细菌整合子进展范文

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【摘要】整合子是近年来在细菌中发现的一种可移动性基因元件，通过位点特异性重组捕获并表达外源性基因盒，是导致耐药基因在细菌间水平播散的重要原因。本文就整合子的发现、结构、分类；基因盒的结构、来源；整合子对基因盒的捕获、剪切与表达；整合子与细菌耐药性的关系以及整合子的检测等方面进行综述。

【关键词】整合子；基因盒；耐药基因；耐药性

ABSTRACTIntegronsaremobileDNAelementsthatwerefoundinbacteriarencently.Bycapturingexogenousgenecassettesthroughsitespecificrecombinationandensuringtheexpressionofgenescontainedingenecassettes,integronsplayedimportantrolesinthehorizontaldisseminationofdrugresistancegenesinbacteria.Thispaperrevieweddiscovery,structureandclassificationofintegrons,structureandoriginsofgenecassettes,thecapture,deletionandexpressionofgenecassettesbyintegrons,therelationshipbetweenintegronsanddrugresistance,andthedetectionofintegrons.

KEYWORDSIntegron;Genecassette;Drugresistancegene;Drugresistance

随着抗生素的广泛使用，细菌在抗生素的选择压力下耐药菌株不断产生，其中细菌通过基因的水平转移，获得外源性耐药基因是加快临床耐药菌株产生的重要原因。与细菌耐药基因水平转移密切相关的遗传结构有质粒、转座子、整合型噬菌体以及近年来在细菌中发现的一种天然的克隆表达系统［1］——整合子(integron)。整合子通过位点特异性重组捕获外源基因盒(genecassettes)并使之表达，同时整合子可位于质粒上，或自身作为转座子的一个组成部分而参与转移［2］，使耐药基因发生播散。整合子因其在细菌耐药基因水平转移中的重要作用而受到研究者的关注。

1整合子的发现

19世纪80年代研究者在对耐药质粒和转座子进行系统研究时，发现在R100(Tn21)、R46(IncN)、R388(IncW)、pLMO20、pSa等不同来源相互独立的质粒或转座子上，不同耐药基因两侧的序列具有相似的限制性酶切图谱，推测其可能是一个移动性基因元件［3～5］。1989年Stokes等［5］通过比对Tn21的aadA和R46的oxa2aadA两侧的序列并结合限制性酶切图谱，初步确定了3′保守末端和5′保守末端的范围。由于保守末端的外缘不具有反向末端重复序列、正向末端重复序列或靶位点重复序列等转座子的结构特点，认为其是一种新的移动性基因元件并建议将其命名为“DNA整合元件”(DNAintegrationelements)或简称为“整合子”。

2整合子的结构和分类

2.1整合子的结构

整合子的结构如图1所示，由3个部分组成：5′保守末端(5′conservedsegment,5′CS)、3′保守末端(3′conservedsegment,3′CS)和两者之间的可变区(variableregion)。5′CS是整合子的基本结构，包括编码整合酶(integrase,IntI)的基因(intI)、整合子重组位点attI和整合子可变区启动子(Pant)［6］。IntI属于酪氨酸整合酶家族，催化基因盒在整合子重组位点attI和基因盒重组位点attC之间的整合和剪切。整合酶基因带有自己的启动子Pint。attI位于整合酶基因的上游，是外源基因盒整合到整合子上的位点。启动子Pant指导下游可变区中自身不带有启动子的基因盒中基因的表达。启动子Pant的方向与Pint的方向相反。可变区带有不同数量和功能的基因盒，但可变区并不是整合子的基本结构，有的整合子在5′CS和3′CS之间没有基因盒插入［7］。3′CS因整合子的种类不同而异。

2.2整合子的分类

整合子常根据intI基因DNA序列的不同进行分类，研究较多的主要有以下4类：

第一类整合子最常见，从临床菌株中发现的整合子大多属于此类。其整合酶IntI1含有337个氨基酸。5′CS有编码IntI1的基因intI1、重组位点attI1和启动子Pant。其中Pant位于IntI1的编码框内，有的整合子还有启动子P2［1］。大多数第一类整合子的3′CS包括3个开放读码框(ORF)：磺胺耐药基因(sul1)，季铵盐化合物及溴乙锭的耐受基因(qacE△1)及功能不明的ORF5［8］。可变区带有不同数量的基因盒，大部分是编码各种抗生素抗性的耐药基因盒。

