桂枝汤对脾虚大鼠NFAT mRNAIL4 mRNAIFNγ mRNA干预作用范文

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【摘要】目的：采用RTPCR方法来探讨桂枝汤对脾虚NFATmrna，IL4mRNA，IFNγmRNA的影响以及干预Th1/Th2细胞漂移的机制.方法：40只大鼠随机分为空白对照组(A组)、脾虚组(B组)、桂枝汤大剂量组(C组)和桂枝汤小剂量组(D组)等4组，每组10只；用规范的脾气虚证大鼠模型造模方法将B，C和D组大鼠造模，B，C和D组分别用蒸馏水、桂枝汤大剂量、桂枝汤小剂量灌胃，标本采集后用RTPCR检测NFATmRNA，IL4mRNA和IFNγmRNA表达水平.结果：脾虚组的NFATmRNA，IL4mRNA表达上调；而IFNγmRNA表达下调，经桂枝汤大、小剂量组治疗后，NFATmRNA，IL4mRNA表达下调，IFNγmRNA表达上调.结论：桂枝汤对Th1/Th2细胞漂移作用途径可能是通过下调NFATmRNA的表达，恢复了IFNγmRNA正常转录水平，进而下调IL4mRNA的表达，使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的平衡.

【关键词】桂枝汤；活化T细胞核因子；白细胞介素4；γ干扰素

0引言

现代医学表明，在生理条件下，Th1细胞和Th2细胞分泌的两类因子互相调整，相互制约，处于一种动态平衡状态.一旦两者平衡失调，细胞因子作用于细胞表面相应受体，活化信号转导因子(signaltransducerfactor,STF)，将刺激信号传至核内而发挥其基因转录的调节作用，使机体局部乃至全身发生病理反应［1］.我们通过观察脾虚证模型动物Th1细胞、Th2细胞中具有代表性的γ干扰素(interferonγ，IFNγ)、白介素4(interleuin4，IL4)以及T细胞核因子(nuclearfactorofactivatedTcells,NFAT)mRNA的表达以及桂枝汤对三者的影响，探讨脾虚证模型动物与Th1/Th2细胞漂移的关系以及桂枝汤对其的逆转作用.

1材料和方法

1.1材料SD大鼠40只，清洁级，雄性，体质量200~300g，由上海实验动物中心提供.在江西中医学院动物实验中心清结级25~27℃条件下饲养.SD大鼠在动物房适应性饲养1wk后，称质量并随机分为空白对照组（A组），脾虚模型组（B组），桂枝汤大剂量组（C组），桂枝汤小剂量组（D组），每组10只.桂枝汤中桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣购于江西中医学院附属医院，按《伤寒论》原方10∶10∶7∶10∶10（W/W）配比混合药物(大枣剖开)置于烧杯中.加入5倍蒸馏水冷浸60min，快速加热至沸腾，而后保持微沸状态15min，趁热抽滤，药渣中加入3倍蒸馏水，浸泡30min，快速加热至沸，微沸10min，趁热抽滤，弃药渣，合并滤液，水浴浓缩相当于生药1kg/L的滤液，4℃保存.主要试剂与仪器有卵清蛋白、刀豆蛋白A（均为Sigma公司），Trizol(GibcoBRL公司)，Rmasin,MMLV（Promega公司），Tag酶（上海生工），并由上海生工合成引物，DNAmark(北京鼎国生物试剂公司)，PCR仪（PE480美国PERKINELMER公司），紫外分光光度仪（DU530美国BECKMAN公司），EagleEyeII成像分析系统(美国).

1.2方法

1.2.1模型建立先按初步规范的脾气虚证大鼠模型造模方法建模［2］.造模30d后大鼠表现符合中医学中的脾虚症状.

1.2.2给药除A组10只大鼠不需造模外，B，C和D组共30只大鼠按文献［2］方法造模30d.A组大鼠胃饲蒸馏水2.5mL，2次/d，连续14d；成模后B组大鼠灌服蒸馏水2.5mL，2次/d，连续14d；成模后C组大鼠灌服桂枝汤滤液，约为6g/kg［3］，2次/d，连续喂药液14d；成模后D组大鼠灌服桂枝汤滤液，约为3g/kg，2次/d，连续喂药液14d(C，D两组给药剂量按人与动物间体表面积折算).

1.2.3细胞悬浊液的制备采用常规方法,大鼠拉颈处死,无菌条件下剪开腹腔取出脾脏研磨,在100目铜网上轻轻挤压，培养基上培育并制成细胞悬液,用低渗压除去红细胞,以Hanks液洗涤,配成1×1010/L及2×1010/L脾细胞悬液.滤过后将收集的脾细胞悬液加到淋巴细胞分离液中，吸出中间灰白色细胞层，用尼龙毛柱T细胞分离法分离T淋巴细胞［4］.

1.2.4增殖刺激重悬T淋巴细胞，调整浓度为1×109/L，用台盼蓝染色，活性细胞＞95%，置于24孔培养板中，每孔加细胞悬液1mL，各组内加入卵清蛋白至终浓度0.2g/L，刀豆蛋白A25mg/L，37℃50mL/LCO2孵箱中孵育24h.

