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作者：刘仁旺，滕增辉，张邦乐，宦梦蕾，杨茜，周四元
【摘要】目的：建立同时测定白藜芦醇和白藜芦醇苷含量的高效液相色谱法，优化虎杖中有效成分白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取工艺.方法：采用梯度法建立同时测定白藜芦醇和白藜芦醇苷的高效液相色谱方法，以白藜芦醇和白藜芦醇苷总量为考察指标，设计以乙醇浓度、溶剂倍数及醇提温度等为影响因素的4因素3水平的正交实验，确定虎杖中上述有效成分的最佳提取工艺.结果：在选定的色谱条件下，虎杖提取物中白藜芦醇和白藜芦醇苷可以达到基线分离.检测白藜芦醇及其苷的线性回归方程分别为Y=0.0006X-0.183（r=0.9996），Y=0.0011X-0.478（r=0.9993）；线性范围分别为0.48～38.4mg/L和0.47～38.2mg/L.日内、日间精密度都小于5%，回收率在90%～105%之间，样品分析时间小于7min.虎杖中有效成分白藜芦醇和白藜芦醇苷的最佳提取工艺为乙醇浓度80％，溶剂倍数15，醇提温度70℃，提取时间2h.结论：建立了准确可靠、分析速度快可同时检测虎杖提取物中白藜芦醇和白藜芦醇苷的分析方法，优化了质量可控的提取工艺.
【关键词】虎杖；白藜芦醇；白藜芦醇苷；高效液相色谱
0引言
虎杖(polygonumcuspidtumsieb)为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖的干燥根茎，主要含有蒽醌类、二苯乙烯类、水溶性多糖和鞣质等成份［1］.白藜芦醇(3,4′,5三羟基二苯乙烯)和白黎芦醇苷是虎杖的主要功效成分，具有保护心脏、抗血栓、降血脂［2］等药理作用.白藜芦醇及白藜芦醇苷的药理作用相近，但其极性却相差较大.本研究探讨一种兼顾白藜芦醇及白藜芦醇苷的提取工艺，并建立同时测定白藜芦醇和白藜芦醇苷含量的高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC），旨在为虎杖的药理作用研究以及科学合理利用提供试验依据.
1材料和方法
1.1材料白藜芦醇苷和白藜芦醇的对照品均由中国药品生物制品检定所提供；虎杖的干药材购自西安市胡家庙药材市场.2695型高效液相色谱仪，2996型二极管阵列检测器(美国Waters公司)；调温式电热套(北京科伟永兴仪器有限公司)；色谱纯乙腈，甲醇(美国TEDIA公司)，其他试剂均为国产分析纯.
1.2方法
1.2.1工作曲线的建立分别精密称取白藜芦醇苷及白藜芦醇对照品10mg置100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成100mg/L的白藜芦醇苷和白藜芦醇对照品混合储备液，备用.分别精密吸取两对照品储备溶液0.05，0.2，1，2,4mL配制成浓度为0.5，2，10，20,40mg/L的混合对照品的标准溶液，依次取20μL进样.色谱条件为：色谱分析柱：C18(250mm×4.6mm，5μm，美国Phenomenix公司)；流动相：乙腈和水，梯度洗脱如表1所示.检测波长：315nm；流速：1mL/min；柱温为30℃.按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品浓度值为横坐标绘制工作曲线，应用Excel软件采用最小二乘法计算回归方程.
表1HPLC流动相梯度表
时间(min)〖〗乙腈(％)〖〗水(％)〖〗流速(mL/min)〖〗梯度类型0〖〗28〖〗72〖〗1.0〖〗67〖〗72〖〗28〖〗1.0〖〗69〖〗72〖〗28〖〗1.0〖〗620〖〗28〖〗72〖〗1.0〖〗1
1.2.2精密度和准确度测定分别精密吸取白藜芦醇及白藜芦醇苷储备液0.1，0.5，3mL，配成浓度为1，5，30mg/L混合对照品的标准溶液.每个浓度6个样本，连续测定3d，与标准曲线的建立同时进行.代入当日的回归方程计算标准溶液的浓度，将结果进行方差分析，即得到本方法的精密度.将1，5，30mg/L三个浓度标准溶液的白藜芦醇和白藜芦醇苷的测定浓度值与标准溶液的标示浓度相比，即得方法回收率.
1.2.3虎杖有效成分提取工艺的优化在本生产工艺研究中，根据药物有效成分、药理作用及理化性质特点，选择醇提法进行正交试验，以提取时间（A1,2,3h），乙醇浓度（B70%,80%,90%），醇提温度（C50,60,70℃）和溶剂倍数(D10,15,20)作为考察因素，选择3个水平，综合评价提取工艺,选用L9(34)正交表，安排正交实验.