第二类整合子存在于Tn7或它的衍生物上，其整合酶基因intI2被一个终止密码子中断，是缺陷的整合酶基因，它的产物IntI2约有318个氨基酸，与IntI1有40%的同源性［9，10］。IntI2不能催化基因盒的整合与剪切。目前仅发现核苷转移酶基因aadAla、甲氧苄啶耐药基因dhfr及链丝霉素耐药基因sat位于该类整合子上。现已在沙门菌、志贺菌和不动杆菌中发现第二类整合子。

第三类整合子最初由Arakawa在耐碳青霉烯类抗生素的粘质沙雷菌的质粒上发现的，其整合酶IntI3有346个氨基酸，与IntI1有60.9%的同源性。目前仅在粘质沙雷菌、肺炎克雷伯菌等细菌中分离出第三类整合子，只发现碳青霉烯耐药基因位于该整合子上［11，12］。

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nbsp;以上三类整合子与细菌耐药基因的播散密切相关，常被合称为耐药整合子(resistanceintegron，RI)。

第四类整合子是Mazel等［13］在霍乱弧菌基因组中首次发现，其整合酶IntI4有320个氨基酸，与前三类整合子的整合酶有45%～50%的同源性。此类整合子的可变区可带有上百个基因盒，故又称为超级整合子(superintegron，SI)。SI基因盒中的基因除了与细菌耐药有关外，还与细菌的代谢和毒力有关［14］。除霍乱弧菌外,在梅氏弧菌、费氏弧菌、拟态弧菌等细菌的染色体基因组中也发现了超级整合子。

此外，可根据整合子是否具有可移动性将整合子分为移动性整合子(mobileintegrons)和超级整合子［14］。移动性整合子与移动性基因元件结合在一起，可伴随移动性基因元件一起移动，与细菌耐药基因的播散密切相关。超级整合子位于染色体上并成为染色体的一部分而不能自由移动。

3基因盒的结构和来源

3.1基因盒的结构

基因盒是一种可移动性基因元件，可以环状的形式独立存在，也可整合入整合子中而成为整合子结构的一部分［1］。基因盒的结构如图2，由单一基因(结构基因)和一个整合位点attC组成。由于第一个被发现的attC长度为59bp，所以attC又称为59碱基元件(59baseelements，59be)。第四类整合子的attC位点称为霍乱弧菌重复序列(Vibriocholerarepetitivesequences，VCRs)。attC位点的长度为57～141bp，是一个不完全的反向重复序列，并含有可被整合酶识别的特异性整合位点。attC位点的两端分别为一7碱基对的保守片段，分别称为核心位点(coresite，CS)和反向核心位点(inversecoresite，ICS)。核心位点的共同序列为GTTRRRY(R：嘌吟，Y：嘧啶)，核心位点位于attC位点的右侧，互补的反向核心位点序列为RYYYAAC，位于attC位点的左侧。当游离的环状基

A：环状基因盒；B：线性基因盒

图2基因盒的结构(重组位点用垂直箭头标出)

因盒在整合酶的催化下与整合子的attI发生位点特异性重组时，重组交换发生在attC核心位点GTT中的G和第一个T之间，核心位点GTT及G左侧碱基突变对整合频率影响较大［15］。

3.2基因盒的来源

基因盒的起源至今还不清楚。由于大多数基因盒中的结构基因都没有自己的启动子，同时attC的不完全反向重复序列可形成茎环结构，类似于不依赖ρ因子的转录终止结构［16］，推测基因盒是由mRNA通过逆转录而来。重组位点可能是原始转录的mRNA一部分，也可能是在mRNA逆转录为DNA后加的序列［17］。此种假说还有待于从细菌中分离出适当的逆转录酶来加以确证。

由于(1)SI中基因盒的重复序列VCRs具有种属特异性，而RI中基因盒的attC位点高度可变；(2)RI中一些基因盒的序列与SI中基因盒序列完全一致；(3)SI中的基因盒可被IntI1识别［13］，研究者推测RI中基因盒可能来源于SI。

此外，Stokes等［18］设计针对59be保守序列的引物对自然环境中的样品进行PCR扩增，在来自不同地点的样品中扩增出不同的基因盒，许多功能未知。提示自然环境中的微生物可能为整合子中基因盒的来源提供庞大的储备库。

