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作者：姜泓,王玲,张义和,刘世平,刘广忠

【摘要】目的:建立新生大鼠缺氧缺血脑损伤(HIBD)模型,观察新生鼠缺氧缺血后脑组织一氧化氮(NO)和NO合成酶(NOS)及神经元凋亡的变化及葛根素对HIBD的保护作用及机制.方法:用7日龄SD大鼠制备HIBD模型，治疗组在缺氧缺血（HI）后早期腹腔注射葛根素50mg/kg两次.在HI后不同时间测定脑组织匀浆NO和NOS含量以及神经元凋亡数量.结果:HIBD组在HI后24h脑组织NO，NOS明显高于对照组(P<0.05)；HI后6h海马CA1区凋亡细胞增多，24h达高峰；葛根素组24h脑组织NO，NOS较HIBD组相比，显著下降(P<0.05)，同时海马CA1区的凋亡细胞数在24h较HIBD组明显减少(P<0.05).结论:葛根素可通过抑制NOS的表达，减少NO的过量生成，从而减轻HIBD后的神经元凋亡，表明葛根素对新生大鼠HIBD有保护作用.

【关键词】葛根素;一氧化氮;一氧化氮合成酶;神经元凋亡;缺氧缺血;新生鼠

0引言

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是新生儿期的常见病,是导致死亡和儿童神经系统伤残的主要原因之一，目前尚缺乏特效治疗方法.葛根素为豆科葛属植物野葛干燥根中提取的异黄酮类的主要有效成分之一，在成人的脑血管疾病治疗中疗效显著，但在HIE时的作用鲜见报道.本研究通过建立新生大鼠缺氧缺血模型，观察大鼠脑缺氧缺血后腹腔内注射葛根素对脑组织NO和NOS含量及神经元凋亡的影响,以探讨葛根素在HIE中的作用与机制.

1材料和方法

1．1材料新生7d龄SD大鼠48只，体质量12~16g，二级动物，雌雄不限，由第四军医大学实验动物中心提供.葛根素注射液购自山东鲁抗辰欣药业有限公司，NO及NOS试剂盒购自南京建成生物工程研究所,原位细胞凋亡检测试剂盒（德国ROCHE公司生产）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，缺氧舱及氧浓度监测仪由第四军医大学航空医学系提供.

1．2方法

1.2.1实验动物分组将48只新生大鼠随机分为3组：①葛根素治疗组：于缺氧缺血后即刻、4h腹腔注射葛根素50mg/kg.②缺氧缺血性脑损伤组(HIBD)：于缺氧缺血后即刻、4h腹腔注射等量生理盐水.③假手术对照组：仅作颈部切口，游离右侧颈总动脉，但不结扎，于手术后即刻、4h腹腔注射等量生理盐水.

1.2.2新生大鼠HIBD模型的建立以5g/L的氯胺酮麻醉，取仰卧位固定于手术板上.采取颈正中偏右2~3mm切口，游离右侧颈总动脉，用50丝线结扎、缝合切口后，恢复2h置于2000mL常温常压缺氧舱，以1.5L/min的速度输入含80mL/L氧气和920mL/L氮气的混合气体，以测氧仪监控氧的浓度为(80±5)mL/L,2h后取出，返回母鼠身边继续哺乳喂养.

1.2.3脑组织标本的留取于脑缺氧缺血后6h,24h分别麻醉后断头取脑并矢状离断为左右半球.

1.2.4脑组织匀浆的制备及NO,NOS的检测取部分右脑组织漂洗、去除血渍、称重，按1∶9的比例加入冷生理盐水，在玻璃匀浆管中充分研碎致匀浆化，取100mL/L脑组织匀浆3500r/min离心10min,取上清液检测NO,NOS.具体操作按试剂盒说明.

1.2.4石蜡切片的制备及细胞凋亡检测断头后，立即取出部分右脑组织置于中性甲醛（pH7.2~7.4的磷酸缓冲液PBS为溶剂的甲醛）中常温固定24h，自丘脑中1／3平面行冠状切片，厚约4mm，依次脱水、浸蜡、包埋，切片厚度约6μm,HE染色，光镜下观察确定海马位置，临近处的石蜡标本连续切片.切片放入65℃的烤片机上6h，取出后放入4℃冰箱待用.

