子宫颈鳞癌组织中基质金属蛋白酶9表达意义范文

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作者：孔灵玲，王学春，崔文，王旭，杨庆媛，宋希元，姜晓刚，燕春艳

【摘要】目的：探讨基质金属蛋白酶MMP9与宫颈鳞癌的发生、发展及转移的关系.方法：免疫组化SP法测定MMP9的表达及分布；明胶酶谱法测定活性型MMP9蛋白的含量；RTPCR技术检测MMP9mRNA表达水平.结果：在宫颈鳞状上皮癌(SCC)组织和高度鳞状上皮内损害(HSIL)中MMP9蛋白的表达量均高于低度鳞状上皮内损害(LSIL)(P<0.05)；宫颈SCC组织中淋巴结转移组MMP9的阳性率为78.3%,高于无淋巴结转移组63.3%(P<0.01)；MMP9的表达在不同的病理分级与临床分期之间差异无统计学意义.而SCC和HSIL中的MMP9酶活性均高于LSIL(P<0.01).而SCC和HSIL中的MMP9mRNA的表达情况亦与上述结果相似.结论：MMP9与宫颈SCC的早期浸润及转移有关，MMP9表达量的增高，尤其是其酶活性的增高有助于正确评估患者预后和制定适当的临床治疗方案.

【关键词】宫颈肿瘤;鳞状细胞癌;金属蛋白酶类;肿瘤转移

0引言

宫颈癌发病率高，从低度鳞状上皮内损害(lowgradesquamousintraepitheliallesions,LSIL)到高度鳞状上皮内损害(highgradesquamousintraepitheliallesions，HSIL)和原位癌(carcinomasinsitu)，然后到鳞状上皮癌(squamouscellcarcinomas，SCC)是一个连续的过程.我们研究基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)在宫颈癌的发生和发展过程中所起作用.

1材料和方法

1.1材料宫颈癌活检组织84例取自我院199901/200212宫颈癌患者，年龄25~68岁.按国际妇产科联盟(FIGO)1994年修订的临床分期标准，LSIL(CINI)10例，HSIL(CINII,III)21例，宫颈鳞癌53例.在宫颈鳞癌中I期14例，II期39例；高分化11例，中分化17例，低分化25例；淋巴结转移23例.手术时取肿瘤组织、癌旁组织、手术切缘及周围淋巴结.抗MMP9羊抗人多克隆抗体及SP免疫组化试剂盒（北京中山生物制剂公司）；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和明胶（美国Sigma公司）；Trizol试剂盒（美国GibcoBRL公司）；引物由上海生工生物工程公司合成.

1.2方法

1.2.1组织MMP9表达免疫组化及结果判定采用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶法(SP法).一抗的工作浓度为1∶100；阴性对照组以PBS代替一抗.每个病例均同时做HE染色和MMP9免疫组化.结果判定参考文献［1］,以胞质或(和)胞膜出现棕黄色颗粒沉着为阳性表达.先按染色强度打分：无色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；再按阳性细胞所占百分比打分：阳性细胞<5％为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75％为4分.将染色程度和阳性细胞百分比的乘积进行评分：0～4分为(－)，5～8分为弱阳性(+)，9～12分为强阳性().

1.2.2组织MMP9活性分析标本于液氮下粉碎、匀浆、离心，取上清液以Centricon浓缩柱按体积比离心浓缩6倍，BioRad蛋白定量试剂盒定量、分装.取20μL上清液进行聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳，浓缩胶浓度50g/LpH6.8，分离胶浓度100g/LpH8.8.电泳后，凝胶于50mmol/LTrisHCl（pH7.0）,5mmol/LCaCl2,100mmol/LNaCl,25mL/LTritonX100中浸泡振摇1h，中间换液1次，不含TritonX100的洗液洗5min后，再用50mmol/LTrisHCl（pH7.5）,5mmol/LCaCl2,200mmol/LNaCl,0.2g/LNaN3,10mL/LTritonX100的孵育液37℃条件下孵育18～24h，考马斯亮蓝R250染色，脱色，干燥封胶.通过凝胶图像吸光度分析系统对结果进行灰度扫描，以平均吸光度（INT）和杂交信号面积（S）的乘积代表信号强度.

1.2.3MMP9mRNA的表达按Trizol试剂盒说明提取组织总RNA，取上述RNA样品1.5μg进行逆转录反应，反应体系为20μL，反应条件为37℃1h，95℃5min.取产物5μL进行PCR扩增，MMP9与内参照基因βactin的引物共管扩增.MMP9的引物序列为5′GGTCCCCCCACTGCTGGCCCTTCTACGGCC3′及5′GTCCTCAGGGCACTGCAGGATGTCATAGGT3′.βactin引物序列为5′CCGAATTCATCATGTTTGAGACCTTCAA3′及5′CCGGATCCATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′.MMP9及βactin预计扩增片段分别为638bp及326bp.PCR参数为94℃30s，55℃30s，72℃30s.30个循环后，72℃延伸5min.通过凝胶图像光密度分析系统对PCR产物电泳条带进行灰度扫描，以INT和S的乘积代表信号强度，计算MMP9与βactin灰度值的比值作为MMP9mRNA的相对表达量.

统计学处理:采用SPSS13.0软件分析系统进行非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1MMP9的免疫组化测定MMP9在HSIL中的阳性率为4新晨