4整合子对基因盒的捕获、剪切与表达

4.1整合子对基因盒的捕获与剪切

游离的的环状基因盒在整合酶的催化下通过位点特异性重组整合于整合子上，成为整合子的一部分，同时位于整合子上的基因盒也可在整合酶的催化下形成环状基因盒而从整合子中剪切下来［7，19，20］，如图3。

重组位点用垂直箭头标出；来源于环状基因盒1的核心位点用大写

字母表示；来源于环状基因盒2的核心位点用小写字母表示

图3整合子对基因盒的捕获与剪切第一类整合子对基因盒的捕获与剪切研究较多。整合酶IntI1中4个保守氨基酸分别是第146位和第280位的两个精氨酸、第277位的组氨酸和第312位的酪氨酸，与整合酶的活性密切相关［21，22］。IntI1主要识别两个位点：整合子上的attI1和基因盒上的attC。

attI1位点比较保守，其长度至少40bp，全功能需70bp，在5′CS内缘有一个核心位点GTTRRRY而无反向核心位点。重组位点也位于核心位点GTT中的G和第一个T之间［1，23］。Collis等［24］发现IntI1主要与双链attI1结合，重组位点左侧第24～37bp的14bp是IntI1的强结合位点，此区域在位点特异性重组中具有重要作用。一个不完全正向重复序列位于重组位点左侧第41～55bp的区域，是IntI1的弱结合位点。Gravel等［25］发现attI1位点上有4个IntI1结合结构域，其中3个结合结构域具有GTTA保守序列。

attC位点序列和长度多变，包含两对不完全反向重复序列和中间的回文区，单链可形成茎环结构。attC含有4个IntI1结合结构域，包括核心位点、反向核心位点和两者之间的一对不完全反向重复序列。IntI1与attC单链(bottom链)结合能力强，提示IntI1介导的重组仅有一条链交换发生［14，26，27］。

整合酶介导的基因盒的整合主要发生在attC和attI之间，称为特异性整合。同时整合酶也可介导attC和attI以外的第二位点的整合，称为非特异性整合，虽然整合频率较低，但因其周围只有一个重组位点而不能被切除，其在细菌基因组、质粒、转座子进化中起重要作用［28］。整合酶介导的基因盒的剪切主要发生在两个attC位点之间。

目前仅知道整合酶在整合子对基因盒的整合与剪切起重要作用，由于体外整合和剪切反应体系尚未成功建立，是否有其它因子如辅助蛋白等参与还有待于进一步研究。

4.2基因盒的表达

大多数基因盒没有自己的启动子，基因盒总是以5′→3′的方向整合入整合子，使其可以在上游整合子可变区启动子Pant的作用下得以表达，有的整合子在Pant下游还有启动子P2［1］。目前研究的4种Pant和2种P2的结构和相对启动强度见表1［8］。

影响基因盒表达的因素主要有：(1)基因盒上游Pant或P2的强弱；(2)基因盒距离启动子的远近，处于基因盒队列下游的基因盒表达相对较弱，因其上游基因盒的attC具有类似于不依赖ρ因子的转录终止结构［16］；(3)对于非特异性整合的基因盒是否表达要看其上游是否有适当的启动子存在；(4)位于质粒上的表1整合子启动子Pant和P2的结构和相对启动强度

启动子35区10区间隔(碱基数)强度PantTTGACATAAACT17强TGGACATAAGCT17弱TGGACATAAACT17混合1TTGACATAAGCT17混合2P2TTGTTATACAGT14无活性TTGTTATACAGT17未知

整合子中基因盒的表达水平还与质粒的拷贝数有关；(5)少数基因盒如cmlA带有自己的启动子和弱化信号［1］，其表达不受上游启动子和基因盒的影响。

此外，第一类整合子Pant位于Pint的下游，转录方向相对，两者的转录产物有一段互补序列，可能对基因盒和整合酶之间的表达起着调控作用。

5整合子与细菌耐药性的关系

目前在第一类整合子中发现的基因盒已超过80种［14］，大部分是耐药基因盒，编码产物可赋予细菌对几乎全部临床常用药物产生耐药性。一个整合子可带有多个耐药基因盒，使细菌对多种药物产生耐药性。