取虎杖10g，按L9(34)正交表设计的顺序，各加入设定的乙醇量，加热煎煮规定时间和次数，滤过，合并滤液，将滤液用甲醇稀释10倍后取样20μL，用HPLC法测定白藜芦醇及白藜芦醇苷的峰面积，带入回归方程中，计算出白藜芦醇和白藜芦醇苷的总量.
2结果
2.1HPLC检测方法的特异性在本实验选定的洗脱及检测条件下，白藜芦醇和白藜芦醇苷的保留时间分别为6.8min和4.7min.白藜芦醇及白藜芦醇苷峰和杂质峰能实现基线分离，样品峰的测定不受杂质峰的干扰（图1）.
2.2白藜芦醇苷及白藜芦醇标准曲线回归方程以白藜芦醇和白藜芦醇苷的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线.应用Excel软件采用最小二乘法得到白藜芦醇和白藜芦醇苷的工作曲线回归方程：Y=0.0006X-0.183（r=0.9996），Y=0.0011X-0.478（r=0.9993）.结果表明，白藜芦醇及其苷分别在0.48～38.4mg/L和0.47～38.2mg/L范围内呈良好的线性关系.
2.3精密度和准确度测定1，5，30mg/L浓度的白藜芦醇苷的日内精密度分别为4.0%，2.6%和2.0%；日间精密度分别为4
.2%，4.3%和2.6%；方法回收率分别为（101±3.4）%，（94±2.3）%和（95±1.3）%.白藜芦醇的日内精密度分别为5.0%,3.0%和2.0%；日间精密度分别为4.8%，3.9%和1.1%；方法回收率分别为（96±5.1）%，（95±2.6）%和（95±1.6）%.结果显示本方法准确、重复性好.
2.4虎杖有效成分提取工艺的优化将测得值进行方差分析（表2），因素B差异具有统计学意义（P<0.01).由表3中进行直观分析可知，A因素中各水平试验结果的和比较为：K2>K1>K3，平均含量以第2水平为高；B因素中各水平试验结果的和比较为：K1>K2>K3，平均含量以第1水平为高；C因素中各水平试验结果的和比较为：K3>K1>K2，平均含量以第3水平为高；D因素中各水平试验结果的和比较为：K2>K1>K3，平均含量以第2水平为高.选择最佳的提取工艺为提取时间2h，乙醇浓度为70%，醇提温度为70℃，溶剂倍数15.表2白藜芦醇及其苷含量方差分析结果
3讨论
近年来有较多关于虎杖有效成分白藜芦醇和白藜芦醇苷提取及含量研究的报道，多采用单因素、正交试验及大孔吸附树脂吸附法研究白藜芦醇的提取条件［3-4］；正交试验法及乙醇回流法优选白藜芦醇提取工艺［5-7］；以白藜芦醇苷为指标，研究虎杖的提取条件等［8］，这些方法均以白藜芦醇或白藜芦醇苷单个成分为指标.由于虎杖中的活性成分白藜芦醇和白藜芦醇苷都具有保护心脏、抗血栓、降血脂等药理作用，因此我们在本实验中测定样品中的白藜芦醇和白藜芦醇苷的总量并以此作为评价指标是合理可行的.我们的实验结果表明，正交试验及方差分析结果虎杖醇提取工艺最大影响因素为乙醇浓度B，其次为溶剂倍数D，再次为醇提温度C和提取时间A.最佳工艺乙醇浓度为80％，溶剂倍数为15，醇提温度为70℃，提取时间为2h.
目前对虎杖中白藜芦醇或白藜芦醇苷的测定方法很多［9-10］，但是同时对白藜芦醇及其苷测定的报道较少［11］，主要存在诸如样品处理方法复杂、分析时间较长等问题.本研究建立的同时测定虎杖中白藜芦醇及其苷的方法选用315nm作为检测波长，使检测方法获得了较高的灵敏度.采用乙腈和水作为流动相，白藜芦醇和白藜芦醇苷与其他化合物达到基线分离.白藜芦醇和白藜芦醇苷分别在6.8min和4.7min出峰，快速有效地实现了分离检测.
综上所述，本研究建立的虎杖提取液中白藜芦醇和白藜芦醇苷的HPLC检测方法具有灵敏、准确、迅速和工艺稳定、经济等特点，可用于虎杖提取液中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量测定以及有效成分提取的质量控制.
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