1.2.5RTPCR（逆转录）将收集培养后的细胞调成细胞悬液，用Trzol提取总RNA，紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度，-70℃冻存备用.用2μL逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，-70℃冻存备用.用5μL逆转录产物进行PCR扩增反应，并以βactin为内对照.IL4，IFNγ和NFAT的引物参照报道［5-7］设计，βactin引物参照Genebank中cDNA序列，具体序列及扩增长度见表1.βactin反应条件：94℃30s变性，50℃30s退火，72℃3min延伸；PCR反应条件：94℃5min变性，然后35个循环的扩增，最后延伸72℃10min.IFNγ每一个循环包括94℃45s，56℃45s，72℃90s；IL4每一循环包括94℃45s，55℃45s，72℃90s，NFATc每一循环包括94℃1min，55℃1min，72℃2min.表1PCR所有引物及扩增长度

1.2.6PCR扩增反应半定量分析5μLPCR产物经15g/L琼脂糖电泳，溴化乙啶染色，能过图像分析软件读取目的电泳带A值，将目的条带与βactin条带的比值作为目的基因mRNA的表达量，目的基因mRNA的表达量=目的条带A值/βactin条带A值.

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统计学处理：计量资料以x±s表示，组间比较用SPSS软件包进行方差分析及SNKq检验.

2结果

实验各组的NFATmRNA，IL4mRNA，IFNγmRNA的影响(表2).B组的NFATmRNA，IL4mRNA表达上调（P<0.05）；而IFNγmRNA表达下调（P<0.05），经C组治疗后，NFATmRNA，IL4mRNA表达下调（P<0.05），IFNγmRNA表达上调（P<0.05），与正常组相比较，基本恢复了正常水平（P>0.05）.IFNγ，IL4，NFAT及βactin的扩增产物经15g/L琼脂糖电泳，所示条带分别为405,360,392和512bp，符合设计的片段（图1～3）.表2实验各组NFATmRNA,IL4mRNA及IFNγmRNA的表达

3讨论

1986年Mosman等［6］证实CD4+（Thelper,Th）可以发展成功能不同的Th1和Th2亚群，它们各自产生特征性细胞因子.Th1细胞主要分泌干扰素γ(interferonγ,IFNγ),IL2,IL12等多种Th1型细胞因子；Th2细胞分泌的IL4，IL5，IL10等多种Th2型细胞因子.Th1细胞和Th2细胞通过细胞因子的交互调节而互为调节细胞,从而形成复杂的细胞因子网络，例如由Th1细胞分泌的IFNγ是Th1细胞分化的重要的细胞因子，它可抑制Th2细胞的分化.IL4和IL10是Th2细胞分化的重要的细胞因子，可抑制Th1细胞的分化［1］.

活化T细胞核因子(nuclearfactorofactivatedTcells，NFAT)是一类与众多信号传导途径相联系，具有广泛生理功能的转录因子［8］.NFAT可以选择性诱导细胞因子和其他免疫调控基因的转录，从而在免疫应答过程中扮演着中心角色［9］.

“脾”的防卫功能与现代医学免疫功能有许多相似之处，脾与免疫功能之间的关系非常密切［10］.桂枝汤组方多以调补脾胃药为基础，桂枝汤以甘草、大枣、生姜三味药升腾脾胃清阳之气，培中土，滋化源，故可改善脾虚状况，增强人体免疫力.桂枝汤治疗前，脾虚组的NFATmRNA，IL4mRNA表达上调（P<0.05）；而IFNγmRNA表达下调（P<0.05），说明了脾虚大鼠Th1/Th2细胞失去了平衡，Th细胞向Th2细胞分化，Th细胞向Th1分化途径受到抑制，此时，Th2应答占优势.其机制可能是脾虚大鼠调节因子NFAT表达上调，其通过信号传导途径阻断诱导IFNγ的表达，解除了对IL4表达的竞争抑制作用，从而使IFNγ的表达下调，IL4的表达上调；经桂枝汤大小剂量组治疗后，NFATmRNA，IL4mRNA表达下调（P<0.05），IFNγmRNA表达上调（P<0.05），与正常组相比较，基本恢复了正常水平（P>0.05），说明了桂枝汤可以诱发Th1优势应答，抑制Th2优势应答，最终使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的动态平衡.

【参考文献】

［1］秦卫兵.Th1和Th2细胞在体内的分化［J］.国外医学免疫分册，2002，25（1）：42-46.

［2］周永生,樊雅莉,陈小野,等.脾气虚证动物模型规范化的初步研究-部分免疫功能方面［J］.实验动物科学与管理,2003,20（2）：1-5.

［3］窦如海.实验动物和动物实验技术［M］.济南:山东科学技术出版社，2006：126.

［4］王兰兰.临床免疫学和免疫检验［M］.北京:人民卫生出版社，2004：183.

［5］AdachiS,AmasakiY,MiyatakeAN,etal.SuccessiveexpressionandactivationofNFATfamilymembersduringthymocytedifferentiation［J］.BiolChem,2000,275(19):14708.

［6］KiddP.Th1/Th2balance:Thehypothesis,itslimitations,andimplicationsforhealthanddiseases［J］.AlternMedRev,2003,8:223-246.

［7］魏海明，刘杰，田志刚.检测Th1/Th2亚群的临床意义［J］.中华检验医学杂志，1998，21(1)：56.

［8］ShewJP.NFATisresponsiblefortissuespecificexpression［J］.Science,1988,241:202.

［9］柴蔚然．活化T细胞核因子的研究进展［J］.中国男科学杂志,2006,20(6):69-72.

［10］刘永琦.脾虚证的免疫学本质及中医药防治脾虚的免疫机制研究［J］.中国中医药信息杂志，2002,9(10):5.新晨