整合子是一个可移动性基因元件，一方面整合子可通过对基因盒的捕获和剪切使基因盒发生移动，另一方面整合子自身可位于转座子、质粒等可移动基因元件上使整合子发生移动，使耐药基因发生播散。

国内外大量文献报道整合子与细菌的耐药性密切相关。Grape等［29］报道105株尿液标本中分离的革兰阴性细菌中59株(56.2%)整合子阳性，整合子阳性菌株平均对4.2种药物耐药，而整合子阴性菌株平均仅对1.9种药物耐药。Gombac等［30］检测发现过去11年来分离自意大利6所不同医院的36株鲍曼不动杆菌中第一类整合子阳性的有16株(44.4%)，其中13株具有相同的基因盒排列顺序，表明整个整合子结构可发生水平转移。Su等［31］对广州市过去6年中分离的111株大肠杆菌临床菌株进行整合子检测，发现95株(85.7%)第一类整合子阳性，4株(3.7%)第二类整合子阳性，并在不同基因型的菌株中发现相同的基因盒dfrA17aadA5，表明基因盒可通过水平转移在临床菌株中播散。近年来在革兰阳性细菌也检测到整合子［8］，Shi等［32］报道46株分离自临床标本的革兰阳性细菌中第一类整合子的阳性率为100%，表明第一类整合子也广泛分布于革兰阳性细菌中。在没有抗生素压力的自然环境中，整合子的检出率很低，仅为3.6%，并且一半以上的整合子不携带耐药基因盒［33］。提示整合子捕获耐药基因盒与抗生素的选择压力有关。

6整合子的检测

目前整合子的检测主要运用分子生物学的方法。由于第

一、

二、三类整合子与细菌耐药密切相关，临床菌株中整合子的检测主要针对此三类整合子。

5′CS的检测设计针对整合酶基因保守序列的引物进行PCR扩增整合酶基因片断来对细菌进行整合子的筛查。除了普通PCR外，也有用多重PCR［31，34，35］设计三对引物同时扩增三种整合酶基因片断，在筛查整合子的同时可对整合子进行分类。还可设计针对三种整合酶基因共同保守序列的简并引物进行PCR，扩增产物再用适当的限制性内切酶酶切后根据酶切图谱进行分类［36］。也可用荧光定量PCR进行整合酶基因的快速检测［37］。

3′CS的检测由于大多数第一类整合子的3′CS有sul1基因，可用引物扩增sul1基因来进行第一类整合子的筛查。由于有的第一类整合子没有3′CS，所以此种方法检测的阳性率要低于针对整合酶基因的PCR。

基因盒的检测一般先用针对5′CS和3′CS的引物扩增整合子的可变区，再进行测序来确定基因盒的种类和排列顺序。对于在大量临床菌株中进行整合子的分子流行病学调查时，可选择有代表性的PCR产物片断进行测序，根据测序结果选择适当的限制性内切酶对相同大小的PCR产物片断进行酶切，具有相同酶切图谱的片断可初步认为序列相同［38］。由于可变区片断大小未知，有的可变区长度大于PCR扩增能力，因此易出现假阴性。也可直接扩增相应的基因盒或用针对相应基因盒的探针与细菌基因组DNA酶切片断进行Southern杂交，来检测相应的基因盒。

另外可用特异性探针分别与细菌基因组DNA酶切片断和质粒DNA进行Southern杂交来进行整合子的定位［39］。将整合子可变区或基因盒克隆至适当的载体上来对基因盒的功能进行研究等。

7结语

早在1888年临床分离的菌株中就已存在SI［13］，表明整合子是一个古老的结构，是细菌进化的产物。当外界环境发生变化，不适应细菌生存时，细菌通过整合酶催化的位点特异性重组，捕获外源基因盒或使自身的基因盒发生剪切与重排，同时使下游基因盒得以表达来适应外界环境的变化。整合子的发现一方面为细菌耐药性的控制带来困难，另一方面也为细菌耐药机制的研究提供了新的思路。随着研究的深入，许多方面值得进一步探讨：①整合子整合和剪切基因盒的确切机制有待于体外整合和剪切反应体系的建立；②整合子中基因盒的起源；③整合酶表达和基因盒基因表达之间的关系；④整合子在细菌进化中的作用；⑤快速简便的整合子检测方法的建立等。

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