盐霉素高产菌推理选育范文

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【摘要】根据盐霉素生物合成途径对其产生菌进行了推理选育。在常规诱变基础上选用丁酸作为筛选剂检出所需要的突变株，成功获得三株高产菌株3233#、3244#和3250#，其效价比出发菌株F21#分别提高了34%、44.9%和39%。

【关键词】盐霉素；诱变剂；筛选剂；推理选育

Rationalscreeningforhighsalinomycinproducingstrain

ChuXiaohe1,2,WangPu1andSongYouli2

(1CollegeofPharmaceuticalScience,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310032;

2ZhejiangShenghuaBiokBiologyCo.,Ltd.,Huzhou313220)

ABSTRACTAsalinomycinproducingstrain,namely#F21,wastreatedandmutatedusingphysicalfactorofUVandchemicalfactorofethylmethanesulfonate(EMS)respectivelywithreferencetotheinferentialscreeningtheory.Thepositivemutantswereobtainedfromtheplateswithbutyricacidforscreening.Threemostsbrandproductivestrainsof#3233,#3244and#3250werevalidatedin30m3fermentor.Theresultsshowedthatthetitresofmutant#3233,#3244and#3250were34%,44.9%and39%respectively,andhigherthanthatoftheoriginalstrain#F21.

KEYWORDSSalinomycin;Mutagen;Screeningreagent;Rationalscreening

盐霉素(salinomycin)是由白色链霉菌(Streptomycesalbus)发酵产生［1］。日本早已证实盐霉素有很广的抗球虫谱，对鸡的柔嫩、毒害、堆型、脆弱、巨型和哈氏球虫均有效，50mg/kg就有明显抑制作用［2，3］。此外，盐霉素对大多数革兰阳性菌有抑制作用，对梭菌等革兰阳性厌氧菌也有较强的抑制作用［4］。盐霉素以其高效、低残留、低耐药性在世界几十个国家获得许可使用［5］。目前关于盐霉素的研究主要集中在其应用研究方面，对其菌种及工艺研究的报道较少。盐霉素为典型的含聚醚链(polyetherchain)结构的抗生素，通过乙酸和丙二酸的缩合进行生物合成［6，7］。盐霉素为构成聚醚链的丙二酸被甲基和乙基高度取代的线性脂族分子，沿着分子链有一系列的四氢吡喃环和四氢呋喃环［8］。研究表明，盐霉素生物合成过程和其他聚醚系抗生物质相同，即C2C4的脂肪酸直接进入盐霉素合成，为6mol乙酸、6mol丙酸和3mol丁酸缩合而成(图1)，其中丁酸为合成启动子［9］。本文根据盐霉素分子结构和生物合成途径，运用推理选育理论，通过选用丁酸R=CH3，甲基盐霉素；R=H，盐霉素作为筛选剂进行高产菌选育，为进一步工业化生产水平奠定基础。

1材料与方法

1.1出发菌株盐霉素产生菌F21#由浙江升华拜克生物股份有限公司科研中心提供。

1.2培养基

斜面培养基(g/L)甘油18，酵母浸粉2.3，氯化钠1.9，硝酸钠1.1，琼脂22；pH自然。

摇瓶种子培养基(g/L)蔗糖9.7，玉米浆25，磷酸二氢钾2.0，豆油3.4，轻质碳酸钙1.1，酵母膏粉0.2；pH6.7～6.8。

摇瓶发酵培养基(g/L)葡萄糖5.0，棉籽饼粉5.0，黄豆粉5.0，酒石酸铵5.0，轻质碳酸钙5.0，氯化钾2.0，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁1.0，氯化钠0.1，豆油140；pH7.2。

种子罐培养基(g/L)蔗糖15.0，棉籽饼粉8.0，黄豆粉7.0，酒石酸铵5.0，轻质碳酸钙5.0，氯化钾2.0，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁1.0，氯化钠0.3，豆油210；pH7.2。

发酵培养基(g/L)葡萄糖25.0，棉籽饼粉15.0，黄豆粉15.0，酒石酸铵5.0，轻质碳酸钙6.5，氯化钾2.0，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁1.0，氯化钠0.3，豆油240；pH7.2。

1.3实验方法

(1)紫外线(UV)诱变刮取适量白色链霉菌的孢子于生理盐水中，振荡、打散孢子，经过滤制成单孢子悬液，取6～8ml单孢子悬浮液放入灭菌的9cm培养皿内，紫外灯下边搅拌边照射。紫外灯功率15W，照射时间分别为0、10、20、30和40s，照射距离为30cm。

(2)甲基磺酸乙酯(EMS)诱变用pH7.2磷酸缓冲液制成孢子悬浮液，吸取8ml孢子悬浮液放入带盖易密封小瓶中待用。用吸球及移液管吸取0.5ml的10mol/LEMS原液放入10mlpH7.2的磷酸缓冲液中制成0.5mol/LEMS溶液，再从0.5mol/LEMS溶液中吸取2ml放入盛放8ml孢子悬浮液带盖小瓶中，密封，置30℃培养箱中，每隔3mi

n振荡1次。分别取不同时间的处理液，稀释，涂布双碟，计算死亡率、变异率(甲基磺酸乙酯的诱变效果与溶液质量有关，而甲基磺酸乙酯不稳定，易发生水解作用而生成有毒而无诱变作用的化学物质，因此，其溶液需现配现用)。