原位缺口末端标记(TUNEL)染色细胞凋亡检测：将组织切片依次脱蜡至水后，进行TUNEL染色，观察400倍光镜5个视野下平均阳性细胞数，具体操作步骤按试剂盒中的说明书进行（选用蛋白酶K通透处理）.

统计学处理:数据以x±s表示，两组间比较采用LSDt检验.

2结果

2.1NO，NOS的变化HIBD在HI后6h脑匀浆NO,NOS水平开始升高，但与对照组相比无统计学意义（P>0.05）；24h脑匀浆NO，NOS水平明显增高，与对照组相比差异显著（P<0.05）；而葛根素治疗组24h脑匀浆NO，NOS水平显著低于HIBD，两组相比，差异有统计学意义（P<0.05,表1）.

2.2HE染色和TUNEL染色假手术组在各个时间点脑组织切片无明显缺氧缺血改变.HIBD组6h缺氧缺血侧海马组织轻度水肿，可见神经元肿胀、变性、空泡形成，核固缩，嗜碱性增强，核仁消失，并可见到凋亡小体；24h细胞凋亡达高峰，并见许多坏死细胞，嗜伊红深染（图1）.HIBD组各时间点其缺氧缺血侧细胞核内均可观察到凋亡细胞，凋亡细胞形态学特征为胞体缩小，细胞膜完整，染色质凝集，密度增高，呈块状或颗粒状，胞核中有棕色颗粒.HIBD后6h其阳性细胞开始出现，24h最为明显，呈小片样分布.凋亡细胞多位于病变较重的皮质的边缘内带和海马CA1区；而假手术对照组仅偶见到阳性细胞；葛根素治疗组细胞凋亡的时程与HIBD组一致，分布极其相似，但海马CA1区的凋亡细胞数在24h后各时间点较HIBD组均明显减少（P<0.05，表2）.表1新生大鼠各组脑匀浆NO,NOS水平表2新生大鼠不同时间点右侧大脑海马CA1区凋亡细胞数

3讨论

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sp;一氧化氮（NO）和内皮素（ET）是一对由血管内皮细胞分泌的血管舒张和收缩因子，其生物活性相互拮抗［1-2］.NO是一种具有自由基性质的气体生物活性分子,大量研究表明，NO在脑缺氧缺血性损伤中具有神经保护和神经毒性的双重作用，生理状态下，NOS催化LArg和分子氧生成低水平固有型NO，作为内皮源性舒张因子具有舒张血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、拮抗氧自由基的作用；但HIBD后nNOS及iNOS被激活［3］,NO过度合成则可干扰与生物转化有关的酶类的活性、破坏DNA结构、抑制线粒体的呼吸功能，具有明显的神经毒性作用［4-5］.

葛根素是从中药葛根中提取的一种异黄酮单体，其化学名为4，7二羟基8D葡萄糖基异黄酮.既往研究表明其具有多种药理作用，包括：改善脑微循环，提高局部血流量，阻止Na+内流，具有Na+通道抑制剂的作用［6］；抑制钾外流［7］；抗氧化［5］；拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性作用，减轻谷氨酸钠、N甲基D天冬氨酸或卡因酸所介导的对鼠神经元的损害［7-8］，葛根素的多种药理作用与HIBD发病机制相关.

本试验通过新生鼠HI后腹腔内注射葛根素并测定脑组织NO和NOS含量及神经细胞凋亡变化,来探讨葛根素在HIBD中神经保护作用的机制.结果表明HIBD组在HI后24h与对照组比较脑组织中NO,NOS明显增高（P<0.05），同时缺氧缺血后海马CA1区和额叶皮质可见较多凋亡细胞DN断末端标记阳性信号，24h达高峰，表明脑缺氧缺血后，NOS被大量激活，使NO生成增加，而高水平的NO作为炎性细胞因子参与神经细胞损伤的过程.本研究表明,外源性给予葛根素可通过抑制NOS的表达而减少NO过量生成，从而减轻脑组织凋亡，对HIBD起到神经保护作用.

综上所述，HI后给予葛根素治疗可降低新生大鼠脑组织中的NO含量，对HIBD有一定的保护作用，为临床治疗新生儿HIE了理论依据.鉴于该药在临床应用的安全性,价格低廉，很有可能成为治疗新生儿HIE的有效药物之一.

【参考文献】

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