(3)筛选方法经紫外或EMS诱变处理后的孢子悬液经稀释后涂布于含一定浓度丁酸的平板中进行分离，再挑取单菌落制作小斜面，摇瓶培养验证效价。

(4)效价测定采用化学法［10］和高效液相色谱法。

在本试验范围内，经数据分析，高效液相色谱法(Y)与化学测定法(X)大致量的关系为：

Y=1.1074X-9.005(R2=0.9718)

(5)发酵及分析采用两级发酵。种子培养条件33℃，230r/min，培养28h左右，30吨大罐放大三罐批，接种量10%，在33℃，230r/min发酵113～116h。实验结果取3个重复的平均值。发酵液分析采用高效液相色谱分析［11］。

2结果与讨论

2.1盐霉素产生菌选育系谱

以F21#为出发菌株，经2轮紫外诱变加丁酸筛选得到221#菌株，221#再经EMS诱变和丁酸筛选得到3株高产菌株3233#、3244#和3250#。经此过程处理后筛选得到的突变菌株221#、3233#、3244#和3250#即可进行发酵产量试验。

2.2紫外线与EMS对盐霉素菌株的诱变效应

在采用丁酸作为筛选剂进行推理选育前，首先考察常规诱变即紫外线EMS对菌株的效应。试验结果表明，盐霉素菌株经紫外照射时间20s后存活率在10%以下，照射40s致死率为97.5%。EMS单独处理盐霉素菌株18s致死率达98%。在同一剂量的情况下，EMS对盐霉素产生菌的诱变发生正变率大大高于负变率，但随着EMS剂量提高，盐霉素产生菌正变率也呈下降趋势，故本实验中EMS使用的剂量为1%。

2.3丁酸作为盐霉素筛选剂的推理选育［12］

(1)UV诱变后丁酸筛选剂用量确定试验在分析盐霉素菌株代谢途径的基础上，以推理选育为基本理论，利用自然选育为对照，分别选取UV+丁酸0.4%、UV+丁酸0.6%、UV+丁酸0.8%对出发菌株进行选育，各挑取10个菌落进行摇瓶实验(表1)，结果显示，以丁酸作为筛选剂可以显著提高盐霉素效价，较自然选育结果分别提高了17%、34%和23%，故UV+丁酸0.6%为最佳剂量。我们在此剂量上选育出突变菌株221#进行下一步实验。

(2)EMS+丁酸筛选剂试验在选育出菌株221#后，同样以自然选育为对照，在诱变剂EMS剂量1.0%条件下，分别采用含丁酸0.2%、0.4%和表1UV+丁酸筛选剂用量试验0.6%进行选育，结果见表2。从结果可以看出，以EMS+丁酸0.4%效价为最高45600μg/ml，而丁酸剂量大于0.4%时发酵效价有下降的趋势，但丁酸剂量为0.2%时效价不超过40000μg/ml，推测EMS和丁酸有一定的协同效应，具体协同结果还需要进一步研究。经此轮选育后，以自然选育为对照，同样取平均值，结果显示分别提高了23.4%、41.1%和25.8%。经实验证明，选用EMS+丁酸0.4%为最佳诱变剂量，在此基础上选育出了高产菌株3233#、3244#和3250#。

(3)丁酸作为盐霉素筛选剂的推理选育要选育高产菌株，除诱变剂作用外，还与筛选剂有关。本文根据盐霉素的生物合成途径的特点，选用丁酸作为筛选剂进行试验。丁酸既是盐霉素分子结构组成单元，也是其生物合成途径中的小分子前体物质，同时又可作为盐霉素发酵的有效碳源，可提高盐霉素菌株发酵效价。丁酸作为启动子还是盐霉素合成不可缺少的组分，试验结果表明，在含有丁酸作为筛选剂的平板上生长的菌株比在不含任何筛选剂的平板上生长的菌株，其发酵效价普遍有较大提高，因此选用丁酸作为盐霉素高表2EMS+丁酸筛选剂用量试验产菌株的筛选剂是合理的。

2.4发酵及其产物分析

经过推理选育的菌株进行发酵产量试验，我们采用221#菌株在30吨大罐上试产(三批)，221#菌株比出发菌株F21有较大的提高，与同期生产罐平均效价相比，效价提高了10%以上。同时，经过出发菌株F21与最终筛选的菌株3233#、3244#和3250#发酵产量进行大批量生产比较试验，F21菌株产量为32000μg/ml，而筛选后的菌株3233#效价为42940μg/ml，3244#为46360μg/ml，3250#为44460μg/ml，推理筛选的高产菌株分别比出发菌株F21#分别提高了34%、44.9%和39%。进一步对发酵液进行高效液相色谱分析(图略)，结果显示菌株3233#、3244#和3250#与出发菌株F21#发酵液相同，且峰面积比例均在92.95%～93.64%之间，成分比例非常接近，说明盐霉素组分未发生变化，进一步证明了我们筛选的高产菌株代谢途径未发生变化。

3结论

经过实验，我们主要得出以下结论：

(1)所获三株高产菌(3233#、3244#和3250#)的效价比出发菌株F21#分别提高了34%、44.9%和39%，为进一步工业生产奠定了基础。

(2)推理选育证明，合适的筛选剂(丁酸)和诱变剂在高产菌株选育中有着同等重要的作用。3233#、3244#和3250#三株高产菌株选育是诱变剂和筛选剂——丁酸协同作用的结果。

(3)对高产菌株发酵产物分析证明组分未发生变化，但产物的表达量有较大幅度的提高，菌株的生物代谢途径与出发菌株相同。

(4)本实验所用筛选剂丁酸为盐霉素生物合成的前体，其合适用量及恰当添加时间有待进

一步实验。

【参考文献】

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